在离体血液灌注大鼠肺备量化单微血管通透性

Summary

孤立的血液灌注肺的准备，使可视化微血管网络上的肺表面是可行的。在这里，我们描述的方法用实时荧光成像量化单一微​​血管隔离肺的通透性。

Abstract

分离的血液灌注的肺制剂被广泛用于可视化和单微血管定义信令。通过实时成像耦合此制备中，以确定在单个肺微血管通透性的改变成为可能。在这里，我们描述的步骤来隔离大鼠肺组织，并与自体血灌注他们。然后，我们概述的步骤注入通过微导管荧光团或代理人到一个小细胞肺癌区域。使用上述这些程序，我们确定通透性增加大鼠肺微血管针对细菌脂多糖注射。数据显示，脂多糖通过这两个小静脉和毛细血管微血管段增加液体泄漏。因此，该方法使得有可能以比较的血管段中的渗透性的反应，因此，限定在响应中的任何不均匀性。而常用的方法来定义肺通透性要求肺组织样品，进行后处理的使用实时成像消除这一要求作为显而易见的，从目前的方法。因此，隔离肺制剂结合实时成像提供了一些优于传统方法来确定肺微血管的通透性，又是一个简单的方法来制定和实施。

Introduction

在肺微血管通透性增加导致肺泡水肿和损害气体交换的发展，是急性肺损伤^（ALI）1-3的一大特点。因此，血管通透性的估计是在确定肺损伤，并提出治疗措施疗效的程度很重要。重量分析诸如血液中的游离肺湿重与干重比和微血管过滤系数被广泛使用的方法来估算渗透性^4,5。其它方法包括定量肺组织^6-8中的放射性或荧光探针的保留。然而，上述方法需要肺组织样品的postexperiment加工朝向阐明的渗透率数据。此外，由于一动物只能用于单一治疗方案，大型动物数​​量，可能需要一个完整的研究。上述方法的一个共同特点是，它们确定平均血管通透性为所有的血管组织样本内。但是，它是公认的肺部微观和宏观血管表型不同^9。因此，渗透性反应可能是异构的各种血管段以及^9,10之间。因此，定量组织样本中的所有肺血管通透性均可能没有充分反映这种异质性。

在离体血液灌注肺标本，血管对肺表面可以通过一个堂堂正正的显微镜^4,11,12可视化。这使得在单个容器的反应特征，因此，解决在应对¹³任异质性。此外，通过利用微血管的荧光成像，基于荧光测定法可并入。进一步，左心房微导管可被用于运载剂和荧光探针进入血管^11,14。微导管限制了传递到小肺部区域，从而前冒充只有区域内的血管的灌注剂和荧光基团。这允许将用于单独的实验相同的肺中的多个小区域，导致所需的研究动物的....

Protocol

对动物进行的所有实验均批准的田纳西大学健康科学中心大学的机构动物护理和使用委员会。

1，油管灌注大鼠肺制剂

1. 准备一个管道系统用聚乙烯管（＃18），用于血液灌注， 如图1连接的压力传感器（P23XL），并放置在显微镜载物台上的管件。
2. 设定水浴温度为37°C。
3. 连接肺入口，并与聚乙烯管暂时出口。

图1。血液灌注管 。该图显示了用于通过隔离肺制剂血液循环管路的设置。也表明是相关联的组件，通过该管子我s路由。心脏和肺的示意图包括显示管和肺动脉（PA）之间的连接部位，和左心房（LA）套管（蓝色虚线）。

2，制备离体大鼠肺

1. 麻醉大鼠（雄性Sprague-Dawley大鼠; 250-300克）用氯胺酮（80〜100毫克/千克），并....

Results

分离的血液灌注肺制剂连接到灌注管道和相关设备示于图2。出于演示的目的，我们使用了一个只SD大鼠，虽然本文所描述的程序，可以用任何鼠种使用。通过左心房微导管输注到达肺的一小区域。该注入区域可通过输注引起的变色（ 图3）来识别。作为定位于实时成像的肺制剂示于图4。

图2的分离血液灌注肺制剂 。图为连接到灌注管和灌注自体血离体大鼠肺。需要注意的是肺的膈面朝向英里croscope目标。

Discussion

孤立的血液灌注肺标本加上实时成像提供了确定在单肺微血管通透性改变一个简单的工具。我们采用该方法来定义响应于LPS输注渗透性的变化。我们的数据清楚地表明，脂多糖注射引起的增加微血管通透性。此外，数据还表明，LPS诱导的通透性的改变是相似的在两个小静脉和毛细血管。因此，这种技术的主要优点是定义单个微血管的泄漏，以及一个全局血管网络的能力。鉴于这种技术也产生全球通透性的改变，有可能将这些值与使用其他常用的方法，如重分析得到的比较。因此，本发明的方法还允许对微血管流体泄漏的信息与在其他研究报告进行比较。

相比于更广泛使用的技术，以确定血管通透性的改变，实时基础的成像方法不需要后处理的肺组织样品。荧光团的保留程度是荧光团的输液和随后的冲刷中被俘。这显然​​消除了保留组织标本，并与他们处理相关的任何错误。除了经由通透性指数建立单独的微血管的渗透性，当前的方法也有利于限定的示踪荧光增加的幅度，示踪剂的荧光的变化的速率的两相性质，以及示踪荧光衰减过程中洗掉的速率。这些额外的参数可以用来反应比较不同的治疗方法，以及在微血管分部间的差异，在我们以前的报告¹⁴所述。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
压力传感器	Data Sciences International	P23XL	需要数量 3
蝶针	Greiner Bio-One	450081	21 G
蠕动泵	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90 管	Becton Dickinson	427421	需要 30 cm
PE-10 管	Becton Dickinson	427401	40 cm
注射泵	Braintree Scientific	BS8000
O 形圈			定制，带有 20 mm 直径的孔和一个用于将 O 形圈固定到支架上的手柄
正置荧光显微镜	Olympus America	BX61WI
图像采集软件	Molecular Devices	Metamorph
FITC 葡聚糖 20KD	Sigma Aldrich		0.5 mg/ml（可以选择不同分子大小的葡聚糖，如果试验实验根据计算出的渗透率指数值表明其适用性）
脂多糖	Sigma Aldrich		血清型 0111：B4