超声处理辅助的晚期胚胎与幼虫免疫荧光染色 黑腹果蝇 组织 原位

摘要

免疫染色是一种用于可视化组织内特定细胞类型和蛋白质的有效技术。通过利用超声处理，本文所述的方案消除了在对晚期胚胎和幼虫进行免疫染色前解剖黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）组织的需要。我们提供了一种针对甲醛固定的整体幼虫进行免疫染色的高效方法。

摘要

在以下研究中进行的实验 黑腹果蝇 胚胎和幼虫为细胞命运决定及器官发生等发育过程提供了关键的研究视角。免疫染色技术可用于可视化正在发育的组织和器官。然而，胚胎发育末期形成的保护性角质层会阻碍抗体渗透至晚期胚胎和幼虫体内。尽管在免疫染色前进行解剖是常规用于分析 果蝇 幼虫组织，但对于某些分析而言效率较低，因为小型组织可能难以定位和分离。超声处理为幼虫组织的分离提供了一种替代解剖的方法。 果蝇 免疫染色实验方案。该方法可快速、同步处理大量晚期胚胎和幼虫，并保持 原位 形态学。样品经甲醛固定后进行超声处理，随后使用抗原特异性一抗和荧光标记的二抗进行免疫染色，以通过荧光显微镜观察目标细胞类型及特定蛋白质。在超声处理过程中，超声探头在样品上方的正确放置位置、超声时间及强度均至关重要。为获得高质量染色结果，可能需对标准免疫染色流程进行少量细微优化。对于信噪比较低的抗体，通常需要延长孵育时间。为验证该超声辅助免疫染色方法的可行性，我们展示了三种组织类型（睾丸、卵巢和神经组织）在多个发育阶段的免疫染色结果。

引言

Drosophila 胚胎和幼虫是研究多种器官和组织发育过程的优良模型。在这些研究中，常常需要对单个细胞进行成像，以确定细胞发育所处的复杂环境。通过免疫染色可实现对组织中细胞的可视化观察。目前已有完善的免疫染色方案用于卵孵化后17小时（AEL）以内的胚胎Drosophila组织<^1-3。然而，在胚胎发育末期会形成一层保护性角质层，阻碍抗体的有效渗透。因此，这些免疫染色方法在分析晚期胚胎以及后续幼虫发育阶段（1^龄（L1）、2^龄（L2）和3^龄（L3））的组织时效率低下。这种低效性限制了我们对这一较长发育时期内动态过程的理解⁴。组织解剖是一种广泛应用的技术，可用于克服这一障碍^5-7。然而，解剖操作本身也可能效率不高。由于难以定位或分离胚胎和幼虫组织，样本提取过程可能受阻。此外，目标组织的物理移除可能导致组织破裂，或无法完整取出，从而造成损伤。

超声处理是一种利用声波破坏分子间相互作用的方法。该方法已被用于破坏 果蝇 幼虫角质层以免疫标记发育中的神经细胞类型 ⁶该方案已针对晚期胚胎及幼虫性腺的免疫染色进行了优化，其直径可小至50μm ^8-10通过此类研究，已对晚期阶段雄性生殖系干细胞（GSC）生态位的形成过程进行了表征。 果蝇 胚胎....

方案

1. 收集笼的制备

1. 用 CO₂ 麻醉年轻且具有繁殖能力的果蝇，将麻醉后的果蝇转移至饲养笼中。为获得最佳产量，使用 100–120 只年龄在 2–7 天之间的成年果蝇，雌雄比例为 4:1。在取样固定前，让果蝇适应环境约 24 小时。若饲养笼中使用的是 virgin 雌蝇与雄蝇交配，则应采用 36–48 小时 的适应期。
2. 在饲养笼的开口端放置一个预先制备好的苹果汁琼脂平板，平板中央滴加一枚硬币大小的酵母糊，覆盖住笼口，然后用胶带固定。再用 Parafilm 密封苹果汁琼脂平板与饲养笼之间的接缝。
3. 将饲养笼置于一个以苹果汁琼脂平板为底的次级容器中，并根据实验需求在设定温度下让果蝇繁殖适当时间。
   注意：样品采集时间会有所不同。例如，当收集晚期胚胎/早期一龄幼虫（17–24 小时）时，先让果蝇在 25 °C 下于苹果汁琼脂平板上产卵 7 小时，随后在 25 °C 下继续培养样品 17 小时。类似地，若要收集中期至晚期一龄幼虫（36–48 小时），则先让果蝇在 25 °C 下产卵 12 小时，再于 25 °C 下培养 36 小时。
4. 当设定时间结束后，轻敲饲养笼使其果蝇脱离苹果汁琼脂平板（无需麻醉）。迅速将已使用的平板更换为含有酵母糊滴的新鲜平板，用胶带和 Parafilm 固定新平板，并将饲养笼以苹果汁琼脂平板为底存放。
5. 用金属刮刀小心地从已使用的平板上移除酵母滴。盖上已使用苹果汁琼脂平板的盖子....

结果

为了证明基于超声处理的免疫染色在分析晚期胚胎和幼虫组织中的有效性 原位，野生型胚胎和幼体被用于睾丸、卵巢及神经组织的免疫染色处理。样品通过共聚焦显微镜成像，展示代表性结果（图1 和 图2结果表明，所述方案可有效用于观察形态特征及单个细胞 原位 从晚期胚胎期到早期/中期L3阶段 果蝇 发育

睾丸免疫染色结果：
由于睾丸在幼虫发育过程中持续经历动态成熟过程，因此睾丸发育是展示实验方案有效性的理想体系。成年Drosophila的睾丸呈一端封闭的盘绕管状结构，其盲端位置存在生殖干细胞（GSC）微环境（参见文献^13,14综述）。在此微环境中，GSC围绕着一群紧密聚集的非增殖性体细胞——称为“hub”——呈放射状排列。GSC通过不对称分裂产生一个仍锚定于hub的子代GSC，以及一个远离干细胞微环境的子细胞——精原母细胞。随着精原母细胞进行不完全分裂，会形成称为“fusome”的胞质延伸结构，将.......

讨论

本方案提供了一种成功对靶标进行免疫染色的方法 果蝇 胚胎和幼虫组织 原位，从而无需进行解剖。根据以往对早期胚胎染色的方案^1,2,3, 使用50%次氯酸钠（NaOCl）去除绒毛膜。样品用甲醛和甲醇固定。由于幼虫角质层会导致较老的样品漂浮，因此将整个样品通过细胞筛以确保保留幼虫。如需保存，可将样品置于化学纯甲醇中。复水后，通过适当操作的超声处理破坏幼虫角质层的完整性。此步骤在角质层形成后至关重要，以允许免疫染色所需的抗体充分渗透。在加入抗体前，将样品在5%正常血清/BBTw溶液中振荡孵育，以防止非特异性抗体过度结合。随后加入一抗以检测目标组织中表达的特定蛋白。洗去未结合的一抗后，使用与荧光染料偶联的二抗标记结合了一抗的位置。最后可通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察分析。

在特定情况下，可能需要对实验条件进行一些调整以优化结果。特别是超声功率和超声次数可能需要根据所使用的超声仪型号进行调整。对于不同型号的超声仪，或当样品量不足时，可能还需要调整超声探头距离样品的高度以及溶液的体积。溶液浊度的增加可作为组织裂解的指标，因此可用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表1：试剂与缓冲液
磷酸盐缓冲液 Triton X-100（PBTx）			5 L：500 ml 10X PBS，4.45 L ddH₂O2O，50 ml Triton 10%。室温保存。
10倍磷酸盐缓冲液（PBS 10X）			对于1升去离子水2O：80 g NaCl，2 g KCl，14.4 g Na2HPO4，2.4 g KH2PO4加入组分并定容至适当体积。4 ℃保存 °C.
Triton 10%			50 ml 溶液：5 ml 吐温，5 ml 10X PBS，45 ml ddH₂O2O. 轻摇混匀。室温保存。
便携式排放测量系统			0.1 M Pipes（pH 6.9），2.0 mM MgSO₄4，1.0 mM EGTA。室温保存。
管道			配制400 ml 0.25 M溶液（pH 6.9）：30.24 g Pipes dH20 NaOH。将Pipes溶解于300 ml dH₂O中。2O，然后用 NaOH 调节 pH 至 6.9。用 dH₂O 定容至 400 ml。2O 并高压灭菌。室温保存。
甲醛			37% 甲醛（以重量计）的甲醇溶液。室温保存。甲醛、庚烷和甲醇的废液混合物须置于密闭容器中，存放于通风橱内，随后根据机构规定进行处理。
庚烷		CAS 142-82-5	正庚烷。室温保存。按照机构规定，将甲醛、庚烷和甲醇的废液混合物储存于密封容器中，并置于通风橱内，待处理。
甲醇		CAS 67-56-1	室温保存。根据机构规定，废弃的甲醛、庚烷和甲醇混合液须置于密闭容器中，并在通风橱内存放，待后续处理。
磷酸盐缓冲液Tween（PBTw）			配制1 L：100 ml 10X PBS，890 ml ddH₂O2O，10 ml 吐温10%。加入所有组分后过滤除菌，4℃保存。 °C.
Tween 10%			50 ml：5 ml Tween，5 ml 10X PBS，40 ml ddH₂O2O. 轻轻摇动混匀。室温保存。
牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲液吐温（BBTw）			配制1 L：100 ml PBS 10X，890 ml ddH₂O2O，10 ml 吐温10%，1 g 牛血清白蛋白（BSA）。先加入BSA，然后使用0.2 μm 真空滤器单元。4℃保存 °C.
正常山羊血清（NGS）	Jackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	配制10 ml：正常山羊血清 10 ml ddH₂O2O. 加入ddH₂O2O至NGS管，使用0.2 μm 注射器滤器。将等分试样储存在 -20 °C.
1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）		CAS：281-57-9	配制 100 ml：25 ml ddH₂O2O，1 ml Tris HCl（1M，pH 7.5），2.5 g DABCO 固体，3.5 ml 6N HCl，250 μl 10 N NaOH，70 ml 甘油。在250 ml烧杯中加入磁力搅拌子，加入ddH₂O2O、Tris HCl 和 DABCO。搅拌后加入 6N HCl、10 N NaOH 和甘油。然后逐滴加入 10N NaOH 至溶液 pH 达到 7.5。分装。将分装样品于 -20℃ 保存 °C.
DABCO + 对苯二胺（PPD）溶液			1.765 ml NaHCO₃3，0.353 Na2CO3，0.02 g PPD（CAS：106-50-3）。将PPD溶于NaHCO₃中3 和 NaCO3 溶液。加入60 μ500 微升 PPD 溶液 μDABCO 溶液。分装后于 -20 ℃ 保存 °C.
苹果汁平板			制备约200块培养板：45 g 琼脂（CAS#9002-18-0）、45 g 颗粒糖（市售）、500 ml 苹果汁（市售）、15 ml 10% Tegosept、1.5 ml ddH₂O2O. 向ddH₂O中加入琼脂2在4 L烧瓶中加入O，然后高压灭菌30分钟。在加热磁力搅拌器上混合苹果汁和蔗糖。将苹果汁混合物缓慢加入已高压灭菌的琼脂中。在加热磁力搅拌器上混合均匀后，分装至35 mm培养皿中，每皿10 ml，室温静置至凝固。4 ℃保存 °C.
Tegosept 10%			配制100 ml：10 g Tegosept，100 ml 乙醇。分装后于-20℃保存 °C.
酵母膏			约50 g干活性酵母。逐渐加入ddH₂O2将 O 加入含有酵母的烧杯中，边搅拌边混合，直至形成糊状。4 ℃ 保存 °C.
表2：染色材料
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000，储存液浓度为5 mg/ml。
兔抗 Vasa 抗体			1:250，由Ruth Lehmann惠赠。
小鼠抗Fasciclin III	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	7G10	1:10
小鼠抗-1B1	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	1B1	1:4
豚鼠抗 Traffic Jam 抗体			1:2500，由Dorthea Godt惠赠（Li 等，2003）。
小鼠抗Prospero	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
抗Elav大鼠单克隆抗体	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	7EBA10	1:30
小鼠抗Repo抗体	发育研究杂交瘤库 (DSHB)	8D12	1:10
山羊抗兔 Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
山羊抗小鼠Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
山羊抗豚鼠 Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
山羊抗大鼠 Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
表3：材料与设备
果蝇培养笼	手工制作；Genesee Scientific Corporation	不适用；瓶子：32-130；预制笼具：59-101	使用复合斜切锯（400 rpm）将透明浇铸亚克力管（直径1 3/4英寸）切割成4英寸高的管段制成。将超细不锈钢筛网用亚克力胶粘合至管的一端。另一种使用空果蝇食物瓶的方法见于 果蝇 实验方案 ISBN 0-87969-584-4。笼具也可从 Genesee Scientific Corporation 购买。
超声波破碎仪：Branson 250 Digital Sonifier	布拉索斯	型号：Branson Digital Sonifier 250
超声波破碎探头	布拉森	型号：102C（CE）	EDP：101-135-066；序列号：OBU06064658
注射器滤器	Nalgene	190-25-20	0.2 μm 纤维素，醋酸纤维素膜滤器
成像系统：配备多色光源、数字CCD相机和成像软件的转盘共聚焦显微镜	显微镜：Olympus，光源：Lumen Dynamics，相机：Q-Imaging，成像软件：Intelligent Imaging Inc.		显微镜：BX51 配备 DSU 转盘，光源：X-Cite 120Q，相机：RETIGA-SRV，成像软件：Slidebook 5.0
真空滤器装置	Nalgene	450-0020	0.2 μm 硝酸纤维素膜滤器