从实体标本中获取原发性卵巢癌细胞的方法

摘要

本研究描述了一种从实体临床标本中分离和表征原发性卵巢癌细胞的详细方法。将卵巢癌临床标本进行酶消化处理，以获得可用于下游应用的、具有活性且无成纤维细胞污染的上皮性卵巢癌（EOC）细胞。

摘要

迫切需要可靠的工具来研究卵巢癌的起始与进展。尽管卵巢癌细胞系的使用对于理解卵巢癌仍具有重要价值，但其应用存在诸多局限性，包括缺乏异质性以及伴随长期培养而产生的大量遗传改变 体外 传代培养 在此，我们描述一种可从手术时采集的实体临床标本中快速建立原发性卵巢癌细胞的方法。该方法包括将临床标本进行30分钟的酶消化处理，所得细胞悬液可进行培养，并用于后续应用，包括药物筛选。相较于已建立的卵巢癌细胞系，原发性卵巢癌细胞系的优势在于其能够代表来源临床标本的特异性，并可从原发或转移性卵巢癌的不同病灶部位获取。

引言

尽管卵巢癌的发病率相对较低，但它是最致命的妇科疾病，也是女性癌症死亡的第五大原因^1,2这主要是由于缺乏能够真实模拟该疾病发生与进展的可靠工具和模型³目前，我们对卵巢癌的大部分认识都是通过使用永生化卵巢上皮细胞（IOSEs）、卵巢癌细胞系以及从腹水液中分离的原代卵巢癌细胞获得的。^4-7然而，它们的使用存在若干局限性，包括与永生化过程相关的多种基因和表型改变 体外 传代次数及由腹水制备导致的细胞群体异质性。

因此，来源于可识别且特异的卵巢癌实体标本的原代卵巢癌细胞，是研究卵巢癌进展的独特工具。

获取这些恶性细胞的主要困难在于间质细胞或成纤维细胞的过度生长，同时这些卵巢上皮癌（EOC）细胞在培养过程中容易出现活力下降以及增殖能力过早丧失。目前已有多种通过机械法或酶解法将实体瘤制备成单细胞悬液的方法，但某些技术能获得更理想的产出效果⁸。本文表明，使用中性蛋白酶II进行酶消化可有效回收具有活力且不含成纤维细胞的EOC细胞。由此获得的EOC细胞培养物对遗传操作高度敏感，也适用于药物筛选实验，表明这些EOC细胞培养物适合多种后续应用。

方案

伦理声明 
在获得机构审查委员会（人体受试者委员会，IRB）批准后，从明尼苏达大学组织获取设施（TPF）获得卵巢癌的实体标本。

1. 试剂配制

1. 通过在DMEM中添加10% FBS和100单位青霉素-链霉素配制完全DMEM培养基。将培养基储存于4 °C，并在使用前预热至37 °C。
2. 将dispase II分装为5–10 ml的独立体积，以避免反复冻融，并于-20 °C非无霜冰箱中保存。

2. 组织采集

1. 手术时，从病理医生肉眼鉴定为癌症的区域采集卵巢癌固体标本（约5 g大小）。临床标本根据机构规程进行去标识化处理并登记注册。
2. 将标本置于装有30 ml冰冻PBS的无菌螺旋盖聚丙烯标本容器中。在30分钟内，将标本置于冰上，从外科病理科实验室转运至研究实验室进行处理。 从样本采集 (图1).

3. 组织处理

1. 在无菌条件下，将样品转移至含有 10 ml 新鲜冰冻 PBS 的培养皿（60 mm x 60 mm）中，并使用无菌剃刀片进一步切成尽可能小的组织块（2 mm 或更小） （图 2A 和 2B）。
2. 将切碎的组织转移至含有 10 ml 预热（37 °C，30 分钟）的 DMEM 培养基中的 15 ml 锥形管，其中含 dispase II（2.4 U/ml），于 5% CO₂、37 °C 条件下孵育 30 分钟。为确保组织充分消化，每隔 5 分钟手动振荡细胞悬液一次。
3. 孵育 30 分钟后 ，使用 10 ml 血清移液管将细胞悬液转移至置于 50 ml 锥形管上方的细胞筛网 （70 μm 孔径）上，并用注射器活塞轻轻按压筛网表面。弃去未消化的组织（残留在筛网上方），收集通过筛网的细胞悬液至 50 ml 无菌锥形管中。在 4 °C 条件下以 320 × g 离心 7 分钟  （图 3）。
4. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培养基中。
5. 将细胞悬液置于培养皿中，在 5% CO₂、37 °C 条件下孵育 （图 4）。
6. 初次接种后 24 小时 更换培养基，以去除细胞碎片及培养物中大部分红细胞。
7. 随后两周内每三天更换一次培养基，此后原代 EOC 培养物即可用于后续实验应用。

结果

卵巢癌的新鲜临床标本在手术后收集（图1），并切成小块（图2A 和 图2B），形成细胞悬液。这有助于标本充分接触酶处理。将细胞悬液进行酶消化，并在37 °C下孵育30分钟。在孵育过程中，悬液逐渐变得浑浊（尤其在每次振荡后），这是组织解离的标志。孵育结束后，将悬液转移至细胞筛中，以分离上皮性卵巢癌（EOC）细胞与未完全解离的组织（图3）。收集的细胞悬液置于含5% CO₂、37 °C的培养环境中（图4）。此时，细胞培养物的形态显示存在以单细胞悬液形式和小团块形式存在的EOC细胞。此阶段的培养物中还可观察到红细胞及少量碎片，如 图5 所示。重要的是，EOC细胞会缓慢地（在1–3天内）贴附于塑料培养表面，而红细胞和细胞碎片则不会贴壁，并会随着时间推移逐渐“从培养体系中消失”。接种后第3天，EOC培养物中可见贴壁的EOC细胞簇逐渐增多，红细胞和碎片则逐渐减少，如 图6 所示。第6–7天，EOC...

讨论

更深入地了解卵巢癌的病因和发展机制，对于改善罹患这种毁灭性疾病女性的预后至关重要。在这一背景下，使用已建立且"商业化提供"的卵巢癌细胞系无疑发挥了巨大作用。然而，目前我们已知，癌细胞系在诸多方面并不能代表其来源的人类肿瘤，包括缺乏异质性^9,10。

本文报道了一种快速、可靠的方法，可在30分钟内直接从卵巢癌临床样本中分离并培养原代卵巢癌细胞 外科标本分离

由于原代细胞是从实体组织标本而非腹水液中分离获得，因此该方法的优势在于能够在腹水形成之前，从疾病早期阶段的组织中分离细胞。该技术的另一优势是能够从特定部位分离原代卵巢癌细胞。采用本方案成功获取有活力的原代卵巢癌细胞，在很大程度上取决于手术后样本处理的速度。为获得最佳结果，样本应在手术后30分钟内送达实验室 。若无法实现，应将样本在4 °C（置于PBS中）保存过夜，并于次日进行处理。根据我们的经验，过夜储存后处理样本会降低细胞得率。 使用dispase II消化时间超过30分钟 也会降低细胞活力，应避免...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS，无菌	Invitrogen	14190-144
螺旋盖聚丙烯样本容器，无菌	Thermo Scientific	02 1090
DMEM 培养基，无菌	Invitrogen	11995-065
胎牛血清，无菌	Thermo Scientific Hyclone	SH30396.03
100x 青霉素-链霉素溶液，液体	Invitrogen	15140-122
Dispase II，无菌	Roche	04942 078 001
小型精细镊子和手术刀片，无菌	Fisher Scientific	镊子：08-953E，刀片：08-927-5D
小型解剖剪刀，无菌	Fisher Scientific	08-945
15 ml 锥形带盖离心管，无菌	BD Falcon	352097
50 ml 锥形带盖离心管，无菌	BD Falcon	352027
10 ml 血清移液管，无菌	Corning	13-678-11E
6 ml 注射器活塞，无菌	Tyco Healthcare	8881516911
尼龙滤网（70 μm）细胞筛，无菌	BD Falcon	352350
5 cm 培养皿，无菌	Corning	430166
10 cm 培养皿，无菌	Corning	430167