利用鹌鹑-鸭嵌合体评估物种特异性对颅面部发育的贡献

摘要

本文介绍了一种制备嵌合胚胎的方法 旨在检验神经嵴和/或其他组织在颅面部发育中物种特异性的贡献。

摘要

嵌合胚胎的制备是一种广泛应用且功能强大的方法，用于研究细胞命运、组织相互作用以及物种特异性对脊椎动物胚胎组织学和形态发育的贡献。特别是，嵌合胚胎的使用已证实神经嵴在调控颅面复合体物种特异性形态中的重要作用。本文所述方法利用两种具有显著不同颅面形态的鸟类——鸭和鹌鹑，极大地促进了对颅面复合体中物种特异性模式的分子与细胞调控机制的研究。 在鹌鹑-鸭嵌合胚胎中开展的实验已揭示了由神经嵴介导的组织相互作用以及调控颅面骨骼、肌肉和皮肤系统中物种特异性模式的细胞自主行为。鉴于神经嵴衍生物的高度多样性，鹌鹑-鸭嵌合系统在未来研究脊椎动物发育、疾病与进化方面具有重要意义和广阔应用前景。

引言

 面部骨骼由多个面部突起的生长与融合发育而成，这些突起由神经嵴和中胚层来源的间充质组成，外覆外胚层和内胚层上皮层^1-11。各突起内的形态发生事件受间充质与周围上皮层之间特定信号相互作用的调控^12-16。这些信号相互作用及其下游效应分子的改变可导致疾病表型，并可能与颅面骨骼的进化相关^17,18。因此，阐明组织相互作用的时间和性质，有望显著增进我们对面部骨骼发育生物学及进化生物学的理解。

利用嵌合胚胎研究组织相互作用在发育生物学中具有悠久的历史。这一方法由汉斯·施佩曼（Hans Spemann）及其研究团队首创，他们通过在不同两栖动物物种的胚胎之间移植组织，发现了胚胎“组织者”。施佩曼是显微外科技术的大师，其精湛的手工技能辅以其开发的专用工具，尤其是施佩曼移液管（Spemann pipette）。维克托·哈姆伯格（Viktor Hamburger）于20世纪20年代在弗莱堡的汉斯·施佩曼实验室攻读研究生，当时正是进行最初导致施佩曼获得诺贝尔奖的移植实验的时期。 1935年，哈姆伯格移居圣路易斯的华盛顿大学后，在其《实验胚胎学手册》（Manual of Experimental Embryology）中详细描述了制作施佩曼微移液管的过程¹⁹。 德鲁·诺登（Drew Noden）在华盛顿大学哈姆伯格实验室攻读研究生直至1972年。 在先后移居马萨诸塞大学阿默斯特分校和康奈尔大学后，诺登继续制造并使用施佩曼微移液管，用于涉及鹌鹑-鸡嵌合体的外科移植实验。 其中一位作者（里奇·施耐德，Rich Schneider）在研究生期间，于1995年至1998年在康奈尔大学跟随德鲁·诺登接受培训。 以下制作施佩曼微移液管的实验方案基于哈姆伯格和诺登所撰写的描述，并包含了施耐德后续所做的改进。

利用鹌鹑-鸡嵌合体研究颅面发育，特别是解析神经嵴细胞贡献的方法，由 Noden 和 Le Douarin 在20世纪70年代初首创，详见 Le Douarin 等人et al²⁰的综述。该方法已被众多研究和研究人员广泛采用^1,4,5,21-38。由于鹌鹑与鸡的生长速率和形态相似，二者之间的组织移植非常适合用于细胞命运和谱系追踪研究。然而，正因鹌鹑与鸡高度相似，由供体细胞诱导的形态变化难以分辨。相比之下，其他鸟类嵌合系统则引入了家鸭，以研究导致胚胎解剖结构差异的机制^39-50。 更具体而言，鹌鹑-鸭嵌合系统在解析供体对宿主的影响以及宿主对供体的反向影响方面具有多重优势。首先，鹌鹑与鸭胚胎在体型和形态上存在明显差异，这为通过检测基因表达差异区域来探究供体或宿主特异性的模式形成机制提供了直接手段（图1 A 和 B）。其次，鹌鹑与鸭胚胎的成熟速率显著不同，鹌鹑孵化周期为17天，而鸭为28天。移植的神经嵴细胞在其宿主环境中仍保持其固有的发育时程，因此可以识别基因表达、组织相互作用、组织发生及形态发生的时序性变化^51-57。最后，抗鹌鹑核抗体（Q¢PN）能够识别在鹌鹑细胞中普遍表达但在鸭细胞中缺失的蛋白质，从而永久性地区分供体与宿主的细胞来源。

方案

1. 准备钨针

1. 使用剪线钳将钨棒切成两半，以防止钨棒弯曲。
2. 将钨棒从5 3/4英寸 硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管的锥形端穿入。
3. 使钨棒约3/4英寸 部分从玻璃管中伸出，用少量“热熔胶”（HMA，即胶枪所用胶棒）将钨棒固定在移液管尖端。应迅速在酒精火焰中熔化热熔胶，注意避免胶体燃烧并产生黑烟。
4. 使用一对镊子，将钨棒顶端约1/4英寸 处弯曲，直至形成45°角。
5. 握住巴斯德移液管，将钨棒尖端约1/8英寸 部分置于丙烷喷灯火焰中。保持尖端稳定，并严格垂直于火焰。
6. 一旦有微小的橙色钨颗粒从针尖飞出，立即从火焰中取出针头。

2. 准备受精卵移植毛细管

1. 使用本生灯加热巴斯德移液管的细端，直至锥形末端稍后方的玻璃开始熔化。从火焰中移开后，拉伸管尖直至移液管完全封口。确保锥形部分仍保留一段外径约为0.7–1.0 mm的区域。从锥形处约4 cm位置将封口端折断取下。
2. 连接约2英尺 将一段（60 cm）橡胶管连接到移液管的宽端（开口端）。向橡胶管的另一端吹气，确保空气无法通过巴斯德移液管的锥形部分。
3. 使用带有铅笔火焰喷灯的丙烷气罐，加热移液管锥形起始位置下方一侧的椭圆形区域。通过橡胶管以轻微且持续的气压（约相当于正常说话时发出字母“P”起始音所需的气压）缓缓吹气。当玻璃一侧变软并开始向外凸起时，迅速将移液管移离火焰，并通过橡胶管用力而稳定地吹气。这将使受热部位的玻璃形成香肠状气泡，气泡可能破裂，属正常现象。若气泡过小，可再次加热并吹制玻璃。最终在玻璃上形成的开口窗口直径应约为0.25英寸 （6.35 mm）宽，0.5 英寸 （12.7 mm）长。
4. 将锥形端朝上，用移液管尖将气泡刮入玻璃废液容器中，同时轻轻通过管路吹气，以防止玻璃碎片进入移液管。
5. 使用丙烷火焰烧灼气泡的剩余边缘，并对开口窗的侧边进行火焰抛光。注意不要熔化移液管的管 shaft。
6. 使用金刚石尖铅笔，在移液管的锥形末端约1.25英寸处划痕 （30 mm）处，用镊子折断尖端，使移液管开口整齐切割（丢弃尖端破损或不平整的移液管）。
7. 使用镊子和酒精灯火焰的边缘，将移液管的细窄部分弯曲约0.375英寸 （9.5 mm）处弯曲成约60°角，使弯曲部分在窗口开口位于1:00位置（适用于右手操作）或11:00位置（适用于左手操作）时处于垂直平面内。此步骤最好在无气流干扰的环境中进行。
8. 在解剖显微镜下用酒精火焰将末端烧制成圆滑状。注意不要将末端完全封闭，应保持开口呈圆形且光滑，无任何狭窄。
9. 切取一段 1 在 （25 mm）长的橡胶管，用70%乙醇喷洒管段，然后将管子套在移液器杆上，直至窗口完全被覆盖。此部分作为斯佩曼移液器的“隔膜”。
10. 在移液管的敞口底部安装一个2 ml的乳胶橡胶吸头。该吸头可维持斯佩曼移液管内的负压。
11. 使用斯佩曼吸管在显微镜下将直径约为100–200 µm的层析珠从一个培养皿的标记位置转移至另一培养皿的标记位置，以练习操作技能。
12. 为了清洁斯佩曼吸管，取下橡胶吸头，将吸管尖端朝下放入一个高脚烧杯中，烧杯底部铺有棉花或纱布，并装有蒸馏水和玻璃器皿清洁剂。

3. 卵的灭菌与孵育

1. 用70%乙醇擦拭卵子，并将卵子放置在塑料卵盘上。
2. 将卵子置于37.5 °C、相对湿度85-87%的恒温培养箱中。
3. 孵育卵子至HH9.5期，鹌鹑约需26小时，鸭约需48小时。

4. 窗口蛋

1. 用镊子从鸡蛋顶部取下小块外壳，注意不要刺破内层壳膜。
2. 使用带有18 G、1英寸针头的注射器，在鸡蛋最尖的一端刺一个小孔，并抽出约1–2 ml的蛋清。
3. 在蛋壳的孔洞和穿刺痕迹上贴上透明胶带。
4. 使用弯头剪刀沿着鸡蛋顶部表面（透过透明胶带）剪出一个“窗口”。

5. 观察胚胎并进行手术准备

1. 用玻璃棒将少量中性红（0.02 g/ml，溶于Hank’s BSS）轻轻涂抹于胚胎表面。
2. 用火焰 sharpened 的钨针切开卵黄膜，并将其拉过胚胎表面。
3. 将透明胶带覆盖在窗口处，重新封闭鸡蛋。

6. 将供体组织从供体胚胎中分离

1. 移除供体胚胎卵膜窗口处的胶带。
2. 使用火焰 sharpened 的钨针（按上述方法制备）在神经管两侧制作切口，以将供体胚胎的神经褶从相邻的外胚层上切下。
3. 随后，在移植物所需的前部和后部位置横切神经管，并将移植物从神经管其余部分分离。
4. 使用斯佩曼移液管（Spemann pipette）或其他类型的微移液管，将神经褶从供体胚胎中取出。
5. 然后，移除宿主卵膜窗口处的胶带，并使用斯佩曼移液管将供体神经褶放置于宿主胚胎旁，紧邻将接受移植的神经管区域。

7. 分离宿主组织并移植供体组织

1. 将宿主胚胎的神经褶从神经管上分离，操作方式与供体相同。注意移除与供体组织大小相等的移植物。 
2. 轻柔地将此宿主组织推离胚胎远处。
3. 然后，使用钝头钨针或移液管的圆润尖端，轻柔地将供体神经褶移入宿主神经管内，保持正确的前后和背腹方向。确保移植物贴合于两侧，但务必避免刺破或损伤下方组织。 为便于追踪原始方向，可记录供体组织中的任何不对称结构或中性红染色的差异。我们还会在手术后立即对供体胚胎及其切除组织，以及嵌合胚胎进行拍照记录。
4. 若宿主胚胎出现干燥迹象，应向卵内添加无菌生理盐水。
5. 现在，仔细重新封合卵并做好标记，然后将其轻柔地放回高湿度培养箱（70–80%）中，使嵌合胚胎继续发育至所需分析阶段。

8. 嵌合体的收集

1. 务必在新配制的溶液中收集嵌合胚胎 冷Serra固定液，并立即于4 °C在摇床上进行过夜固定。这将有助于更好地实现固定效果。 利用抗鹌鹑抗体对鹌鹑细胞进行高灵敏度检测。
2. 进行RT-qPCR基因表达分析时，应在RNA提取前将胚胎直接置于液氮中冷冻。

结果

在进行进一步分析之前，需要检测移植的效率。对于组织样本的组织学、形态学或基因表达分析，应使用Q¢PN抗体通过免疫组织化学方法检测鹌鹑细胞，具体方法如文献³⁶所述。对于RNA分析，可采用基于PCR的策略计算不同物种对目标组织的贡献比例⁵⁸。在确认移植效果有效后，可在嵌合体中进一步评估其他形态学或分子水平的结果指标。供体神经嵴细胞与宿主来源的周围组织之间的相互作用，是颅面复合体正常组织发生和形态发生的基础，此前已有广泛研究。特别是，神经嵴间充质通过调控宿主基因表达，决定面部的物种特异性形态^7,13,51,59、羽毛排列模式⁵²、肌肉分布模式⁵⁶以及软骨结构^53,57。例如，神经嵴间充质通过时间上的调控Bmp4表达，决定下颌骨的成骨时机⁵⁵。

近期研究主要集中在颅面发育早期发生的组织相互作用。在这方面，利用鹌鹑-鸭嵌合体进行的实验表明，宿主胚胎通过决定形态学边界来影响神经嵴细胞的迁移。也就是说，在鹌鹑-鸭嵌合胚胎中，供体鹌鹑的神经嵴细胞以类似鸭子的模式迁移到宿主鸭的下颌弓中（图1D）。尽管宿主对神经嵴细胞群体的规模有一定影响，但供体神经嵴仍会形成在大小和形状上均类似鹌鹑的下颌骨骼（图1E）。

图1. 鹌鹑-鸭嵌合系统。（A） 鹌鹑与（B） 鸭的头骨在大小和形状上存在显著差异，因此非常适合利用嵌合系统研究颅面发育（修改自 Tokita et al.⁵⁶）。（C） 实验设计：通过发育阶段匹配的HH9.5期鹌鹑和鸭胚胎，生成单侧嵌合的鹌鹑-鸭胚胎。将鹌鹑胚胎一侧的神经褶切除，并移植到已切除相应部位神经褶的鸭胚胎中。（D） 可利用抗鹌鹑抗体（Q¢PN）追踪嵌合体中的鹌鹑供体细胞（绿色），图中显示的是HH12期嵌合胚胎的腹面观。（F） 在HH38期的鹌鹑-鸭下颌中，来源于鹌鹑供体的梅克尔软骨较短且更直，而对侧来源于鸭宿主的梅克尔软骨则更大且呈弯曲状。经Elsevier许可转载自Tokita et al., Dev. Bio.306, 377 (2007)。

讨论

神经嵴是一类短暂存在的胚胎细胞群体，可在胚胎内广泛迁移，并分化为多种细胞类型，包括软骨细胞和成骨细胞，这些细胞共同参与颅面骨骼的形成。利用鹌鹑-鸭嵌合系统进行神经嵴移植，极大地促进了我们对调控颅面骨骼发育的组织相互作用和信号通路的理解。然而，鉴于神经嵴还具有生成平滑肌细胞、脂肪细胞、黑色素细胞、施万细胞以及神经元的广泛潜能，鹌鹑-鸭嵌合系统在未来具有巨大的应用潜力，特别是在干细胞生物学和再生医学快速发展的背景下。由于鹌鹑和鸭均为商业化养殖的物种，来自多个农场的受精卵供应充足且相对便宜。因此，该技术适用于不同预算和实验空间条件下的研究人员。

尽管该技术非常强大，但仍存在一些局限性。与其他手术技术一样，鹌鹑-鸭嵌合体的质量和存活率依赖于研究人员的手术技能，因此与小鼠遗传学等其他模型相比，实验间的个体间和个体内变异更大。此外，各个胚胎的发育速度和发育阶段也存在差异，这会影响每次移植实验的可重复性和成功率。禽类胚胎还极易脱水，因此手术过程中的关键步骤包括保持低光照强度、尽量缩短显微镜下的操作时间、尽可能用胶带密封蛋壳，以及在术后培养箱中维持高湿度，以防止干燥脱水。 

就嵌合体的存活率而言，通常有50-75%能够存活，但随着采集阶段的发育年龄增加，存活率可能会下降。 在一次典型的4-6小时手术过程中，经验丰富的外科医生可制备10-15个嵌合体。 移植手术的成功在很大程度上还取决于工具的质量。优质的工具可带来更一致、可重复的结果。使用丙烷喷灯制作钨针，可制备出极为锋利的针具。 所用喷灯的类型至关重要，因为它决定了火焰的大小。也可采用电解 sharpening 方法，但该方法远不能制备出同等锋利的针具。 应使用钨棒而非成卷的钨丝，以确保针具的直线性。

斯佩曼微量移液器虽然制作耗时且困难，却是组织 转移的理想工具。 该移液器可定制不同尺寸的开口，并可重复使用。使用斯佩曼 微量移液器的关键因素是在接触胚胎表面之前，移液器内需预先保留少量液体。当移液器尖端接触到覆盖胚胎的弯月面时，部分液体会自然流出。 按压 隔膜可精确地将液体和移植物组织推出，而轻微放松隔膜则可轻柔地将供体移植物组织吸入移液器内。 在转移过程中保持隔膜上的轻微正压，可使供体移植物组织停留在移液器尖端，而稍增加隔膜压力则可将供体移植物组织精准地植入受体中。 

为在储存和灭菌期间保护斯佩曼吸管，请将球状 bulb 从宽端取下，并小心地将锥形尖端插入 bulb 内。 将斯佩曼吸管放入玻璃试管中，用铝箔封住管口，并在手术前进行高压灭菌。当多个吸管需再次灭菌用于手术时，将吸管倒置，在装有蒸馏水和玻璃器皿清洁剂的同一溶液中加热至接近 沸腾，然后用蒸馏水反复冲洗。将吸管各自放入试管中进行高压灭菌。 作为隔膜的橡胶管和橡胶 bulb 应在经过数次灭菌后，或当其变暗、变硬时予以更换。

本方案的许多步骤涉及危险设备。例如，制作斯佩曼微管（Spemann Micropipette）的过程包含三种类型的火焰操作，以及对玻璃进行加热、拉伸、吹气、弯曲、切割和抛光等操作。因此，佩戴适当的个人防护装备（PPE），如护目镜和实验服，对于提高安全性至关重要。此外，由于许多人已患有或可能发展出鸡蛋过敏，因此在处理鸡蛋时务必始终佩戴手套。考虑到这些预防措施，鹌鹑-鸭嵌合系统是一种安全、高效且相对易于实现的方法，具有广泛的应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS	TEK	TEKZR114
汉克’不含酚红的BSS	Invitrogen	14025-092
中性红	Sigma Aldrich	N4638-5G	0.22 µm 滤膜除菌
18 G 针头	BD	305195
5 ml 注射器	BD	309646
5号Dumont镊子	Fine Science Tools	11252-20
直剪刀	精细科学工具	14028-10
弯剪	Fine Science Tools	14029-10
斯佩曼吸管			手工实验室制备
卵母细胞固定器			玻璃烟灰缸和油泥
酒精灯	Fisher	04-245-1
透明胶带	3M 思高	600
玻璃搅拌棒	Fisher	11-380C	使用火焰将尖端拉细并熔成圆形
钨丝（0.004 英寸 × 3 英寸）	A-M Systems	7190	用丙烷火焰将尖端烧制成锥形
本生灯	Fisher Scientific	S49117
巴斯德吸管	Fisherbrand	22-183-632	9英寸（229 mm）
橡胶管	Fisher Scientific	14-178C	琥珀色，薄壁天然橡胶；壁厚：0.0625 英寸/1.6 毫米；外径：0.375 英寸/9.5 毫米；内径：0.25 英寸/6.4 毫米
丙烷燃料气瓶	BernzOmatic	UL2317	TX-9 配手枪式焊炬 "A" 带有螺纹旋紧式黄铜 "铅笔火焰" 火炬
金刚石笔	Fisher Scientific	22-268912
橡胶球	Fisherbrand	S32325