聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

摘要

报道了一种通过新设计的收集装置，由新型可生物降解聚合物聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）制备电纺长纤维并使其跨越更大沉积区域的合成与制备方法。这些纤维能够支持源自小鼠多能干细胞的细胞生长。

摘要

在组织工程应用中，制备可生物降解且生物相容性的支架是最理想但具有挑战性的任务。 在各种制备方法中，静电纺丝因其简便性和多功能性而成为最具吸引力的方法。此外，静电纺丝制备的纳米纤维可模拟天然细胞外基质的尺寸，从而为细胞的存活和生长提供额外支持。本研究展示了利用新设计的静电纺丝收集装置，制备一种名为聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）¹的新型可生物降解且生物相容性聚合物的长纤维，并使其跨越更大沉积面积的可行性。 PGD 具有独特的弹性，其力学性能与神经组织相似，因此适用于神经组织工程应用。用于制备纤维支架材料的合成与制备过程简单、高度可重复且成本低廉。在生物相容性测试中，源自小鼠胚胎干细胞的细胞能够黏附并在静电纺丝 PGD 纤维上生长。综上所述，本方案提供了一种多功能的制备方法，可用于制造 PGD 静电纺丝纤维，以支持小鼠胚胎干细胞来源的神经谱系细胞的生长。

引言

静电纺丝是一种制备微米至纳米级纤维支架的有效加工方法。其基本原理是在针头尖端与接地收集器之间施加高电压，使溶液在针头出口处形成泰勒锥。当溶液中的静电排斥力超过表面张力时，带电液流便从针尖喷射而出，在空气中飞行过程中伴随溶剂挥发，最终沉积在接地的收集器上。注射泵可提供持续流出的溶液，从而在短时间内制备大量静电纺丝纤维。在从喷丝口离开至到达收集器的过程中，带电射流会根据多种参数发生拉伸和鞭动，这些参数包括聚合物溶液的黏度和表面张力、溶液中的静电力以及外加电场的相互作用等²。

在静电纺丝过程中，收集器作为导电基底，用于沉积微米至纳米级纤维。本研究设计了一种新型纤维收集器，以获得具有特定尺寸（长度 × 宽度）的纤维膜。传统上使用铝箔作为收集器，但将纤维从平整表面转移至其他基底较为困难。从传统收集器上完整采集纤维膜的难点主要在于，静电纺丝纤维会牢固地附着在收集器表面。因此，我们对收集器进行了改进，将一片铝箔折叠成矩形条状，并将其垂直固定于一块平板金属上。静电纺丝纤维被拉伸在该铝箔条尖端与金属板之间的区域，从而可轻松转移至其他基底。

由于Robert Langer研究团队的开创性工作，热交联弹性体聚合物正受到越来越多的关注。该团队于2002年首次引入了聚癸二酸甘油酯（PGS），这是一种类似于硫化橡胶的聚酯材料 ³。与PGS类似，我们通过甘油与十二烷二酸的热缩合反应成功合成了聚甘油-十二烷二酸酯（PGD），并证实其具有独特的形状记忆性能¹。与较硬的合成材料聚羟基丁酸酯或聚-L-乳酸（杨氏模量分别为250 MPa和660 MPa）不同，PGD表现出类似橡胶的弹性特性，在温度高于37 °C时其杨氏模量为1.08 MPa，与体内周围神经组织（0.45 MPa）的力学性能接近。此外，PGD具有生物可降解性，且其降解时间可通过调节甘油与十二烷二酸的比例进行精确调控。十二烷二酸是一种含有两个末端羧基的十二碳化合物，分子式为HOOC(CH₂)₁₀COOH。像癸二酸和十二烷二酸这类偶数碳链的二羧酸可被代谢为乙酰辅酶A，并进入三羧酸（TCA）循环（即柠檬酸循环）。二羧酸的代谢产物琥珀酰辅酶A是糖异生的前体物质，也是TCA循环的中间产物⁴。因此，一些研究认为它们可作为肠内或肠外营养的替代能量底物，尤其适用于病理状态下的营养支持。此外，PGD具有独特的形状记忆效应，因其玻璃化转变温度为31 °C，因此在室温和体温条件下表现出显著不同的力学性能。 综上所述，PGD具有生物可降解性、生物相容性，并表现出与神经组织相似的独特弹性力学性能，因此是神经组织工程应用的理想材料。在本实验方案中，利用新设计的收集装置，通过静电纺丝技术制备了大面积连续分布的PGD长纤维。这些纤维支架能够支持小鼠多能干细胞的生长与分化。

方案

1. 静电纺丝收集器设置

1. 将铝箔剪成矩形片状。
2. 将矩形片折叠成矩形条状，并用胶带将其垂直固定在一块平板金属板上（图1）。注意：纤维膜的尺寸取决于条带的长度和宽度，因此可根据需要调整条带的尺寸。

2. 聚合物溶液的制备

1. 在烧杯中将甘油与十二烷二酸（DDA）按1:1的摩尔比在120 °C下混合反应100小时，以获得PGD聚合物。
2. 在15 ml离心管中，按1.5:3:95.5的质量比将聚环氧乙烷（PEO）和明胶溶解于65%乙醇中，盖紧管盖，并在60 °C烘箱中加热搅拌1小时，直至形成均一溶液（基础溶液）。
3. 用于静电纺丝时，将PGD聚合物与基础溶液按4:6的质量比混合。注意：PGD浓度对纤维直径有显著影响。使用30%-50%的PGD可制备出长度超过5 cm且纤维直径增大的纤维。
4. 向聚合物溶液中加入0.1%的核黄素，充分混匀。

3. 电纺丝

1. 将聚合物溶液注入带有18 G钝头不锈钢针头的5 ml标准注射器中。
2. 将注射器插入注射泵。
3. 将高压电源的接地端连接至金属板，正极导线连接至针头。
4. 调节针头与铝箔条之间的距离至15 cm。
5. 将注射泵放置成与水平方向约成15°角，以防止纤维在铝箔条前端聚集。
6. 启动注射泵，并将泵的流速调节至0.6 ml/hr。
7. 开启高压电源，并将工作电压设定为14.6 kV。

4. 纤维处理

1. 收集完成后，将纤维膜暴露于紫外光下 60 分钟以进行交联。
2. 将纤维膜从铝箔条转移至 100 mm 培养皿中，并再次暴露于紫外光下 20 分钟以进行灭菌。
3. 在生物安全柜中，使用手术刀将纤维膜切割成大小相同的圆形片状，并将这些片状物放入 24 孔板中。
4. 进行细胞预接种处理时，将纤维样品浸入 1 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 37 °C 下孵育过夜。
5. 次日，小心吸除 PBS，每孔加入 1 ml 分化培养基（DMEM/F12、N2 和 FGF2）（参见材料表中的配方），并在 37 °C 下孵育 3 小时。
6. 小心吸除分化培养基，每份纤维样品中加入 0.2 ml Matrigel，在 37 °C 下孵育 30 分钟。注意：也可使用层粘连蛋白（laminin）进行纤维涂层处理。向纤维中加入 0.2 ml 浓度为 20 µg/ml 的层粘连蛋白，在室温下孵育 3 小时。
7. 小心移除各孔中多余的 Matrigel，用 2 ml 分化培养基冲洗一次。注意：纤维样品现已准备好用于细胞培养。

5. 纤维上的细胞接种

1. 向mES细胞培养皿中加入1 ml的Accutase，于37 °C孵育10分钟。
2. 10分钟后，mES细胞从培养皿上脱落。向培养板中加入4 ml分化培养基，收集悬浮的mES细胞至15 ml离心管中，并反复吹打细胞约15次以分散细胞团块。
3. 以400 x g离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于4 ml分化培养基中。
4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。取200 µl细胞悬液转移至15 ml离心管中，用分化培养基稀释10倍 。取15 µl稀释后的细胞悬液加入已放置盖玻片的血细胞计数板计数室中。在显微镜下计数血细胞计数板中央1 mm方格及其四个角的方格内的细胞数。注意：每毫升细胞数 = 每个方格平均细胞数 × 稀释倍数 × 10⁴
5. 每孔接种约5 × 10⁴个mES细胞。将细胞悬液缓慢滴加至纤维样品中央，避免液体流向孔边缘，以防溶液从纤维膜上流失。
6. 每孔加入1 ml分化培养基，将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，以促进细胞贴附、生长和分化。
7. 每隔一天吸除各孔中的旧培养基，更换为1 ml新鲜分化培养基。

6. 细胞活力

1. 吸出每孔中的旧培养基。
2. 混合 1/10^th 将Resazurin荧光试剂与培养基按体积混合，每孔加入1 ml。
3. 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育₂ 4小时，避免直接光照。
4. 孵育4小时后，从每个孔中转移100 µl 3倍浓度的试剂至96孔板中，随后即可使用荧光分光光度计在激发波长560 nm、发射波长590 nm的滤光片条件下测定样品。

7. 实时 PCR

1. 培养14天后，向样品中加入裂解缓冲液，从纤维样品上的细胞中提取总RNA。
2. 使用4 µl总RNA，在20 µl反应体系中通过逆转录合成cDNA。
3. 在每个光学管中配制PCR反应混合液：10 µl Master Mix（2x）、0.2 µl染料、8 µl无核酸酶水、1 µl cDNA和1 µl引物（本研究使用的引物列于表1中）。
4. 设置PCR程序：a. 95 °C 2分20秒，1个循环；b. 95 °C 3秒→60 °C 1分钟，40个循环；c. 95 °C 15秒，1个循环；d. 60 °C 1分钟，1个循环；e. 95 °C 15秒，1个循环。选择比较C_T法以确定相对基因表达水平。
5. PCR结束后，使用StepOne软件分析实时PCR结果，并将结果导出至Excel。

结果

静电纺丝的主要组件如图1所示。通常通过垂直附着的铝箔条和平板金属板获得大面积的纤维膜。图2展示了收集装置的设计以及静电纺丝纤维膜。其宽度和长度可根据不同应用进行调节。使用PGD聚合物与基础溶液混合物制备的纤维长度可达10 cm。静电纺丝纤维的形貌如图3所示。由40% PGD浓度制得的纤维直径处于微米级。在纤维上培养3天和6天后，由小鼠胚胎干细胞（mES细胞）分化而来的细胞的共聚焦显微镜图像如图4所示。绿色荧光信号来源于细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的过表达。图5中Resazurin荧光试剂的结果显示，在经Matrigel和层粘连蛋白（laminin）包被的PGD纤维上生长的mES细胞具有相当的细胞活力，并且相较于未包被组表现出相对更高的增殖能力。多能性及神经细胞标志物的基因表达通过实时PCR进行定量分析（图6）。大多数在纤维上培养的mES细胞表达多能性标志物OCT4、Nanog和Sox2，而少数细胞表达神经干细胞标志物PAX6和Nesti...

讨论

目前用于静电纺丝的简单收集器存在局限性，而旋转收集器又结构复杂，这些因素均使其难以获得某些应用所需的纤维膜长度和尺寸。此外，将纤维从接地收集器转移至培养皿或其他基底上也是一大挑战⁵。本报告介绍了一种新设计的收集器，该收集器仅通过将一条铝箔带连接到接地收集器上即可制成，能够一次性获得最大尺寸达10 cm × 20 cm的大型纤维膜。图1和图2展示了用于制备长度达10 cm、且纤维膜宽度可控的静电纺丝装置的示意图。在针尖与收集器之间的静电场作用下，静电纺丝纤维被拉伸并跨越铝箔带与接地收集器之间的区域，形成平整的纤维膜，且可轻松转移至其他基底。静电纺丝纤维可提供多孔纤维结构，使细胞能够在真正三维环境中跨越并附着于多根纤维上。本研究中制备的纤维膜尺寸足够大，使其成为伤口愈合和神经再生等多种应用的理想候选材料。

通过调控静电纺丝过程中的多个变量，可调节纤维的直径。这些变量包括聚合物浓度、施加电压的大小、聚合物输送速率、针头与收集器之间的距离等^6-8。在本研究中，分别配制了由50% ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油	Sigma-Aldrich	G7757
十二烷二酸	Sigma-Aldrich	D1009
明胶	Sigma-Aldrich	D1890
聚环氧乙烷（PEO）	Sigma-Aldrich	182028
核黄素	Sigma-Aldrich	132350250	0.10%
小鼠胚胎干细胞	GlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2添加剂	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen	10010-031
刃天青荧光染料	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV总RNA提取系统	Promega	Z3100
GoScript反转录系统	Promega	A5000
GoTaq qPCR预混液	Promega	A6001
注射泵	Fisher scientific	14-831-200
高压电源	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
紫外光	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT多功能微孔板读板仪	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR系统9600	Perkin Elmer	8488
StepOne实时荧光定量PCR系统	Applied Biosystems	4376357