离体血液灌注肺制备方法使得肺表面微血管网络的可视化成为可能。本文介绍了一种利用实时荧光成像技术定量分析离体肺中单个微血管通透性的方法。
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本文内容
摘要
摘要
离体血液灌注肺组织制备方法被广泛用于在单个微血管水平上观察和定义信号传导过程。通过将此制备方法与实时成像技术相结合，可以实现对单个肺微血管通透性变化的测定。本文中，我们描述了分离大鼠肺脏并用自体血液进行灌注的操作步骤。随后，我们概述了通过微导管将荧光染料或试剂注入肺部小区域的操作流程。利用所述方法，我们测定了细菌脂多糖灌注后大鼠肺微血管通透性的增加情况。实验数据显示，脂多糖可导致小静脉和毛细血管段均出现液体渗漏增加。因此，该方法使得不同血管节段间的通透性反应比较成为可能，从而能够明确反应中的任何异质性。传统测定肺通透性的方法通常需要对肺组织样本进行后续处理，而本方法采用实时成像，避免了这一需求。因此，离体肺脏制备结合实时成像技术在测定肺微血管通透性方面较传统方法具有多项优势，同时仍是一种易于建立和实施的方法。
引言
肺部微血管通透性增加可导致肺泡水肿形成以及气体交换功能受损，这是急性肺损伤（ALI）的主要特征之一1-3。因此，血管通透性的评估对于判断肺损伤程度及潜在治疗干预措施的有效性具有重要意义。目前常用的通透性评估方法包括重量分析法，如无血肺湿干重比和微血管滤过系数测定4,5。其他方法还包括定量检测放射性或荧光探针在肺组织中的滞留量6-8。然而，上述方法均需在实验结束后对肺组织样本进行后续处理，以获取通透性数据。此外，由于每只实验动物仅能用于单一处理方案，因此完成一项完整研究可能需要大量动物。上述方法的一个共同特点是，它们均测定组织样本中所有血管的平均血管通透性。但已有充分证据表明，肺部微血管与大血管在表型上存在差异9，因此不同血管节段的通透性反应也可能具有异质性9,10。因此，仅通过测定肺组织样本中所有肺血管的平均通透性，可能无法充分反映这种异质性。
在离体血液灌注肺制备中，可通过直立显微镜观察肺表面的血管4,11,12。这使得能够表征单个血管的反应，从而研究反应中的任何异质性13。此外，通过利用微血管的荧光成像，可结合基于荧光的检测方法。进一步地，可使用左心房微导管将试剂和荧光探针递送至血管内11,14。微导管将递送范围限制在肺的较小区域，从而使仅该区域内的血管暴露于灌注的试剂和荧光染料。这允许在同一肺组织....
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方案
所有动物实验均经田纳西大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 大鼠肺组织灌注用导管
- 如图1所示，使用Tygon管路（#18）准备用于血液灌注的管路系统。连接压力传感器（P23XL），并将管路置于显微镜载物台上。
- 将水浴温度设置为37 °C。
- 暂时使用Tygon管路连接肺的入口和出口。
图1. 血液灌注管路。该示意图展示了用于在离体肺组织中循环血液的管路装置。图中还标示了管路所经过的相关组件。附带的心脏与肺部示意图用于显示管路与肺动脉（PA）及左心房（LA）插管（蓝色虚线）之间的连接位置。
2. 大鼠....
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结果
一个连接至灌流管路及相关设备的离体血液灌流肺装置如图所示 图2为演示目的，我们使用了一只Sprague Dawley大鼠，但本文所述方法适用于任何大鼠物种。通过左心房微导管输注仅能到达肺部的一小部分区域。输注区域可通过输注引起的变色来识别（图3）。用于实时成像的肺组织制备如图所示 图4.
图 2. 离体血液灌注肺制备。照片显示连接灌注管路并以自体血进行灌注的离体大鼠肺。请注意，肺的膈面朝向显微镜物镜。
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讨论
分离的血液灌注肺制备结合实时成像为测定单个肺微血管通透性变化提供了一种简便的工具。我们应用该方法定义了对LPS输注所引起的通透性变化。我们的数据明确表明，LPS输注导致微血管通透性增加。此外，数据还显示，LPS诱导的通透性变化在微静脉和毛细血管中相似。因此，该技术的一个主要优势在于能够定义单个微血管以及整个血管网络的渗漏情况。鉴于该技术还可获得整体通透性变化，因此可以将这些数值与使用其他常用方法（如重量分析法）所得结果进行比较。因此，本方法还允许将微血管液体渗漏信息与其他研究报道的结果进行对比。
与更常用的测定血管通透性变化的技术相比，基于实时成像的方法无需对肺组织样本进行后续处理。荧光染料滞留程度是在荧光染料输注及随后的冲洗过程中直接捕获的，这明显避免了组织样本的保存及其处理过程中可能引入的误差。除了通过通透性指数确定单个微血管的通透性外，该方法还可用于定义示踪剂荧光强度增加的幅度、示踪剂荧光变化速率的双相特性，以及冲洗过程中示踪剂荧光衰减的速率。这些额外的参数可用于比较不同处理措施的反应，以及如我们先前报告中所述14的微血管之间的节段差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为HL75503，资助对象为KP。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 泰龙管路 | Fisher Scientific | #18 | |
| 压力传感器 | Data Sciences International | P23XL | 需要数量 3 |
| 蝶形针 | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| 蠕动泵 | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 管路 | Becton Dickinson | 427421 | 需要 30 cm |
| PE-10 管路 | Becton Dickinson | 427401 | 需要 40 cm |
| 注射泵 | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O 型圈 | 定制，带直径 20 mm 的孔及手柄，用于将 O 型圈固定在支架上 | ||
| 直立式荧光显微镜 | Olympus America | BX61WI | |
| 图像采集软件 | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC 标记的 20KD 右旋糖酐 | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml（可根据预实验计算的通透性指数值，选择不同分子量的右旋糖酐） | |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | 血清型 0111:B4 |
参考文献
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., et al. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A.
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重印与许可
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