通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化 双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

摘要

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。

摘要

人类巨噬细胞参与多种病理过程，从传染病到癌症均有涉及。因此，它们是研究这些疾病潜在机制的宝贵工具。本文介绍一种从血沉棕黄层中分离人类单核细胞并进行分化从而获得大量巨噬细胞的简便方案。该技术主要依赖常规实验室设备，因而是一种经济、高效获取大量人类巨噬细胞的方法。简言之，来自健康献血者的血沉棕黄层通过两次密度梯度离心法分离出外周血中的单核细胞。随后，这些单核细胞在氟化乙烯丙烯（FEP）特氟龙涂层细胞培养袋中，于巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）存在条件下进行培养。分化后的巨噬细胞易于收获，可用于后续研究和功能检测。本方案将重点介绍用于质量控制及验证分离与分化步骤的关键方法。总之，本文所述方案使科研人员能够常规、可重复地分离人类巨噬细胞，无需依赖昂贵设备。此外，该体系可在同基因型人类系统中研究疾病模型，避免使用小鼠巨噬细胞。

引言

单核细胞谱系的细胞及其终末分化的衍生物—— 巨噬细胞 ——在生物学功能上表现出显著的可塑性，使其参与发育、组织修复和免疫等多种生理过程¹。后者归因于巨噬细胞的吞噬作用和抗原呈递能力，使其处于先天免疫与适应性免疫应答的交汇点²。然而，它们分泌细胞因子、趋化因子、生长因子及其他信号分子的能力¹，不仅增强了其免疫调节功能，也为其他多种功能提供了基础。在非微生物介导的条件下，模拟这些多样化激活状态的努力催生了M1和M2分类体系³。尽管该分类体系并不完善，但仍为理解巨噬细胞生物学提供了基本框架。

由于巨噬细胞具有多种功能，因此毫不奇怪其与许多涉及组织重塑或炎症的疾病状态相关。除了在识别和清除入侵病原体方面发挥基本作用外^4-6，巨噬细胞在动脉粥样硬化、纤维化、肥胖和癌症中的作用也日益受到关注^7-10。因此，建立一种可重复的人源巨噬细胞生成方法，对于理解这些病理过程至关重要。本文介绍了一种基于从健康供者外周血中分离人单核细胞的方法，该方法采用先前描述的双密度梯度离心技术¹¹。为了促进单核细胞向巨噬细胞分化，将分离的单核细胞在低浓度M-CSF和正常人血清存在下进行培养¹²。为了便于后续操作和细胞收获，分化过程在具有疏水表面的气体可透过FEP特氟龙涂层细胞培养袋中进行^12-15。所获得的静息状态巨噬细胞仍具有响应M1或M2样刺激的能力，因此可用于多种功能检测。其他单核细胞分离及后续分化方法，如磁性激活细胞分选（MACS）或逆流离心淘析（CCE），在细胞得率、成本和所需时间方面存在一定局限性。本文所述方案的优势在于，仅需常规实验室设备，无需特殊试剂（例如，MACS磁珠）或专用仪器（例如，CCE装置），并可处理大量细胞。

方案

1. 无菌人AB型血清的制备

1. 采集4-5袋新鲜冰冻血浆（FFP）。将血浆袋储存于-20 °C，直至收集到足够数量。
2. 融化血浆袋，并在56 °C水浴中孵育30 分钟，以灭活补体并去除纤维蛋白。
3. 彻底消毒血浆袋外表面，将血浆转移至50 ml离心管中。
4. 在室温下以3,000 x g离心15 分钟，以去除沉淀物和残留血小板。
5. 合并所有上清液，弃去沉淀物。
6. 将血清样品分装至15 ml离心管中，于-20 °C保存。
   注意：也可使用市售的经热灭活的正常人AB型血清。

2. 单核细胞的分离

为便于离心机平衡，建议同时处理两份血沉棕黄层。但需注意为每位供体使用独立的材料，避免细胞混合。若无法方便获取血沉棕黄层，可改用400 ml肝素抗凝的外周血。

1. 仔细对含有血沉棕黄层的塑料袋进行消毒，并将每份血沉棕黄层的内容物转移至两个50 毫升离心管。
2. 每个血沉棕黄层填充三支50 15 毫升离心管 毫升 Ficoll 溶液（1.077 g/ml)。Ficoll 应在室温下放置，以备使用。
3. 第30-35层 将1毫升位于Ficoll溶液上方的血沉棕黄层血液小心地加至第一层密度梯度上。操作时应缓慢且谨慎，以避免两层液体混合。
4. 400离心 x 30 g 无刹车离心 30 室温下孵育最小时间。
5. 使用塑料巴斯德吸管收集每层梯度中位于两相之间的外周血单个核细胞（PBMCs）白色环状层，并转移至50 毫升离心管
6. 用 PBS-EDTA（1 mM）将每支试管补至 40 总共 ml。
7. 300 × g 离心 x g，离心10分钟 室温下离心，不刹车。
8. 吸弃上清液，再用 40 毫升 PBS-EDTA（1 mM）
9. 对于每个供体样本池，将20个沉淀 ml RPMI-1640 不含酚红 + 10% FCS
10. 制备第二次密度梯度所需的等渗Percoll溶液：对于两位供体，混合23.13 毫升 Percoll 溶液（密度：1.131 克/毫升）置于 50 1.87 ml 离心管 毫升10倍浓度PBS。然后转移23 将该溶液的 ml 加入新的 50 毫升离心管并加入27 ml RPMI-1640（含酚红）+ 10% FCS，制备成46%等渗Percoll溶液。Percoll在配制前应置于室温。
11. 每位供体转移 25 将制备好的 Percoll 溶液 50 ml 加入到 50 ml离心管中，将2.9步骤制备的PBMC溶液小心地缓慢加在Percoll溶液上层。操作时需格外缓慢轻柔，因两层液体容易混合。若操作正确，可观察到两相因颜色不同而清晰分层。
12. 550离心 x g 离心 30 分钟，不使用刹车 室温下孵育最小时间。
13. 使用塑料巴斯德吸管，从每个梯度中收集位于两相之间的白色单核细胞环，并转移至 50 毫升离心管
14. 用 PBS-EDTA（1 毫摩尔（mM）至50 总共 ml。
15. 在400 × g下离心 x 10 分钟，1000 × g 离心 室温下无制动离心 min。
16. 吸弃上清液，并将沉淀重悬于 20 含酚红的 RPMI-1640 培养基，10% FCS

3. 单核细胞向巨噬细胞的分化

1. 用台盼蓝1:10稀释后计数分离的单核细胞数量。仅计数体积较大、常呈不规则形状的单核细胞，不要计数体积较小、呈圆形的淋巴细胞。
   注意：单核细胞数量无需过于精确地测定，因为该数值仅用于大致判断细胞分化过程中所需FEP特氟龙涂层袋（小号或大号）的数量和规格。
2. 对于 1.0-1.5 × 10⁸ 来自一位供体的单核细胞，在一个大型FEP特氟龙涂层细胞培养袋中接种细胞。每个培养袋准备由174组成的培养基 毫升 RPMI-1640，2% 人 AB 血清（按第 1 节制备），1% 青霉素/链霉素，以及 2.5 ng/ml M-CSF（总体积：180） 毫升
   1. 对于 3.0-5.0 x 10⁷ 来自一位供体的单核细胞，在小型特氟龙涂层细胞培养袋中接种细胞。每个培养袋准备由28.5组成的培养基 毫升 RPMI-1640，2% 人 AB 血清（按第 1 节制备），1% 青霉素/链霉素，以及 2.5 ng/ml M-CSF（总体积：30） 毫升）。
      注意：如果 例如，8.0 × 10⁷ 单核细胞获取后，我们建议将其接种至两个较小体积的袋中，每袋含4.0 x 10⁷ 细胞。单核细胞也可选择使用相同浓度（2.5）的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）替代M-CSF进行分化 ng/ml
3. 将细胞悬液（20 ml）加入已准备好的培养基中，轻轻混匀。若由一位供体制备两个袋装样本，则加入20 加入 ml RPMI-1640 至细胞悬液中，然后将一半的悬液加入每种培养基制备物中。
4. 可选：为确定单核细胞制备物是否保持无菌，取一滴细胞悬液涂布于血琼脂平板，37 °C 过夜培养。
5. 收紧50的鞘 将装有制备好细胞悬液的 ml 注射器连接至 FEP 聚四氟乙烯涂层细胞培养袋的塞子上，并注入细胞悬液。
6. 拔下注射器，将袋中剩余空气排出。使用封口锥封闭袋子。
7. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育袋子6-7天₂.

4. 巨噬细胞收获

1. 将带有已分化巨噬细胞的FEP特氟龙涂层细胞培养袋置于冰上至少1分钟 hr 以促进细胞脱落（孵育时间最长可达 3 确保冰块覆盖袋子的整个表面（尽可能做到）。
2. 用最小的压力拉动袋子10次 桌子/板的边缘
3. 仔细消毒袋子外部，并取下封闭锥。
4. 拧紧一个50 将注射器插在袋塞上，取出细胞悬液，并转移至50 毫升离心管
5. 400离心 x g，持续10分钟 室温下离心以沉淀细胞。
6. 吸弃上清液，将一个血袋中的沉淀物汇集于10 毫升 RPMI-1640 + 10% FCS 总量。
7. 使用血细胞计数板测定细胞数量（台盼蓝稀释1:4至1:10）。仅计数大型圆形细胞。
   注意：在FEP特氟龙涂层袋中完成巨噬细胞分化后，可能会有残留细胞 例如，淋巴细胞，具体取决于供体以及单核细胞分离的质量。
8. 为重复使用FEP特氟龙涂层袋，先用70%乙醇清洗两次以去除残留细胞。然后向袋中加入50 加入70%乙醇，孵育过夜。用无菌PBS洗涤3次，用灭菌纸包裹，并按照标准程序在高压灭菌器中灭菌。
   注意：细胞培养袋可重复使用多次，且不会影响巨噬细胞的收获量。然而，我们在使用10次后选择弃用培养袋，以避免其开始出现老化或性能下降的情况 泄漏
9. 在后续实验中，使用 RPMI-1640 + 10% FCS 培养巨噬细胞。若需要较低的血清浓度，也可在含 1% FCS 的 RPMI-1640 中进行培养。将细胞接种后孵育 3–4 小时。在此期间，注意巨噬细胞会贴附于细胞培养皿表面，而任何污染细胞（即 红细胞、淋巴细胞和树突状细胞保持悬浮状态。用 PBS 至少洗涤细胞两次，以去除非贴壁细胞。
10. 为将培养的巨噬细胞从细胞培养皿上分离以进行后续实验，可小心地用刮棒将其从表面刮下。或者，将培养皿在37°C孵育20分钟 冰上孵育，吸除培养基，加入1 毫升无酶细胞解离缓冲液。5分钟后 37 °C孵育至少1分钟，加入4 毫升 PBS，通过上下吹打至少 3 次以解离细胞 最小

结果

首次使用Ficoll进行密度梯度离心可获得含有外周血单个核细胞（PBMCs）的白色中间层（图1A），即淋巴细胞和单核细胞。可通过收集的细胞经May-Gruenwald染色加以确认（图1B 和 图1C），染色结果显示细胞具有高核质比（典型淋巴细胞特征）以及豆状或环状细胞核（典型单核细胞特征）。当这些细胞进一步在Percoll密度梯度上进行第二次离心时，单核细胞可与淋巴细胞进一步分离，并再次呈现为白色中间层（图1D-F）。每次从一份血沉棕黄层样本出发，通过上述双密度梯度离心法通常可获得（150 ± 40）× 10⁶ 个单核细胞，并可进一步分化为（70 ± 30）× 10⁶ 个巨噬细胞（图2）每份血沉棕黄层。在20次独立实验中，巨噬细胞的平均得率为所分离单核细胞总数的47 ± 14%。

Percoll 梯度离心后，制备物中可能仍残留少量非单核细胞，这取决于献血者个体差异以及分离操作的准确性。然而，在经过 6–7 天的分化阶段后，制备物主要由成熟的巨噬细胞（图 3）构成，这些细胞可通过其对塑料表面的黏附特性进一步富集，而随机污染的其他细胞不具备这一特性（图 4A 和 B）。接种培养后，大多数巨噬细胞呈现典型的“煎蛋样”形态，同时也存在部分呈拉长梭形表型的细胞（图 4C 和 D）。这种形态差异在细胞质内 F-actin 的分布和黏附簇的形成中得以体现。分化后的细胞表达 CD45、CD14、CD16、CD206（甘露糖受体）、CD11b 和 CD11c，这些是成熟巨噬细胞的典型标志物（图 5）。CD11b 的表达提示细胞并非主要向树突状细胞分化，这一结论也得到以下事实的支持：这些细胞不表达树突状细胞标志物 CD209（DC-SIGN）。

分化过程结束后，细胞的功能和代谢活性可维持约5-7天（图 6）可通过钙黄绿素 AM 染色进行观察，并可摄取肿瘤细胞释放的细胞外囊泡。此外，这些细胞仍具有被激活的能力，如所示 例如，用于脂多糖（LPS）刺激，可诱导多种促炎基因的表达（图 7).

图1. 双密度梯度离心后PBMC层和单核细胞层的外观与组成。 照片展示（AFicoll 密度梯度离心后获得的 PBMC 层以及（D) 等渗Percoll离心后的单核细胞阶段。对细胞涂片制备物进行May-Gruenwald染色的(B, C) PBMC 组分和剩余的 (E, F) 单核细胞。B和E中的比例尺 = 200 µm，C和F中的比例尺 = 50 µm。

图 2. 单核细胞与巨噬细胞的得率。 20 份血沉棕黄层制备物中分离得到的单核细胞和巨噬细胞的代表性细胞计数结果。

图 3. 单核细胞与巨噬细胞的显微图像及细胞大小测量。 单核细胞悬液在巨噬细胞分化前（A）和分化后（B）的相差显微图像。单核细胞（C）和巨噬细胞（D）对应的细胞大小直方图。比例尺 = 100 µm。

图 4. 黏附巨噬细胞的形态学与细胞骨架结构。 黏附巨噬细胞在去除非黏附细胞前（A）和去除后（B）的相差显微镜图像。（C、D）未刺激的黏附巨噬细胞中丝状肌动蛋白的鬼笔环肽-TRITC染色。A-C图中比例尺 = 100 µm，D图中比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

图 5. 分化巨噬细胞的免疫表型分析。 在 FEP 铁氟龙涂层细胞培养袋中分化 6 天后的巨噬细胞流式细胞术分析结果（红色曲线所示）。相应的同型对照以灰色显示。请点击此处查看该图的高清版本。

图6. 巨噬细胞对肿瘤细胞微囊泡的摄取。巨噬细胞在暴露于PKH26标记（红色荧光）的肿瘤细胞来源微囊泡后，其贴壁状态的显微图像。图像与相应的（A）明场或（B）细胞质染色图像叠加，其中细胞活力染料为Calcein AM。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 7. 巨噬细胞经 LPS（100 ng/ml）刺激 24 小时后，IL-1β、Wnt5a、TNFα、IL-6、MMP-2、MMP-7 和 MT1-MMP 的表达上调。 基因表达通过定量 RT-PCR 检测总 RNA 样本（A），并以 HPRT1 和 GNB2L1 的表达作为归一化对照。图中显示的数值为与未处理对照组相比的倍数变化（均值 ± 标准差，n=5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。LPS 刺激下 TNFα 和 IL-6 的诱导进一步通过 ELISA 验证（B）（均值 ± 标准差，*p<0.05）。

讨论

巨噬细胞是先天免疫系统的重要效应细胞，在免疫调节、抗原呈递和组织稳态中发挥关键功能。由于其显著的可塑性，巨噬细胞能够响应不同刺激而发生表型改变。然而，目前关于巨噬细胞极化的大量数据主要来源于小鼠系统，尽管已有研究表明，仅有约50%的巨噬细胞极化标志物可从小鼠直接外推至人类¹⁶。因此，本文介绍一种无需昂贵材料 e.g.，MACS磁珠或逆流离心淘析装置，即可获得足够数量和高纯度原代人巨噬细胞的方法。

本方法基于从外周血单个核细胞（PBMC）中分离单核细胞，并在含低浓度 M-CSF^11-13的条件下，利用 FEP 聚四氟乙烯（Teflon）涂层细胞培养袋将其进一步分化为巨噬细胞。在人体中，单核细胞仅占外周血白细胞的 5% 至 10% 以下，但在受到刺激后，它们会被募集至外周组织，并分化为定居的组织巨噬细胞或树突状细胞¹⁷。细胞因子 M-CSF 对单核细胞的存活至关重要，并可促进其向巨噬细胞分化^18,19。迄今为止，用于单核细胞分化的 M-CSF 浓度最高达 100 ng/ml；而在本方案中，仅使用 2.5 ng/ml 的 M-CSF 浓度即可获得足够数量的成熟巨噬细胞^12,20。此外，细胞培养在 FEP 聚四氟乙烯涂层的细胞培养袋中进行，有利于巨噬细胞的脱落及其后续以确定的细胞数量进行接种。由于这些培养袋可多次重复使用，进一步降低了分离过程的成本。

通过该方法获得的巨噬细胞对 CD45、CD14、CD11b、CD11c 高度表达阳性，并表达甘露糖受体 CD206，表明其为一群纯度高且成熟的巨噬细胞^21,22。尤其是高水平的 CD14 表达，是存在于 M-CSF 条件下分化的巨噬细胞的典型特征²³。细胞接种后，迅速贴附于塑料表面，部分细胞呈现典型的梭形形态，而另一些则表现出“煎蛋样”表型。这与其他研究者的观察结果一致^18,22,24。

据报道，在M-CSF存在的情况下，单核细胞分化会形成M2极化巨噬细胞^16,25。然而，通过本方案分离获得的巨噬细胞仍能够对多种刺激产生响应，包括暴露于肿瘤细胞来源的微囊泡、与肿瘤细胞共培养^26,27，或暴露于LPS，后者可诱导其表达IL-1β、TNFα、Wnt5a或多种基质金属蛋白酶等促炎基因，这些基因通常被认为是M1极化巨噬细胞的典型特征^3,5,28。

综上所述，通过双密度梯度离心法分离单核细胞，并在FEP特氟龙涂层细胞培养袋中进一步将其分化为巨噬细胞，可获得大量巨噬细胞，且无需采用技术难度高或成本昂贵的操作步骤。所获得的巨噬细胞可用于后续多种分析，包括通过LPS进行经典活化，以及与肿瘤细胞共培养等实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于免疫表型分析的抗体	Beckman Coulter		例如：CD11c-PE (IM1760)、CD45-FITC (7782)、IgG1-PE 同型对照 (A07796)、IgG1-FITC 同型对照 (A07795)
	BioLegends		例如：CD14-FITC (325603)、CD206-PE (321105)
Axiovert 200M 显微镜	Zeiss
Calcein AM	AnaSpec	89201
Combi-stopper 封闭锥	Braun	4495101
1× PBS，不含 Ca 和 Mg	Pan biotech	P04-36500	配制 PBS-EDTA（1 mM）时，每 500 ml PBS 中加入 1 ml 0.5 M EDTA
10× PBS，不含 Ca 和 Mg	Invitrogen	14200-067
EDTA（Titriplex III）	Merck	1084211000	用 H2O 配制成 0.5 M 溶液，使用无菌滤器过滤
细胞解离缓冲液（无酶，基于 PBS）	Gibco	13151-014
胎牛血清（FCS）	Invitrogen	10091148	经热灭活处理
Ficoll（密度 1.077 g/ml）	Biochrom AG	L6115
FACSCanto II	BD Biosciences
山羊抗小鼠 FITC	santa cruz	sc-2010
来自 E.coli 的 LPS	Sigma	L8274	终浓度：100 ng/ml
Multifuge 3 L-R	Heraeus
青霉素/链霉素	Biochrom AG	A2213
Percoll（密度 1.131 g/ml）	GE Healthcare	17-0891-02
50 ml Perfusor 注射器	Braun	8728844F
Phalloidin-TRITC	Sigma	P1951	用甲醇溶解（c = 0.1 mg/ml）
[header]
一次性塑料巴斯德吸管	LVL technologies	2655181
rh M-CSF	ImmunoTools	11343117	用 500 µl 无菌 H2O 溶解（c = 100 ng/µl），分装保存
RPMI-1640 含酚红	Gibco	21875-034
RPMI-1640 不含酚红	Gibco	11835-063
灭菌纸	VP group	3KFKFS230116
台盼蓝染液（0.4% w/v）	Sigma	T8154
小号 FEP 聚四氟乙烯涂层细胞培养袋	CellGenix	72-C
大号 FEP 聚四氟乙烯涂层细胞培养袋	CellGenix	197-C