为获取原发性卵巢癌细胞固体样品的方法

尽管其发病率相对较低，卵巢癌是最致命的妇科疾病和妇女^1,2癌症死亡的第五大原因。这主要是由于缺乏可靠的工具和模型，忠实地概括本病³的启动和发展。我们大部分的关于卵巢癌知识今天已经可以通过使用从腹水^4-7永生恢复卵巢表面上皮细胞（IOSEs），卵巢癌细胞系和原发性卵巢癌细胞。不幸的是，它们的使用也有一些局限性包括一些与永生化过程或在体外的通道相关联的遗传和表型的变化，并从腹水中制备得到的人口的异质性。

因此，从卵巢癌的身份和具体的固体样品得出原发性卵巢癌细胞代表UNIQUË工具，研究卵巢癌的进展。

参与获取这些恶性细胞的主要困难是由于基质细胞或成纤维细胞一起损失生存能力和过早缺乏这些EOC细胞的培养增殖能力的过度生长。有几种方法来从实体瘤产生单细胞悬液目前存在的，通过机械方式或酶解，但是某些技术产生了较多的首选结果^8。这里，我们表明，酶消化用分散酶II的结果可行的，成纤维细胞 - 自由EOC细胞的一种有效的恢复。将如此获得的培养物EOC极易受遗传操纵和也可在药物筛选试验有用的，表明这些EOC培养物适合于许多下游应用。

操守准则
卵巢癌的固体样品从明尼苏达大学的组织采购基金（TPF）后的机构审查委员会委员会获得：人类主题委员会（IRB）的批准。

1。试剂设置

1. 通过补充的DMEM含10％FBS和100单位青霉素 - 链霉素准备完整的DMEM培养基中。存储介质在4℃和温暖至37℃后才能使用。
2. 分装分散酶II为5-10毫升单独的卷，以避免重复冷冻解冻并储存在-20°C下冻存。

2。组织收集

1. 在手术时从宏观上由病理学家鉴定为癌症领域收集卵巢癌（〜5克大小）的固体试样。临床标本是去确定，并根据机构的协议注册。
2. 将样品在一个无菌，SC珠螺杆盖，聚丙烯试样容器填充用30ml冰冷的PBS。从外科病理学实验室运送标本的研究实验室进行处理在冰上，并在从标本收集30分钟（ 图1）。

3。组织处理

1. 在无菌条件下工作的，传送含有10ml新鲜的冰冷PBS中，利用无菌的刀片，进一步切成可能（2毫米或更小）的最小片样品上的培养皿（60毫米×60毫米）（ 图2A和2 B）。
2. 转移剁碎组织成包含（30分钟，37℃）分散酶II（2.4 U / ml）的DMEM中加入10ml预热的15毫升锥形管和孵化在5％CO ₂和37℃下30分钟。为确保标本的最佳消化，手动搅拌的浆细胞，每隔5分钟。
3. 经过30分钟的培养，转让（使用10ml的血清吸液管）的料浆细胞上的细胞过滤器（70微米网孔）放置在50ml锥形管中的顶部和应用对使用注射器柱塞上的网状物的温和的压力。丢弃任何未解离的组织（残留在网格的顶部），并收集所得到的细胞悬浮在50ml的无菌锥形管中。离心机在320×g离心7分钟，在4℃（ 图3）。
4. 弃去上清，重悬细胞沉淀在含有10％FBS的10ml DMEM。
5. 培养在培养皿中的细胞悬浮液在5％CO ₂和37℃（ 图4）。
6. 从最初的镀24小时后更换培养基。这样就可以去除细胞碎片和目前大多数文化中的红细胞。
7. 每三天在随后的两个星期之后，主平机会的文化准备好下游应用改变介质。

卵巢癌的新鲜临床标本手术后收集（ 图1）和切成小片（ 图2A和2B）构成细胞浆液。这允许试样的最佳暴露于酶处理。细胞浆暴露于酶消化并在37℃下进行30分钟。在孵育时间浆液变得越来越混浊（尤其是各搅拌后），这是组织分解的迹象。在温育时间结束时，将浆液转移到一个细胞过滤到EOC细胞免受任何未解离的组织（ 图3）中分离出来。将回收的细胞悬浮液置于5％CO 2和37℃（F IGURE 4）。在此阶段的细胞培养物的形态学揭示两者EOC细胞的存在作为单细胞悬浮液，并在小团块。在这一点上，培养也揭示了PRE​​SEN ce的红细胞和图5所示的小碎片。重要的是，而平机会会慢慢（历时1-3天）坚持以塑料，红细胞和细胞碎片不会和他们最终将逐步“从文化的消失”。从最初的电镀3日，平机会的文化越来越显示贴壁EOC细胞团，并逐渐减少红细胞和碎片， 如图6。由6-7天，EOC细胞形成涡流状的形状（箭头所示），并开始扩散到塑料以形成较大的多细胞聚集体，导致EOC细胞作为如图7所示的典型的鹅卵石形态。第14天，平机会细胞通常汇合（ 图8），现在已经准备好为下游测试和应用。

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图1。收集临床标本。卵巢癌的固体样品被收集在手术时间，并放置在无菌，螺丝盖，聚丙烯试样填充用30ml冰冷的PBS的容器。

图2。处理临床标本。 A）转移到含有10ml新鲜的冰冷的1×PBS。 乙培养皿固体样品）临床标本进一步切成约2mm大小的块。

图4。所得EOC细胞悬浮液的电镀。除去任何未离解的组织后，将细胞悬浮液离心并重新悬浮于10ml的DMEM接触器的癌宁10％FBS和5％CO 2和37℃下培养在培养皿中

EOC的细胞培养物的处理。细胞悬浮电镀后立即后立即的图5。形态示EOC作为单细胞悬浮液，并在团块（包括箭头所示），红细胞和细胞碎片仍然很多在这个阶段。原来的放大倍率，20X。

EOC细胞培养3天的图6。形态在第3天电镀。EOC细胞培养镀层呈半贴壁EOC℃后后埃尔簇（由箭头表示）和较少的红细胞污染。原来的放大倍率，20X。

图7。一个星期后，建立了平等机会委员会文化从最初的电镀后的一个星期电镀。EOC细胞培养显示细胞在组织培养塑料传播漩涡般的集群。原来的放大倍率，20X。

图8。融合EOC文化。EOC显示细胞在培养14天，典型的上皮鹅卵石形态的融合单层。

作者什么都没有透露。