图像序列中动态Ca2+信号的自动化分析

摘要

本文展示了一种基于二维延时图像序列中正信号区域拟合最优椭圆并对其进行排序的新型感兴趣区域分析方案。该算法可帮助研究人员以最少的用户输入和偏差，全面分析生理性的Ca²⁺信号。

摘要

细胞内 Ca²⁺ 信号通常使用荧光 Ca²⁺ 指示剂染料和显微镜技术进行研究。然而，Ca²⁺ 成像数据的定量分析耗时较长，且容易引入偏差。目前已开发出基于感兴趣区域（ROI）检测的自动化信号分析算法，用于一维线扫描测量，但尚无现有算法能够整合二维图像序列中 ROI 的优化识别与分析。本文介绍了一种用于图像序列中 ROI 快速获取与分析的算法。该算法通过将椭圆拟合到去噪后的信号，以确定最佳 ROI 位置，并计算 Ca²⁺ 信号的振幅、持续时间和空间扩散等参数。该算法已作为 ImageJ（NIH）软件的免费插件提供。结合为开源统计分析软件 R 编写的分析脚本，该方法可构建一个高通量的实验结果快速统计分析流程。作者认为，采用此分析方案将有助于更全面、无偏倚地表征生理性的 Ca²⁺ 信号传导。

引言

Ca²⁺ 是一种普遍存在的第二信使信号分子，细胞质中的 Ca²⁺ 水平受到严格调控。细胞内 Ca²⁺ 信号十分复杂，包括孤立的瞬时信号、振荡以及传播性波动^1-4。Ca²⁺ 信号在空间和时间上的精确控制被认为是生理信号特异性的基础，因此，对 Ca²⁺ 信号模式的分析在多个研究领域中均受到广泛关注⁵。

Fluo-4 和 Fura-2 等 Ca²⁺ 指示剂染料通常用于通过荧光显微镜测量细胞内 Ca²⁺ 信号^5-12。通常，时间依赖性的 Ca²⁺ 信号通过用户定义的区域（即感兴趣区域，ROI）内的平均荧光随时间的变化来评估^5,6,13-16。目前，手动 ROI 分析既耗时又费力，因为需要用户识别大量 ROI 并执行重复性计算^17-19。这些方法还可能引入较大的人为误差，包括人为信号模式的引入以及低幅度或弥散性信号的遗漏^18,20。

以往已采用多种统计方法实现自动化的感兴趣区域（ROI）检测算法，以确定最佳的ROI放置位置，但这些方法通常仅限于线扫描或伪线扫描图像的分析，从而将时间上的空间分析限制在单一维度^17,19-22。此外，许多现有算法尚不足以涵盖Ca²⁺释放事件的多样性，这些事件从周期性、局灶性的瞬时信号到传播性钙波均有分布^23,24。在许多实验系统中，显著的图像伪影常常存在，干扰了信噪比的判别，进一步增加了生理学Ca²⁺信号全面评估的复杂性。

此前，已开发并验证了一种用于检测钙离子（Ca²⁺）信号瞬变的自动化感兴趣区域（ROI）检测算法，该算法作为美国国立卫生研究院（NIH）ImageJ 软件（National Institutes of Health, Bethesda, MD）的插件实现^25,26。该算法名为 LC_Pro，旨在识别和分析二维时间序列图像中包含 Ca²⁺ 信号瞬变的感兴趣区域（ROI）。本文提供了一个实用的实验方案，并以猪冠状动脉内皮组织中该算法的应用为例进行代表性演示，同时结合使用开源统计分析软件 R 进行后续处理，以生成可用的图形化结果。

方案

1. 血管解剖与成像

1. 按照 Martens 等²⁷ 所述方法，采集家猪幼体组织。将采集的猪右心室置于含有 HEPES 缓冲生理盐水溶液（PSS）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）底解剖皿中。
   1. 在体视显微镜辅助下，使用镊子和弹簧剪刀从周围组织中分离并取出左前降支冠状动脉的一段（长约 8 mm，直径约 0.5 mm），去除血管段周围的 cardiac 组织层。注意：操作时应避免刺破血管壁。
   2. 将一块 PDMS 块（1 × 0.5 × 0.5 cm）放入解剖皿中，并用针将其固定在皿底。将直径约 40 μm 的钨丝切成十二段，每段长约 0.3 cm，制成微针，并将这些微针放入解剖皿中。使用镊子将血管段一端用一根微针固定在 PDMS 块上。
   3. 小心地将小型弹簧剪刀插入血管腔内，沿血管一侧纵向剪开，使血管完全展开。将展开的血管段放置成内皮面向上的方向。
   4. 使用剩余的微针将展开血管段的边缘固定在 PDMS 块上，使其形成一个平坦的矩形。注意：微针顶部应弯成 90°，并插入至与块表面齐平。操作时应小心拉伸血管样本，避免过度拉伸；最终宽度应约为未拉伸初始宽度的 1.5 倍 。
   5. 配制少量（约 1 ml）Fluo-4 AM 负载溶液：将溶解于 DMSO 的 Fluo-4 AM（10 µM）与 Pluronic（0.03%）混合于 HEPES 缓冲 PSS 溶液中（成分，单位为 mM：134 NaCl、6 KCl、1 MgCl、10 HEPES、10 葡萄糖），然后将整个 PDMS 块浸入该负载溶液中，在室温避光条件下孵育约 40 分钟。
   6. 负载完成后，用 HEPES 缓冲 PSS 溶液清洗 PDMS 块 5–10 分钟。
   7. 将 PDMS 块安装在厚度为 50–100 µm 的垫片上，置于含 HEPES 缓冲 PSS 的玻璃底培养腔中。注意：可使用金属针作为垫片，并确保血管段朝下且不接触垫片。
   8. 将培养腔放置在配备共聚焦成像系统的倒置显微镜载物台上，聚焦于内皮细胞层。
   9. 使用共聚焦图像序列采集软件，在 20 倍放大倍数和约每秒 8 帧的帧率下，连续采集约 3 分钟的基础相对荧光时间序列图像 。
   10. 记录约 3 分钟的基础荧光后，将 HEPES 缓冲 PSS 溶液更换为等体积（约 1 ml）含 P 物质（Substance P，100 pM）的 HEPES 缓冲 PSS 溶液，并继续记录 3 分钟。

2. 自动化分析

1. 将共聚焦采集软件获得的荧光钙活动图像序列渲染为8位灰度的“.tif”格式文件，不包含比例信息。
2. 打开ImageJ，点击文件菜单中的“open”，在资源管理器窗口中选择相应的图像序列，以在ImageJ中查看图像序列。
3. 使用矩形ROI工具估算图像序列中活动空间扩散的上下边界，从而确定合适的ROI直径。注：矩形平均直径是选择ROI直径的合适依据。
4. 在计算机硬盘上创建一个新文件夹，并将图像序列添加到该文件夹目录中。
5. 在ImageJ中，点击“plugins”窗口，然后点击“LC_Pro”以启动分析。
6. 输入ROI直径值，并选择滤波阈值（0.05或0.01）。
7. 勾选“drug treatment”复选框，并输入加药前和加药后的时间点值（单位：秒）。
8. 点击“ok”，并在文件浏览器窗口中输入图像序列所在目录。

3. 图形输出

1. 从 http://www.r-project.org/ 下载 R 3.0.2 版本。
2. 打开 R 的 32 位版本。
3. 点击“文件”，然后选择“打开脚本”，并选中用于生成图形化实验报告的 'traceplot.R' R 脚本。
4. 通过选择“包”、“安装包”，然后选择相应的包，安装 calibrate 和 gplots 包。
5. 点击“文件”，然后选择“更改工作目录”命令，使用资源管理器窗口选择对应于 LC_Pro 分析输出的目录。
6. 点击脚本窗口，然后执行“运行全部”命令以运行该脚本。

结果

为了对共聚焦图像序列中的 Ca²⁺ 动态进行自动化分析，开发并实施了一种自定义算法 LC_Pro。如图 1所示，该算法采用顺序处理模块：A) 检测并追踪高于统计学噪声（p < 0.01）的动态 Ca²⁺ 变化位点；B) 在活性位点中心自动定义感兴趣区域（ROI）；C) 计算 ROI 内的平均荧光强度，以确定特定事件参数。通过计算机生成的已知强度和位置的高斯脉冲，展示了该算法的图形概览（图 2）。将信号脉冲（图 2A 和 B）利用标准正态分布的 z 分数转换为二值图像，并对高于信号阈值的像素位置拟合最优椭圆（图 2C）。采用椭圆排序算法确定最佳 ROI 定位（图 2D）。随后测量 ROI 平均荧光强度随时间的变化，并计算信号参数，包括幅度、持续时间和空间扩散范围（图 2E）。该分析方法被应用于评估完整血管内皮细胞中的 Ca²⁺ 动态。...

讨论

在细胞和多细胞水平上解析复杂的Ca²⁺信号需要严谨的实验与分析方法。本文描述了一种方法，通过对Ca²⁺依赖性荧光的时间分辨共聚焦图像序列进行自动化分析，识别并量化完整细胞区域中具有统计学意义的Ca²⁺信号。在所展示的具体案例中，从猪心脏中分离出一段动脉，将其固定并展开以暴露内皮层，加载Ca²⁺指示剂Fluo-4 AM后进行共聚焦成像，并使用定制算法LC_Pro进行分析。该算法旨在：1）检测并追踪统计学噪声以上（p < 0.01）的动态Ca²⁺变化位点；2）在活性位点中心自动定义感兴趣区域（ROI）；3）分析ROI内的平均荧光强度，以确定特定事件的参数。该方法通过减少人为误差和偏差、显著缩短离线分析时间，并提供整个视野中信号的完整索引以识别代表性谱型或模式，克服了生物信号研究中的主要局限性。LC_Pro的输出结果进一步通过R脚本处理，为单个实验生成包含高质量图形输出的完整参数报告。

正确执行所述技术需要注意多个步骤。组织解剖过程（步骤 1.1.1）必须谨慎进行，以避免...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖皿	Fisher Sci	#08-772-70
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Fisher Sci	#NC9644388	弹性体试剂盒，需模制成培养皿
HEPES缓冲的PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES酸
体视显微镜	Nikon Inst.	#MNA42000
镊子	Fine Science Tools	#11223-20
弹簧剪	Fine Science Tools	15003-08
钨丝	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
金属固定针	Fine Science Tools	#26002-10
玻璃底培养腔			定制设计
转盘共聚焦显微镜	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ 软件			下载地址：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
ImageJ 的 LC_Pro 插件			下载地址：http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R 软件			下载地址：http://www.r-project.org/
R traceplot 脚本			下载地址：https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing