人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

摘要

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal RPE）的微小RNA（miRNA）表达谱进行了比较。

摘要

本报告的目的是描述比较人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）、由人iPS细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞中微小RNA（miRNA）表达谱的实验方案。这些方案包括通过微阵列分析收集RNA，以及对微阵列数据进行分析，以鉴定在三种细胞类型间差异表达的miRNA。本文还解释了iPS细胞和胎儿RPE细胞的培养方法，并描述了将人iPS细胞分化为RPE细胞所用的实验流程。所介绍的RNA提取技术旨在最大程度地回收极小分子量RNA，以用于miRNA微阵列分析。最后，本文阐述了对微阵列数据进行细胞信号通路和网络分析的方法。这些技术将有助于比较三种不同细胞类型的miRNA表达谱。

引言

干细胞具有无限增殖的能力，并且能够分化为任何一种体细胞类型。将体细胞重编程为多能干细胞的技术发展，已在科研界和临床医学领域引起极大关注，因为个性化组织再生的时代即将到来¹诱导性多能干细胞（iPS细胞）具有与胚胎干细胞（ES细胞）相同的无限增殖潜能和多能性，同时避免了与胚胎干细胞相关的伦理争议。此外，患者来源的干细胞不会引发免疫反应，从而显著提高了治疗应用成功的可能性^2-3在特定的培养条件下，iPS细胞已被证实可分化为多种不同类型的细胞 体外包括心肌细胞、神经元、胰岛β细胞、肝细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）^4-12.

视网膜色素上皮（RPE）是位于视网膜后部的一层特化的色素性上皮细胞，具有多种对视觉健康和功能至关重要的作用，例如吸收散射光、吞噬光感受器外节段以及视黄醇类物质的代谢，以生成视觉发色团。由于损伤或疾病导致的RPE功能障碍会严重影响光感受器的健康和视觉功能，这一点在由RPE病变引起的致盲性疾病中得到了证实，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）、Stargardt病和视网膜色素变性（RP）¹³。目前尚未实现真正有效的恢复视力的治疗方法，而用健康的RPE替代病变的RPE可能是防止视力丧失的最佳选择^14-15。诱导多能干细胞来源的RPE（iPS-RPE）是一种潜在的细胞来源，可用于替代受损的RPE。iPS-RPE表达典型的RPE特异性蛋白，如LRA....

方案

1. 培养试剂和培养板的准备

1. mTeSR1 培养基：按照生产商说明配制 mTeSR1 培养基。在 4 °C 下过夜解冻 100 ml mTeSR1 5x 添加剂。将 100 ml mTeSR1 5x 添加剂加入 400 ml mTeSR1 基础培养基中，充分混匀。该培养基在 4 °C 可稳定保存最多 2 周，在 -20 °C 可保存 6 个月。
2. 分化培养基：在 DMEM/F12 中配制分化培养基，使其终浓度为 0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM 非必需氨基酸、2.0 mM L-谷氨酰胺、10% 去除血清（knockout serum）和 10 µg/ml 庆大霉素。
3. iPS-RPE 培养基：在 MEM 中配制 iPS-RPE 培养基，使其终浓度为 1x N1 添加剂、0.1 mM 非必需氨基酸、250 µg/ml 牛磺酸、13 ng/ml 三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml 氢化可的松、5 µg/ml 庆大霉素和 15% FBS²⁶。
4. 三碘甲腺原氨酸钠盐储备液：配制储备液时，将 1.0 mg 三碘甲腺原氨酸钠盐溶于 1 N 氢氧化钠中，轻轻旋转混匀。然后加入 49.0 ml 基础培养基，定容至 50.0 ml，得到浓度为 20 µg/ml 的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于 -20 °C 冻存备用。使用时根据需要加入适当体积以达到最终培养基中的目标浓度。
5. 氢化可的松储备液：配制氢化可的松储备液时，将....

结果

iPS 细胞（图 1A）在分化条件下培养，以诱导其分化为 iPS-RPE 细胞。iPS-RPE 表现出典型的 RPE 表型，呈六边形色素细胞形态（图 1B），与胎儿 RPE（图 1C）相似。

为了更好地理解miRNA在iPS细胞向iPS-RPE分化过程中可能发挥的作用，进行了miRNA表达的微阵列分析。使用mirVana miRNA分离试剂盒从iPS细胞、胎儿RPE细胞和iPS-RPE细胞中提取总RNA，以最大程度保留小分子RNA。RNA在杂交至微阵列芯片前进行定量并检测纯度。采用代表1,205种人类miRNA和144种病毒miRNA的探针，分析各组样本的miRNA表达情况。通过分析信号强度，确定各样本中各miRNA的相对表达水平。利用所得数据比较iPS-RPE与iPS细胞及胎儿RPE细胞之间的miRNA表达谱。生成热图以直观展示各组间miRNA表达的差异情况图2A）。与iPS-RPE相比，在iPS中差异表达的miRNA共有83个，其中47个在iP.......

讨论

综上所述，本报告描述了诱导多能干细胞（iPS细胞）、iPS来源的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞的培养方法。由iPS细胞衍生的RPE在形态和功能上均与胎儿RPE相似。iPS-RPE还表达典型的RPE相关基因，包括RPE65、CRALBP、PEDF和LRAT¹⁶。为了进一步表征这些细胞，提取RNA并进行微阵列分析，以鉴定差异表达的miRNA。信号强度分析显示，在胎儿RPE与iPS-RPE的比较中检测到的差异表达miRNA数量最多，提示iPS-RPE可能更为成熟。后续研究计划采用RT-PCR验证这些结果。

在本实验过程中，有几个关键步骤必须谨慎操作，以确保检测成功并获得准确的数据。第一个关键步骤发生在iPS细胞的培养过程中。iPS细胞必须保持在多能状态，以维持其干性。需每天仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及出现明显的特定细胞类型（如神经元和成纤维细胞）。已分化的单个细胞可通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mTeSR1 培养基 + 5X 补充剂	Stem Cell Technologies	5850
DMEM/F12	Life Technologies	11330-032
2-β-巯基乙醇	Sigma	M-7154
非必需氨基酸	Hyclone(Fisher)	SH30853.01
无血清替代物	Life Technologies	10828-028
庆大霉素	Life Technologies	15750-060
MEM 培养基	Life Technologies	10370-021
N1 补充剂	Sigma	N-6530-5ML
牛磺酸	Sigma	T-8691-25G
氢化可的松	Sigma	H0888-1G
胎牛血清	Hyclone(Fisher)	SH3008803HI
三碘甲腺原氨酸钠盐	Sigma	T6397
氢氧化钠	Sigma	S5881
胎儿视网膜色素上皮细胞培养基 RTEGM 试剂盒	Life Technologies	195406
分散酶	Life Technologies	17105-041
Matrigel	BD Biosciences	354277
磷酸盐缓冲液	Hyclone(Fisher)	10010-023
胰蛋白酶	Hyclone(Fisher)	25200-072
Miltenyi Biotec 洗涤缓冲液	StemGent	130-092-987
Miltenyi Biotec 冲洗缓冲液	StemGent	130-092-222
抗 TRA-1-60 磁珠分选试剂盒	StemGent	130-095-816
Miltenyi Biotec 细胞分选柱	StemGent	130-021-101
RNeasy 微量提取试剂盒	Qiagen	74004
QIA shredder	Qiagen	79654
RNA 6000 Pico LabChip 试剂盒	Agilent	G2938-90046
人 miRNA 微阵列 v16	Agilent	G4471A