离体血液灌注肺制备方法使得肺表面微血管网络的可视化成为可能。本文介绍了一种利用实时荧光成像技术定量分析离体肺中单个微血管通透性的方法。
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本文内容
摘要
摘要
离体血液灌注肺组织制备方法被广泛用于在单个微血管水平上观察和定义信号传导过程。通过将此制备方法与实时成像技术相结合，可以实现对单个肺微血管通透性变化的测定。本文中，我们描述了分离大鼠肺脏并用自体血液进行灌注的操作步骤。随后，我们概述了通过微导管将荧光染料或试剂注入肺部小区域的操作流程。利用所述方法，我们测定了细菌脂多糖灌注后大鼠肺微血管通透性的增加情况。实验数据显示，脂多糖可导致小静脉和毛细血管段均出现液体渗漏增加。因此，该方法使得不同血管节段间的通透性反应比较成为可能，从而能够明确反应中的任何异质性。传统测定肺通透性的方法通常需要对肺组织样本进行后续处理，而本方法采用实时成像，避免了这一需求。因此，离体肺脏制备结合实时成像技术在测定肺微血管通透性方面较传统方法具有多项优势，同时仍是一种易于建立和实施的方法。
引言
肺部微血管通透性增加可导致肺泡水肿形成以及气体交换功能受损，这是急性肺损伤（ALI）的主要特征之一1-3。因此，血管通透性的评估对于判断肺损伤程度及潜在治疗干预措施的有效性具有重要意义。目前常用的通透性评估方法包括重量分析法，如无血肺湿干重比和微血管滤过系数测定4,5。其他方法还包括定量检测放射性或荧光探针在肺组织中的滞留量6-8。然而，上述方法均需在实验结束后对肺组织样本进行后续处理，以获取通透性数据。此外，由于每只实验动物仅能用于单一处理方案，因此完成一项完整研究可能需要大量动物。上述方法的一个共同特点是，它们均测定组织样本中所有血管的平均血管通透性。但已有充分证据表明，肺部微血管与大血管在表型上存在差异9，因此不同血管节段的通透性反应也可能具有异质性9,10。因此，仅通过测定肺组织样本中所有肺血管的平均通透性，可能无法充分反映这种异质性。
在离体血液灌注肺制备中，可通过直立显微镜观察肺表面的血管4,11,12。这使得能够表征单个血管的反应，从而研究反应中的任何异质性13。此外，通过利用微血管的荧光成像，可结合基于荧光的检测方法。进一步地，可使用左心房微导管将试剂和荧光探针递送至血管内11,14。微导管将递送范围限制在肺的较小区域，从而使仅该区域内的血管暴露于灌注的试剂和荧光染料。这允许在同一肺组织内对多个小区域进行独立实验，从而总体上减少研究所需的动物数量。
实时成像技术能够捕捉离体肺组织中单个微血管的血管内及血管外荧光的动态变化。因此，对于图像视野内的每一个微血管，均可记录并离线量化在荧光染料灌注及洗脱过程中荧光信号的变化14。通过分析血管荧光的最大值和残余值，可计算出成像视野内每个微血管的通透性指数。为了研究炎症或损伤因子引起的通透性变化，可先给予目标干预因子，再测定其通透性指数。此外，成像视野可设置在微导管灌注的肺组织区域内的任意位置，从而在选择目标血管网络时具有高度灵活性。因此，结合实时成像的离体血液灌注肺组织制备方法，为定量分析单个肺微血管通透性提供了一种理想的实验模型。
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方案
所有动物实验均经田纳西大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。
1. 大鼠肺组织灌注用导管
- 如图1所示，使用Tygon管路（#18）准备用于血液灌注的管路系统。连接压力传感器（P23XL），并将管路置于显微镜载物台上。
- 将水浴温度设置为37 °C。
- 暂时使用Tygon管路连接肺的入口和出口。
图1. 血液灌注管路。该示意图展示了用于在离体肺组织中循环血液的管路装置。图中还标示了管路所经过的相关组件。附带的心脏与肺部示意图用于显示管路与肺动脉（PA）及左心房（LA）插管（蓝色虚线）之间的连接位置。
2. 大鼠离体肺的制备
- 用氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）对大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠；250–300 g）进行麻醉。确认达到手术麻醉深度后，将动物置于仰卧位。
- 行气管切开术，插入气管插管（PE-90），并用外科缝线固定。
- 通过心脏穿刺（21 G 蝴蝶针）向心脏注入肝素（100–200 U），等待 60 秒后放血取全血（约 12–15 ml）。
- 准备两根导管（Tygon 管，直径 3 mm，长 4 cm，一端扩口），并用生理盐水充满。
- 行开胸术，在右心室做一 3 mm 切口，将一根导管的扩口端沿切口插入并导向肺动脉。用外科缝线将导管固定于肺动脉。
- 在左心室心尖处做一 3 mm 切口，将第二根导管的扩口端插入切口，并引导导管进入左心房。用脐带绑带（宽 2 mm）将导管固定于左心室。
- 剥离所有结缔组织，连同已固定的导管一起取出肺和心脏。将肺和心脏置于培养皿中，并调整肺的位置，使膈面朝上。三个导管应朝向同一方向。
- 将肺组织置于可在 X-Y 方向调节的载物台上。任何显微镜附带的载物台均可改装以固定导管，或根据需要制作专用载物台。
3. 大鼠离体肺的血液灌注
- 将放血获得的血液与等体积的白蛋白（5%）溶液混合后加入储液器中。启动蠕动泵，调节流速至14 ml/min，使血液充满管路。
- 打开分流管，移除临时使用的肺入口-出口连接器。将肺动脉插管和左心房插管分别连接至肺的入口和出口。确保管路中无气泡存在。
- 将气管插管连接至第三个压力传感器（P23XL）。通过气管插管以30%氧气充盈肺部，并维持压力在5 cm H2O。
- 使用夹子关闭分流管，开始肺灌注。维持肺动脉压和左心房压分别在约10和3 cm H2O。
4. 肺组织微血管灌注前准备
- 将导管延长管的后端抬高至高于肺部水平的位置，并固定。
- 准备灌注导管：将一段长约40 cm的PE10管约30 cm插入一段长约30 cm的PE90管中。将暴露的PE10管末端连接至固定在注射器（1 cc）上的针头（30 G）。
- 将导管组合体插入已抬高的延长管后端。引导导管组合体通过左心房进入肺部，直至遇到阻力。随后仅推进PE10导管进一步进入肺部，直至再次遇到阻力。注意：插入导管时施加过大的力量会损伤肺组织。
- 用林格氏液充满1 cc注射器，并将其连接至注射泵。设定灌注速率为10 µl/min。
- 灌注部位将变得较肺部其他区域更苍白。
- 用生理盐水润湿肺组织，并用带有足够大孔洞的塑料薄膜覆盖肺部，使灌注部位暴露在外。
- 在O型环（定制）底部涂抹少量旋塞润滑脂，将玻璃盖玻片（#1.5，直径22 mm）置于O型环底部。轻轻将带有盖玻片的O型环放置在灌注部位上，并用标准试管夹固定O型环。据近期报道，盖玻片/O型环组合不会扭曲其下方的肺泡结构15。
- 将荧光显微镜的物镜（20X）置于O型环上方，并对准肺表面进行聚焦。
5. 成像荧光葡聚糖通过微血管的转运过程
- 准备显微镜以进行FITC荧光成像。
- 选择待成像区域，并使用图像采集软件以每分钟1帧的速率采集图像。
- 开始通过注射泵输注FITC-葡聚糖20 kD（0.5 mg/ml）。血管内的荧光将逐渐增强并达到峰值。持续输注60分钟。
- 随后切换为林格氏液输注，以冲洗管腔内的荧光。维持灌注超过10分钟。在冲洗期间继续以每分钟1帧的速率采集图像。
6. 图像分析
- 打开图像采集文件。
- 在图像帧内的微血管上放置感兴趣区域。
- 逐帧播放图像文件，并记录每个感兴趣区域在所有帧中的荧光强度。
- 绘制每个感兴趣区域的荧光强度随时间的变化曲线。
- 量化最大荧光强度以及洗脱10分钟后残留的荧光强度。
- 计算每个感兴趣区域最大荧光强度与残留荧光强度的比值，得到与该感兴趣区域相关的微血管通透性指数。
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结果
一个连接至灌流管路及相关设备的离体血液灌流肺装置如图所示 图2为演示目的，我们使用了一只Sprague Dawley大鼠，但本文所述方法适用于任何大鼠物种。通过左心房微导管输注仅能到达肺部的一小部分区域。输注区域可通过输注引起的变色来识别（图3）。用于实时成像的肺组织制备如图所示 图4.
图 2. 离体血液灌注肺制备。照片显示连接灌注管路并以自体血进行灌注的离体大鼠肺。请注意，肺的膈面朝向显微镜物镜。
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讨论
分离的血液灌注肺制备结合实时成像为测定单个肺微血管通透性变化提供了一种简便的工具。我们应用该方法定义了对LPS输注所引起的通透性变化。我们的数据明确表明，LPS输注导致微血管通透性增加。此外，数据还显示，LPS诱导的通透性变化在微静脉和毛细血管中相似。因此，该技术的一个主要优势在于能够定义单个微血管以及整个血管网络的渗漏情况。鉴于该技术还可获得整体通透性变化，因此可以将这些数值与使用其他常用方法（如重量分析法）所得结果进行比较。因此，本方法还允许将微血管液体渗漏信息与其他研究报道的结果进行对比。
与更常用的测定血管通透性变化的技术相比，基于实时成像的方法无需对肺组织样本进行后续处理。荧光染料滞留程度是在荧光染料输注及随后的冲洗过程中直接捕获的，这明显避免了组织样本的保存及其处理过程中可能引入的误差。除了通过通透性指数确定单个微血管的通透性外，该方法还可用于定义示踪剂荧光强度增加的幅度、示踪剂荧光变化速率的双相特性，以及冲洗过程中示踪剂荧光衰减的速率。这些额外的参数可用于比较不同处理措施的反应，以及如我们先前报告中所述14的微血管之间的节段差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为HL75503，资助对象为KP。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 泰龙管路 | Fisher Scientific | #18 | |
| 压力传感器 | Data Sciences International | P23XL | 需要数量 3 |
| 蝶形针 | Greiner Bio-One | 450081 | 21 G |
| 蠕动泵 | Cole Parmer | Masterflex L/S | |
| PE-90 管路 | Becton Dickinson | 427421 | 需要 30 cm |
| PE-10 管路 | Becton Dickinson | 427401 | 需要 40 cm |
| 注射泵 | Braintree Scientific | BS8000 | |
| O 型圈 | 定制，带直径 20 mm 的孔及手柄，用于将 O 型圈固定在支架上 | ||
| 直立式荧光显微镜 | Olympus America | BX61WI | |
| 图像采集软件 | Molecular Devices | Metamorph | |
| FITC 标记的 20KD 右旋糖酐 | Sigma Aldrich | 0.5 mg/ml（可根据预实验计算的通透性指数值，选择不同分子量的右旋糖酐） | |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | 血清型 0111:B4 |
参考文献
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