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方法文章

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

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DOI：

10.3791/51559

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2014年4月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Center, University of Helsinki

本文内容

摘要

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内 本方案中展示了大脑的双光子成像。

摘要

尽管急性脑损伤常由各类事故中的头部创伤引起，并影响着大量人群，但目前尚无有效的治疗方法。现有动物模型的局限性阻碍了对病理机制的理解。多光子显微技术能够在生理和病理条件下，对完整动物脑内的细胞和组织进行纵向观察。本文中，我们描述了两种通过双光子成像技术研究脑细胞在创伤后行为的急性脑损伤模型。通过使用锐利的针头对选定脑区进行穿刺，可在脑实质内制造出宽度和深度可控的损伤。本方法采用立体定位注射针头穿刺，可同时结合药物干预。我们提出，该方法可作为研究哺乳动物脑急性创伤后病理生理学后果的细胞机制的先进工具。 体内在本视频中，我们将急性脑损伤与两种制备方法相结合：颅窗法和颅骨磨薄法。我们还讨论了这两种制备方法在创伤后脑再生多时段成像中的优势与局限性。

引言

急性脑损伤是一个重大的公共卫生问题，在机动车事故、跌倒或袭击中发生率较高，并且常导致慢性残疾，患病率也较高。目前针对脑损伤的治疗方法仍完全局限于对症治疗，因此限制了院前急救、外科手术和重症监护的疗效。这使得脑损伤的社会和经济影响尤为严重。由于多种原因，大多数临床试验未能证明采用新型治疗方法可在脑损伤后改善恢复情况。

动物模型对于开发新的治疗策略至关重要，可推动研究进入能够预测脑损伤患者药物疗效的阶段。目前已有多种成熟的头部创伤动物模型，包括控制性皮质冲击1、液体 percussion 损伤2、动态皮质形变3、落锤撞击4和光损伤5。许多实验模型已被用于研究与头部创伤相关病理的某些形态学、分子和行为学特征。然而，尚无单一动物模型能完全成功地验证新的治疗策略。为了评估复杂的病理过程，建立可靠、可重复且可控的脑损伤动物模型十分必要。

最新显微成像技术与基因编码荧光报告分子的创新结合，为研究脑损伤的各个阶段——包括原发性损伤、原发性损伤的扩散、继发性损伤以及再生过程——提供了前所未有的机遇。特别是 体内 双光子显微镜是一种独特的非线性光学技术，可实现对啮齿类动物脑皮层深层中细胞甚至亚细胞结构的实时可视化。通过结合不同的荧光标记物，可同时对多种类型的细胞和细胞器进行成像。利用这一强大工具，我们能够在创伤后条件下观察活体大脑中动态的形态与功能变化。其优势在于 体内 Kirov 及其同事最近展示了双光子显微镜在研究脑损伤中的应用6采用轻度局灶性皮层挫伤模型，这些作者表明，挫伤周围皮层的急性树突损伤受局部血流下降的调控。此外，他们证明挫伤部位周围代谢功能受损的皮层会因扩散性去极化而进一步受损。这种继发性损伤影响突触环路，使创伤性脑损伤的后果更加严重。

本文提出一种采用注射器针头进行立体定位穿刺并可同时进行局部药物应用的方法，该方法可作为哺乳动物脑部急性创伤的病理生理学研究的先进局部脑损伤模型及研究工具。 体内.

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方案

所有操作均根据当地动物护理指南（《芬兰动物实验法》62/2006）进行。动物实验许可（ESAVI/2857/04.10.03/2012）由当地主管部门（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）颁发。成年小鼠年龄为1–3个月，体重24–38 g，在大学认证的动物饲养设施中单笼饲养，并提供食物和饮水 广告 随意.

1. 通过颅窗进行脑损伤成像

  1. 麻醉动物并准备手术区域
    1. 通过腹腔注射氯胺酮（Ketalar，80 mg/kg）和赛拉嗪（Rompun，10 mg/kg）的混合物（溶于经滤膜灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）对小鼠进行麻醉。定期检查小鼠的反射（尾部和脚趾夹捏测试），以确认麻醉深度。必要时增加剂量，以维持适当的麻醉状态，但避免过量。
    2. 在手术、成像过程以及麻醉后恢复的首小时内，使用加热垫将动物体温维持在37.0 °C。
    3. 为防止小鼠眼睛干燥，涂抹眼用润滑剂。
    4. 通过皮下注射给予地塞米松（Rapidexon vet，2 mg/kg），以减轻炎症和脑水肿。
    5. 在手术前最多30分钟或手术后立即给予镇痛剂（例如，腹腔注射酮洛芬）。若动物术后出现任何疼痛症状，如不愿活动、进食或饮水、体重减轻、流涎、竖毛或异常呼吸音，应重复注射镇痛剂。
    6. 使用剃毛机（见材料与设备）剃除小鼠头部毛发。注意避免损伤胡须。
    7. 用70%乙醇溶液处理小鼠头部皮肤，清洁剃毛区域。
    8. 使用手术剪刀（见材料与设备）和镊子（见材料与设备），沿耳间中线至前额方向剪开皮肤。
    9. 用钝头显微外科刀片轻轻刮除附着在颅骨上的结缔组织。
    10. 将皮肤边缘向两侧推开，并将耳杆轻微插入颅骨的耳道，以固定头部和皮肤。
    11. 用无菌PBS清洗颅骨，并用0.5%氯己定葡萄糖酸盐处理小鼠头部手术区域，然后使用无菌棉签和压缩空气组合干燥颅骨表面。
  2. 制造穿刺损伤
    1. 放置小型动物立体定位仪并安装动物固定装置（见材料与设备）。
    2. 调整双目显微镜的位置，使其位于立体定位仪旁，聚焦于动物颅骨表面。
    3. 在双目显微镜下定位颅骨上的前囟点。
    4. 利用立体定位坐标确定感兴趣区域。
      注意：避免直接位于浅表皮层血管上方的兴趣区域。这些血管的破坏会显著影响创伤进展。
    5. 将30 G针头置于选定区域上方，并通过划伤颅骨表面标记目标位点。
    6. 在显微镜下使用高速外科钻头（见材料与设备）钻孔，尽可能小心操作，避免损伤区域骨面不必要的扩大。若钻孔区域出现液体，应立即停止钻孔。
    7. 用针头轻触钻孔底部。
    8. 将针头平稳插入脑组织（插入速度为5-10 mm/min），根据穿刺位点的坐标，插入深度为0.5-2.0 mm。
    9. 达到预定深度后立即拔出针头（回撤速度为5-10 mm/min），并用小棉签擦拭穿刺后出现的血液（见材料与设备）。
    10. 使用微注射泵（WPI）和装配玻璃毛细管的10 µl Hamilton注射器，在损伤部位微注射100 µM Sulforhodamine 101或其他感兴趣化合物。
      注意：制备玻璃毛细管时，使用硼硅酸盐玻璃毛细管，将尖端拉至直径10-20 µm。
    11. 以2-5 nl/sec的速度注入250-1,500 nl注射液。
      注意：注射结束后，将毛细管保留在脑实质中至少5分钟，然后缓慢轻柔地拔出，以防止溶液外流。
  3. 慢性颅窗开颅术
    1. 轻柔小心地钻开颅骨，在损伤部位周围制作一个圆形窗口。窗口直径为3-3.5 mm。
    2. 滴加一滴皮层缓冲液（125 mM NaCl，5 mM KCl，10 mM葡萄糖，10 mM HEPES，2 mM CaCl2 和 2 mM MgSO4，溶于蒸馏H2O）覆盖窗口。
    3. 将圆形玻璃盖玻片（#1.5厚度）放置在颅窗上。
    4. 清除盖玻片周围的多余皮层缓冲液。
    5. 用聚丙烯酸胶（见材料与设备）密封盖玻片边缘。
      注意：确保胶水未涂抹到盖玻片的上表面。若盖玻片表面被胶水污染，需等待盖玻片稳定粘附于颅骨且表面胶水干燥后，再用显微刀片小心去除污染的胶水。
    6. 等待5分钟，使胶水完全干燥。
    7. 使用耳杆高度调节螺丝，调整头部位置，以便放置金属固定环。
    8. 在钢制固定环的环形部分（见材料与设备）涂抹少量聚丙烯酸胶。
    9. 将钢制固定环的环粘附在玻璃盖玻片上，金属手柄朝后。
    10. 等待5分钟，使胶水完全干燥。
    11. 在3.5 cm培养皿（或类似容器）中将牙科水泥（见材料与设备）与聚丙烯酸胶混合，调至粘稠状态。
    12. 用该水泥+胶混合物密封颅窗边缘，并覆盖暴露的颅骨表面直至皮肤边缘。
    13. 等待15分钟，使水泥+胶混合物完全干燥，然后移除耳杆。
    14. 按照方案3所述方法，对感兴趣区域和对照区域进行双光子激发显微镜（TPEM）成像。
    15. 成像结束后，将动物置于加热垫上恢复麻醉状态，并在单独笼中观察直至完全恢复。可提供湿粮以促进咀嚼和补水。

2. 通过变薄颅骨进行脑损伤成像

  1. 麻醉动物并准备手术区域
    1. 按照步骤 1.1 所述方法对小鼠进行麻醉，并准备诱导创伤。
  2. 颅骨变薄及穿刺损伤的实施
    1. 将带有动物固定装置的小动物立体定位仪放置到位（参见材料与设备）。
    2. 调整体视显微镜的位置，使其位于立体定位仪旁，以便聚焦于动物颅骨表面。
    3. 使用体视显微镜定位颅骨上的前囟点，根据立体定位坐标确定需要成像的脑区，并通过刮擦标记该区域。
      注意：颅骨变薄的位置不应位于颅骨缝上或其附近，因为这些区域的颅骨稳定性较差。此外，位于颅骨缝下方的大皮层或脑膜血管及脑膜可能引起成像伪影。
    4. 将涂有胶水的金属固定环置于动物颅骨的目标区域，施加轻微压力，并等待 5 分钟，直至金属环牢固粘附于颅骨。
    5. 在直径为 3.5 cm 的培养皿（或类似容器）中混合牙科水泥（参见材料与设备）与聚丙烯酸胶，调至粘稠状态。
    6. 用上述水泥与胶的混合物密封金属环的边缘，并将暴露的颅骨表面（直至皮肤边缘）也覆盖该混合物。
    7. 等待 15 分钟，使水泥和 胶混合物完全干燥。
    8. 用 PBS 多次冲洗变薄的颅骨区域及金属环周围部分，以清除未聚合的胶残留物。
      注意：必须确保颅骨与固定环之间连接稳定，以保证成像过程中制备样本的稳定性。
    9. 使用体视显微镜的高倍模式，采用高速微型钻头去除颅骨骨质的上层结构，形成直径约为 0.5–1.5 mm 的变薄区域。钻孔过程中使用压缩空气清除骨屑。为避免摩擦生热，应在变薄过程中间歇性地进行钻孔操作。使用室 温溶液冷却钻头，并定期向变薄区域滴加缓冲液以吸收热量。
      注意：为避免损伤皮层，不要在较大区域（>1.5 mm）内将颅骨钻至极薄层（<50 μm）。
      注意：啮齿类动物的颅骨结构由两层致密骨板夹着一层较厚的松质骨构成。松质骨中的微小空腔呈同心圆状排列，并含有血管的骨小管。应使用微型钻头去除外层致密骨及大部分松质骨层。松质骨内血管的破坏可能导致出血，可使用止血胶原海绵控制出血。
    10. 使用二次谐波生成（SHG）成像技术检查是否已去除大部分松质骨。注意避免过度变薄，确保在此阶段剩余骨层厚度仍大于 50 µm。
    11. 在变薄区域滴加一滴温热缓冲液（35–37 °C），使用显微外科刀片或微型精修磨头进一步去除骨层，形成直径约 700 µm、骨厚约 20 µm 的平滑区域。在此步骤中，建议反复进行 SHG 成像，并定期测量骨层厚度。
    12. 对目标区域及对照区域进行双光子激发显微镜（TPEM）成像。
    13. 通过调节耳杆高度螺丝调整头部位置，使变薄区域严格处于水平状态。将针头置于变薄区域上方，并确认目标位点下方无大型血管。
    14. 通过将针头插入脑组织，深度为距变薄颅骨表面 0.5–2.0 mm，并依据穿刺位点的坐标，制造损伤。
    15. 拔出针头后，使用止血棉片（参见材料与设备）控制急性脑损伤后出现的出血。等待血凝块形成，且损伤部位的血管搏动停止。 
    16. 按照第 1.2.10 节所述方法，向损伤部位微注射 100 µM 的 Sulforhodamine 101 或其他感兴趣化合物。 
    17. 按照方案 3 所述进行 TPEM 成像，以监测损伤进展与恢复过程。
    18. 成像结束后，将动物置于加热垫上，使其从麻醉状态中恢复意识。在此期间不得离开动物，并在其完全恢复身体功能后方可放回原饲养笼。

3. 成像

  1. 将金属固定器连接到定制框架上，把动物置于显微镜下。
  2. 用于成像时，使用 例如 配备Mai Tai DeepSee激光器和XLPLN 25X 1.05 NA水浸物镜的FV1000MPE双光子显微镜，专为优化而设计 体内 双光子成像
  3. 在显微镜下使用宽场荧光模式确定病灶部位。利用长通滤光片观察脑血管结构，并根据所见的血管分布模式选定对照区域。
  4. 为了成像二次谐波生成（SHG）信号，将飞秒激光器调至800 nm波长，并使用380–410 nm带通滤光片收集发射光。对于荧光成像，使用515–560 nm带通滤光片收集发射光，以下波长用于激发荧光：GFP- 860 nm，YFP- 950 nm
  5. 使用 Fluoview 软件进行图像采集。
  6. 保存每个 ROI 的坐标，以便后续重复成像。随时间对相同的 ROI 进行成像，并每次调整坐标以最大程度地增加图像重叠。
  7. 使用适当的软件分析图像（例如. ImageJ）。此处展示的重建使用 Imaris 软件完成。

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结果

我们优化了两种手术操作步骤：1）慢性颅窗和2）颅骨磨薄，用于转基因小鼠创伤后脑部成像。实验准备的示意图见图1。使用外径0.3 mm（30 G）的钢针在钻出的孔洞处进行创伤性穿刺（图1A）。成功的颅窗制备可实现皮层表面下深达650 μm的成像（图1B），而颅骨磨薄通常限制在约300 μm深度（图1C），这在Thy1-YFP-H小鼠皮层锥体神经元的三维重建中得到证实。

刺创损伤导致大脑皮层特定体积内的树突被清除以及毛细血管网络被破坏。在损伤后的前两天内，病灶区域扩大，损伤诱导病灶周围区域出现树突膨泡以及树突回缩球的形成，如通过以下方法观察到的 体内 多光子显微镜图2).

我们对CX3CR1-EGFP小鼠进行颅骨变薄处理，以在损伤后立即成像小胶质细胞的活化与迁移过程（图3A）。二次谐波成像（SHG）是一种有效工具，...

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讨论

脑外伤是一种突发且不可预测的事件。本文描述了一种动物模型，可重现人类脑损伤后观察到的一系列病理变化，包括神经变性、树突消失、脑水肿、胶质瘢痕、大脑皮层出血伴局灶性蛛网膜下腔出血，以及血脑屏障通透性增加。为了研究创伤后的原发性和继发性发病机制及恢复过程，该损伤模型与纵向研究相结合 体内 精细神经元和胶质细胞结构的可视化。使用了在神经元中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系（Thy1-YFP-H）7，星形胶质细胞（GFAP-EGFP）8或小胶质细胞（CX3CR1-EGFP）9此外，我们采用了二次谐波生成（SHG）成像技术，并利用磺酰罗丹明对星形胶质细胞进行标记 10110.

本文所述模型可重现穿透性脑损伤类型。因此，该模型的一个局限性在于其无法提供有关闭合性头部损伤机制的信息。最近，Sword 及其合作者报道了关于挫伤周围皮层细胞行为的多光子成像结果6。考虑到闭合性头部损伤在临床上更为常见，作者所报告的方法学途径在冲击性脑创伤研究领域具有广阔前景，可有效补充...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢 Frank Kirchhoff 博士提供了 GFAP-EGFP 和 CX3CR1-EGFP 小鼠品系。本工作得到了芬兰国际流动性中心、Tekes、芬兰神经科学研究生院（FGSN）以及芬兰科学院资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2A-sa 型直头镊子，115 mmXYtronicXY-2A-SA
30 G ½ 英寸针头BDREF 304000
动物用修剪器，剃毛机AesculapIsis GT420
双目显微镜ZeissStemi 2000
带不锈钢加热板的生物温度控制器SupertechTMP-5b
钝头显微外科刀片BDREF 374769
带细丝的硼硅酸盐玻璃管Sutter InstrumentsBF120-69-10用于玻璃移液管制作
卡洛芬PfizerRimadyl vet
氯己定葡糖酸盐SigmaC9394
牙科水泥DrguDent, DentsplyREF 640 200 271
地塞米松FaunaPharmaRapidexon vet
一次性钻头MeisingerHP 310 104 001 001 008
Dulbecco’s PBS 10xSigmaD1408
Dumont #5 镊子，110 mmFST91150-20
Ealing 微电极拉制仪Ealing50-2013用于玻璃移液管制作的垂直拉制仪
眼膏NovartisViscotears
Foredom 钻机控制器ForedomFM3545
Foredom 微型电机手柄ForedomMH-145
小鼠气体麻醉平台Stoelting50264安装于立体定位仪上
止血胶原海绵Avitene, Ultrafoam BARDRef 1050050
ImarisBitplane
氯胺酮IntervetKetaminol vet
Mai Tai DeepSee 激光器Spectra-Physics
金属固定架Neurotar
微型敷料镊，105 mmAesculapBD302R
MicrofilWPIMF34G-5用于毛细管填充的微型注射器
矿物油SigmaM8410
多光子激光扫描显微镜OlympusFV1000MPE
NanoFil 注射器 10 μlWPINANOFILHamilton 注射器
无纺布棉片 5 × 5Molnlycke Health CareMesoft外科棉塞
聚丙烯酸胶水HenkelLoctite 401
圆形玻璃盖玻片 Electron Microscopy Sciences
1.5 厚度 
小型动物立体定位仪David Kopf Instruments900
Stoelting 小鼠和新生大鼠适配器Stoelting51625安装于立体定位仪上。
学生用直型虹膜剪，11.5 cmFST91460-11
磺酰罗丹明 101Molecular ProbesS-359
UMP3 微量注射泵和 Micro 4 微量注射泵控制器WPIUMP3-1微量注射装置及控制器
赛拉嗪Bayer Health CareRompun vet

参考文献

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