小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

摘要

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内 本方案中展示了大脑的双光子成像。

摘要

尽管急性脑损伤常由各类事故中的头部创伤引起，并影响着大量人群，但目前尚无有效的治疗方法。现有动物模型的局限性阻碍了对病理机制的理解。多光子显微技术能够在生理和病理条件下，对完整动物脑内的细胞和组织进行纵向观察。本文中，我们描述了两种通过双光子成像技术研究脑细胞在创伤后行为的急性脑损伤模型。通过使用锐利的针头对选定脑区进行穿刺，可在脑实质内制造出宽度和深度可控的损伤。本方法采用立体定位注射针头穿刺，可同时结合药物干预。我们提出，该方法可作为研究哺乳动物脑急性创伤后病理生理学后果的细胞机制的先进工具。 体内在本视频中，我们将急性脑损伤与两种制备方法相结合：颅窗法和颅骨磨薄法。我们还讨论了这两种制备方法在创伤后脑再生多时段成像中的优势与局限性。

引言

急性脑损伤是一个重大的公共卫生问题，在机动车事故、跌倒或袭击中发生率较高，并且常导致慢性残疾，患病率也较高。目前针对脑损伤的治疗方法仍完全局限于对症治疗，因此限制了院前急救、外科手术和重症监护的疗效。这使得脑损伤的社会和经济影响尤为严重。由于多种原因，大多数临床试验未能证明采用新型治疗方法可在脑损伤后改善恢复情况。

动物模型对于开发新的治疗策略至关重要，可推动研究进入能够预测脑损伤患者药物疗效的阶段。目前已有多种成熟的头部创伤动物模型，包括控制性皮质冲击¹、液体 percussion 损伤²、动态皮质形变³、落锤撞击⁴和光损伤⁵。许多实验模型已被用于研究与头部创伤相关病理的某些形态学、分子和行为学特征。然而，尚无单一动物模型能完全成功地验证新的治疗策略。为了评估复杂的病理过程，建立可靠、可重复且可控的脑损伤动物模型十分必要。

最新显微成像技术与基因编码荧光报告分子的创新结合，为研究脑损伤的各个阶段——包括原发性损伤、原发性损伤的扩散、继发性损伤以及再生过程——提供了前所未有的机遇。特别是 体内 双光子显微镜是一种独特的非线性光学技术，可实现对啮齿类动物脑皮层深层中细胞甚至亚细胞结构的实时可视化。通过结合不同的荧光标记物，可同时对多种类型的细胞和细胞器进行成像。利用这一强大工具，我们能够在创伤后条....

方案

所有操作均根据当地动物护理指南（《芬兰动物实验法》62/2006）进行。动物实验许可（ESAVI/2857/04.10.03/2012）由当地主管部门（ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA）颁发。成年小鼠年龄为1–3个月，体重24–38 g，在大学认证的动物饲养设施中单笼饲养，并提供食物和饮水 广告 随意.

1. 通过颅窗进行脑损伤成像

1. 麻醉动物并准备手术区域
   1. 通过腹腔注射氯胺酮（Ketalar，80 mg/kg）和赛拉嗪（Rompun，10 mg/kg）的混合物（溶于经滤膜灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）对小鼠进行麻醉。定期检查小鼠的反射（尾部和脚趾夹捏测试），以确认麻醉深度。必要时增加剂量，以维持适当的麻醉状态，但避免过量。
   2. 在手术、成像过程以及麻醉后恢复的首小时内，使用加热垫将动物体温维持在37.0 °C。
   3. 为防止小鼠眼睛干燥，涂抹眼用润滑剂。
   4. 通过皮下注射给予地塞米松（Rapidexon vet，2 mg/kg），以减轻炎症和脑水肿。
   5. 在手术前最多30分钟或手术后立即给予镇痛剂（例如，腹腔注射酮洛芬）。若动物术后出现任何疼痛症状，如不愿活动、进食或饮水、体重减轻、流涎、竖毛或异常呼吸音，应重复注射镇痛剂。
   6. 使用剃毛机（见材料与设备）剃除小鼠头部毛发。注意避....

结果

我们优化了两种手术操作步骤：1）慢性颅窗和2）颅骨磨薄，用于转基因小鼠创伤后脑部成像。实验准备的示意图见图1。使用外径0.3 mm（30 G）的钢针在钻出的孔洞处进行创伤性穿刺（图1A）。成功的颅窗制备可实现皮层表面下深达650 μm的成像（图1B），而颅骨磨薄通常限制在约300 μm深度（图1C），这在Thy1-YFP-H小鼠皮层锥体神经元的三维重建中得到证实。

刺创损伤导致大脑皮层特定体积内的树突被清除以及毛细血管网络被破坏。在损伤后的前两天内，病灶区域扩大，损伤诱导病灶周围区域出现树突膨泡以及树突回缩球的形成，如通过以下方法观察到的 体内 多光子显微镜图2).

我们对CX3CR1-EGFP小鼠进行颅骨变薄处理，以在损伤后立即成像小胶质细胞的活化与迁移过程（图3A）。二次谐波成像（SHG）是一种有效工具，.......

讨论

脑外伤是一种突发且不可预测的事件。本文描述了一种动物模型，可重现人类脑损伤后观察到的一系列病理变化，包括神经变性、树突消失、脑水肿、胶质瘢痕、大脑皮层出血伴局灶性蛛网膜下腔出血，以及血脑屏障通透性增加。为了研究创伤后的原发性和继发性发病机制及恢复过程，该损伤模型与纵向研究相结合 体内 精细神经元和胶质细胞结构的可视化。使用了在神经元中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系（Thy1-YFP-H）⁷，星形胶质细胞（GFAP-EGFP）⁸或小胶质细胞（CX3CR1-EGFP）⁹此外，我们采用了二次谐波生成（SHG）成像技术，并利用磺酰罗丹明对星形胶质细胞进行标记 101¹⁰.

本文所述模型可重现穿透性脑损伤类型。因此，该模型的一个局限性在于其无法提供有关闭合性头部损伤机制的信息。最近，Sword 及其合作者报道了关于挫伤周围皮层细胞行为的多光子成像结果⁶。考虑到闭合性头部损伤在临床上更为常见，作者所报告的方法学途径在冲击性脑创伤研究领域具有广阔前景，可有效补充.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2A-sa 型直头镊子，115 mm	XYtronic	XY-2A-SA
30 G ½ 英寸针头	BD	REF 304000
动物用修剪器，剃毛机	Aesculap	Isis GT420
双目显微镜	Zeiss	Stemi 2000
带不锈钢加热板的生物温度控制器	Supertech	TMP-5b
钝头显微外科刀片	BD	REF 374769
带细丝的硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instruments	BF120-69-10	用于玻璃移液管制作
卡洛芬	Pfizer	Rimadyl vet
氯己定葡糖酸盐	Sigma	C9394
牙科水泥	DrguDent, Dentsply	REF 640 200 271
地塞米松	FaunaPharma	Rapidexon vet
一次性钻头	Meisinger	HP 310 104 001 001 008
Dulbecco’s PBS 10x	Sigma	D1408
Dumont #5 镊子，110 mm	FST	91150-20
Ealing 微电极拉制仪	Ealing	50-2013	用于玻璃移液管制作的垂直拉制仪
眼膏	Novartis	Viscotears
Foredom 钻机控制器	Foredom	FM3545
Foredom 微型电机手柄	Foredom	MH-145
小鼠气体麻醉平台	Stoelting	50264	安装于立体定位仪上
止血胶原海绵	Avitene, Ultrafoam BARD	Ref 1050050
Imaris	Bitplane
氯胺酮	Intervet	Ketaminol vet
Mai Tai DeepSee 激光器	Spectra-Physics
金属固定架	Neurotar
微型敷料镊，105 mm	Aesculap	BD302R
Microfil	WPI	MF34G-5	用于毛细管填充的微型注射器
矿物油	Sigma	M8410
多光子激光扫描显微镜	Olympus	FV1000MPE
NanoFil 注射器 10 μl	WPI	NANOFIL	Hamilton 注射器
无纺布棉片 5 × 5	Molnlycke Health Care	Mesoft	外科棉塞
聚丙烯酸胶水	Henkel	Loctite 401
圆形玻璃盖玻片	Electron Microscopy Sciences
1.5 厚度
小型动物立体定位仪	David Kopf Instruments	900
Stoelting 小鼠和新生大鼠适配器	Stoelting	51625	安装于立体定位仪上。
学生用直型虹膜剪，11.5 cm	FST	91460-11
磺酰罗丹明 101	Molecular Probes	S-359
UMP3 微量注射泵和 Micro 4 微量注射泵控制器	WPI	UMP3-1	微量注射装置及控制器
赛拉嗪	Bayer Health Care	Rompun vet