需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

10.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51589

⸱

2014年6月24日

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

本文内容

摘要

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal RPE）的微小RNA（miRNA）表达谱进行了比较。

摘要

本报告的目的是描述比较人类诱导性多能干细胞（iPS细胞）、由人iPS细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞中微小RNA（miRNA）表达谱的实验方案。这些方案包括通过微阵列分析收集RNA，以及对微阵列数据进行分析，以鉴定在三种细胞类型间差异表达的miRNA。本文还解释了iPS细胞和胎儿RPE细胞的培养方法，并描述了将人iPS细胞分化为RPE细胞所用的实验流程。所介绍的RNA提取技术旨在最大程度地回收极小分子量RNA，以用于miRNA微阵列分析。最后，本文阐述了对微阵列数据进行细胞信号通路和网络分析的方法。这些技术将有助于比较三种不同细胞类型的miRNA表达谱。

引言

干细胞具有无限增殖的能力，并且能够分化为任何一种体细胞类型。将体细胞重编程为多能干细胞的技术发展，已在科研界和临床医学领域引起极大关注，因为个性化组织再生的时代即将到来1诱导性多能干细胞（iPS细胞）具有与胚胎干细胞（ES细胞）相同的无限增殖潜能和多能性，同时避免了与胚胎干细胞相关的伦理争议。此外，患者来源的干细胞不会引发免疫反应，从而显著提高了治疗应用成功的可能性2-3在特定的培养条件下，iPS细胞已被证实可分化为多种不同类型的细胞 体外包括心肌细胞、神经元、胰岛β细胞、肝细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）4-12.

视网膜色素上皮（RPE）是位于视网膜后部的一层特化的色素性上皮细胞，具有多种对视觉健康和功能至关重要的作用，例如吸收散射光、吞噬光感受器外节段以及视黄醇类物质的代谢，以生成视觉发色团。由于损伤或疾病导致的RPE功能障碍会严重影响光感受器的健康和视觉功能，这一点在由RPE病变引起的致盲性疾病中得到了证实，例如年龄相关性黄斑变性（AMD）、Stargardt病和视网膜色素变性（RP）13。目前尚未实现真正有效的恢复视力的治疗方法，而用健康的RPE替代病变的RPE可能是防止视力丧失的最佳选择14-15。诱导多能干细胞来源的RPE（iPS-RPE）是一种潜在的细胞来源，可用于替代受损的RPE。iPS-RPE表达典型的RPE特异性蛋白，如LRAT、CRALBP、PEDF和RPE65；呈现出典型的深色素化六边形RPE形态；并具备RPE功能，包括吞噬作用、视黄醇类物质的处理以及11-cis 视黄醛的分泌5,16。然而，在iPS-RPE可用于临床治疗之前，必须对其进行全面表征。了解调控RPE分化的因素，对于提高用于临床应用的细胞产量和纯度至关重要。

细胞分化是基因表达高度调控的结果。在分化和发育过程中，细胞命运的决定需要基因组的表观遗传重塑以及转录因子的协同作用17。微小RNA（miRNA）对信使RNA（mRNA）翻译的调控构成了影响细胞命运的另一层调控机制1。miRNA是一类短链核苷酸序列，长度约为22个核苷酸，可通过与mRNA的3’非翻译区（UTR）结合来抑制翻译，或促使mRNA降解。几乎在所有组织中都已检测到miRNA的存在；截至目前，miRBase数据库中已收录超过2000种独特的人类微小RNA。由于miRNA与靶标mRNA结合仅需部分互补配对，因此单个miRNA可能结合数十甚至数百个不同的靶标，反之亦然；即单个mRNA可被多个不同的miRNA靶向。这种广泛的结合特性极大地增加了调控网络的复杂性，也加大了确定单个miRNA功能及其在细胞功能中所起作用的难度18-21。尽管如此，研究显示miRNA可通过影响DNA甲基化状态，在分化过程中精细调控基因表达17。在一项更针对视网膜色素上皮（RPE）的研究中，miR-204/211被证明可促进RPE的上皮表型22。另一研究团队分析了胚胎干细胞（ES细胞）向RPE分化过程中RPE的miRNA表达谱，发现分化过程的不同阶段表达着特定的miRNA组合23。事实上，miRNA表达谱能够明确区分不同类型的细胞，包括ES细胞、前体细胞和终末分化的细胞24,25。视网膜中表达的miRNA超过250种。基于这些研究，我们提出假设：miRNA在诱导性多能干细胞（iPS）向RPE分化的过程中发挥着重要作用。

本报告的目的是描述从 IMR90-4 诱导多能干细胞（iPS 细胞）分化视网膜色素上皮（RPE）的实验方案、通过微阵列分析收集 RNA 的方法，以及对微阵列数据进行分析以鉴定在三种细胞类型（iPS 细胞、iPS-RPE 和胎儿 RPE）中差异表达的 miRNA。从每种细胞类型的培养物中提取总 RNA，并杂交至包含针对 1,205 种人类 miRNA 和 144 种病毒 miRNA 的特异性探针的 miRNA 微阵列。比较微阵列结果，以确定在不同细胞类型中差异表达的 miRNA。筛选出表达水平变化倍数 ≥2 倍的 miRNA 进行进一步分析。使用 miRNA 分析软件程序鉴定差异表达 miRNA 的潜在靶基因，并构建由所选 miRNA 调控的细胞网络。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 培养试剂和培养板的准备

  1. mTeSR1 培养基：按照生产商说明配制 mTeSR1 培养基。在 4 °C 下过夜解冻 100 ml mTeSR1 5x 添加剂。将 100 ml mTeSR1 5x 添加剂加入 400 ml mTeSR1 基础培养基中，充分混匀。该培养基在 4 °C 可稳定保存最多 2 周，在 -20 °C 可保存 6 个月。
  2. 分化培养基：在 DMEM/F12 中配制分化培养基，使其终浓度为 0.1 mM β-巯基乙醇、0.1 mM 非必需氨基酸、2.0 mM L-谷氨酰胺、10% 去除血清（knockout serum）和 10 µg/ml 庆大霉素。
  3. iPS-RPE 培养基：在 MEM 中配制 iPS-RPE 培养基，使其终浓度为 1x N1 添加剂、0.1 mM 非必需氨基酸、250 µg/ml 牛磺酸、13 ng/ml 三碘甲腺原氨酸钠盐、20 ng/ml 氢化可的松、5 µg/ml 庆大霉素和 15% FBS26。
  4. 三碘甲腺原氨酸钠盐储备液：配制储备液时，将 1.0 mg 三碘甲腺原氨酸钠盐溶于 1 N 氢氧化钠中，轻轻旋转混匀。然后加入 49.0 ml 基础培养基，定容至 50.0 ml，得到浓度为 20 µg/ml 的三碘甲腺原氨酸钠盐溶液。分装后于 -20 °C 冻存备用。使用时根据需要加入适当体积以达到最终培养基中的目标浓度。
  5. 氢化可的松储备液：配制氢化可的松储备液时，将 1 mg 氢化可的松溶于 1 ml 无水乙醇中，轻轻振荡助溶。然后加入 19.0 ml 基础培养基，定容至 20 ml，得到浓度为 50 µg/ml 的氢化可的松储备液。分装后于 -20 °C 冻存备用。使用时根据需要加入适当体积以达到最终培养基中的目标浓度。
  6. 胎儿 RPE 生长培养基：按照生产商说明，将 RTEGM 试剂盒中的所有组分加入基础培养基中混合配制生长培养基，但不添加 FBS。
  7. 胎儿 RPE 接种培养基：取少量生长培养基转移至无菌容器中，加入 FBS 至终浓度为 2%，即为接种培养基。
  8. Dispase 溶液：在 DMEM/F12 中配制浓度为 1 mg/ml 的 Dispase 工作液。
  9. Matrigel 包被板：在 DMEM/F12 中将 Matrigel 配制成 0.08 mg/ml 的溶液。
  10. 用 1.0 ml Matrigel 溶液包被 6 孔板的每个孔。
  11. 将包被好的板在室温下孵育 1.0 小时。
  12. 孵育 1.0 小时后，吸除多余的 DMEM/F12 溶液。
  13. 加入 0.5 ml mTeSR1 培养基以防止干燥。Matrigel 包被板现已可使用。

2. iPS 细胞培养

  1. 在接种iPS细胞之前，准备好所有离心管，将mTESR1培养基升温至室温，并准备好包被有Matrigel的培养板。
  2. 在37 °C水浴中快速解冻IMR90-4 iPS细胞。然后将冻存管从水浴中取出，并用70%乙醇进行表面消毒。
  3. 使用2 ml移液器将细胞转移至15 ml锥形离心管中，以尽量减少细胞团聚物的破碎。
  4. 逐滴加入5 ml预热的mTeSR1培养基，轻柔混匀。在室温下以300 × g离心5分钟，然后弃去上清液。
  5. 用2 ml mTeSR1培养基小心重悬细胞团聚物，并将细胞接种至六孔板的一个孔中。
  6. 将培养板放入37 °C培养箱中，在5% CO2、95%湿度条件下培养。
  7. 每天更换iPS细胞培养基。接种后5–7天可见未分化克隆。检查是否出现适合传代的未分化克隆（中心致密的克隆）。

3. iPS 细胞的传代

  1. 在开始传代iPS细胞之前，将所有离心管、dispase溶液、DMEM/F12和mTeSR1培养基预热至室温，并准备好包被有Matrigel的培养板。
  2. 传代iPS细胞前，通过刮除分化区域并吸除培养基来去除任何已分化的区域。为保证高质量的培养，分化区域应控制在孔内面积的20%以下。用2 ml DMEM/F12小心冲洗含有iPS细胞的孔，并向每孔加入1 ml浓度为1 mg/ml的dispase溶液。
  3. 在37 °C孵育7分钟。吸除dispase溶液，并用2 ml DMEM/F12轻轻冲洗细胞集落两次。
  4. 冲洗后，向每孔加入2 ml mTeSR1培养基。
  5. 使用5 ml移液器轻轻刮取培养板上的细胞集落，使其形成细胞团块。
  6. 将脱落的细胞集落转移至15 ml锥形管中。加入足量的mTeSR1培养基，用于接种下一次传代的细胞。

4. 将iPS细胞分化为iPS-RPE

  1. 将iPS细胞接种至新包被的培养板中，使用mTESR1培养基。
  2. 让iPS细胞集落体外培养扩增4-5天。
  3. 将mTeSR1培养基更换为4 ml分化培养基，每3 天更换一半培养基。
  4. 继续培养至色素灶生长至足够大，可进行手动显微解剖分离（约40-50天）。
  5. 使用200 µl移液枪头在色素集落周围切割并将其提起。
  6. 收集解剖下来的集落，并置于15 ml锥形离心管中合并。
  7. 向合并的RPE细胞中加入5 ml DMEM/F12培养基，以300 × g离心5分钟，重复两次。
  8. 通过将合并的iPS-RPE细胞与0.25%胰蛋白酶EDTA共同孵育，制备单细胞悬液。
  9. 用iPS-RPE培养基清洗iPS-RPE细胞，将收集的细胞以4 ml iPS-RPE培养基接种至新包被Matrigel的培养孔中。
  10. 细胞传代前培养3周，每3 天更换一次培养基。实验时以100,000个细胞/cm2的密度接种iPS-RPE细胞，于第17天收集细胞，以接种当天为第0天。

5. 样本采集

  1. iPS 细胞收集
    1. 培养 iPS 细胞，直至观察到未分化集落中心区域密集。
    2. 用 DMEM/F12 洗涤集落。
    3. 使用 accutase 将细胞解离为单细胞。将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，加入 2 ml DMEM/F12 重悬细胞。
  2. 胎儿 RPE 细胞收集
    1. 用 DMEM/F12 洗涤胎儿 RPE 细胞培养物，并使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 将细胞解离为单细胞。
    2. 将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，加入 2 ml DMEM/F12 重悬细胞。
  3. iPS-RPE 细胞收集
    1. 当 iPS-RPE 细胞传代至第 3 代和第 5 代时，在传代后第 17 天收集细胞。用 PBS 洗涤 iPS-RPE 细胞两次，加入 1.0 ml 0.25% 胰蛋白酶孵育，制备单细胞悬液。
    2. 加入 2 ml 冰冷的 iPS-RPE 培养基以中和胰蛋白酶活性。
    3. 将细胞收集至 15 ml 圆底离心管中，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清液。
    4. 将细胞悬液用磁珠分选试剂盒中的染色缓冲液重悬于 3 ml 中。

6. 去除未分化细胞的iPS-RPE阴性筛选

  1. 使用前将所有试剂保持在 4 °C，但操作时勿置于冰上。将步骤 5.3.4 中的细胞悬液在 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。
  2. 每 2 × 106 个细胞用 100 μl 微珠试剂盒中的染色缓冲液重悬细胞。
  3. 每 2 × 106 个细胞加入 10 μl Anti-TRA-1-60-PE 抗体。
  4. 充分混匀，在 4 °C 孵育 10 分钟。
  5. 每 2 × 106 个细胞用 1–2 ml 缓冲液洗涤细胞，在 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液。
  6. 每 2 × 106 个细胞用 80 μl 染色缓冲液重悬细胞。每 2 × 106 个细胞加入 20 μl 试剂盒中的抗-PE 标记微珠。充分混匀。在 4 °C 孵育 15 分钟。
  7. 每 2 × 106 个细胞加入 1–2 ml 染色缓冲液。在 300 × g 离心 10 分钟。吸除上清液。
  8. 将细胞重悬于 500 μl 染色缓冲液中。
  9. 磁性细胞分离：
    1. 将层析柱置于磁性细胞分选器中。用 3 ml 染色缓冲液冲洗层析柱。
    2. 将步骤 6.8 的细胞悬液加至层析柱上。
    3. 在负极出口处放置收集管，用于收集 TRA-1-60 阴性细胞。

7. 总RNA提取

  1. 使用专为核酸小量制备设计的商用微型离心柱式均质化器，裂解细胞。
  2. 使用可保留小RNA分子的商用RNA提取试剂盒，从iPS细胞、iPS-RPE和胎儿RPE中提取总RNA27。
  3. 使用Nanodrop分光光度计测定总RNA浓度。

8. 生物分析仪与微阵列实验

  1. 使用Bioanalyzer结合市售RNA质量检测试剂盒检测RNA完整性。
  2. 将100 ng总RNA与小牛肠碱性磷酸酶在37 °C孵育30分钟。
  3. 使用100% DMSO在100 °C变性RNA 5分钟。
  4. 利用T4连接酶在16 °C孵育1小时，用pCp-Cy3标记样品。
  5. 在8_x_15K格式的人类miRNA芯片上进行杂交。
  6. 根据制造商说明书洗涤芯片，并使用扫描仪以5 µm分辨率进行扫描。
  7. 使用与miRNA微阵列兼容的微阵列特征提取软件获取数据。
  8. 处理miRNA信号，以确定各样本中miRNA的相对表达水平。
  9. 比较各组样品间每个miRNA的表达水平。选择表达差异至少两倍的miRNA进行进一步分析。
  10. 使用市售数据分析软件，按照说明生成热图以可视化差异表达的miRNA28。

9. 通路分析

  1. 将8.9中选定的miRNA数据以Excel格式保存。
  2. 登录在线RNA通路分析程序，上传Excel文件。在文件格式中选择“Flexible Format”，在标识符类型下拉列表中选择“Agilent”。
  3. 在原始数据标题下，将“ID”分配给探针ID列，将“Observation 1”和“log ratio”分配给log ratio列，其余所有列均选择“ignore”。
  4. 按如下设置分析参数：置信度选择“仅实验观察到的”；包含直接和间接关系；包含内源性化学物质；选择Ingenuity Knowledge Base作为参考数据库；选择包含所有物种、所有细胞系和组织以及所有突变数据的参考分子数据库。
  5. 运行网络和通路分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

iPS 细胞（图 1A）在分化条件下培养，以诱导其分化为 iPS-RPE 细胞。iPS-RPE 表现出典型的 RPE 表型，呈六边形色素细胞形态（图 1B），与胎儿 RPE（图 1C）相似。

为了更好地理解miRNA在iPS细胞向iPS-RPE分化过程中可能发挥的作用，进行了miRNA表达的微阵列分析。使用mirVana miRNA分离试剂盒从iPS细胞、胎儿RPE细胞和iPS-RPE细胞中提取总RNA，以最大程度保留小分子RNA。RNA在杂交至微阵列芯片前进行定量并检测纯度。采用代表1,205种人类miRNA和144种病毒miRNA的探针，分析各组样本的miRNA表达情况。通过分析信号强度，确定各样本中各miRNA的相对表达水平。利用所得数据比较iPS-RPE与iPS细胞及胎儿RPE细胞之间的miRNA表达谱。生成热图以直观展示各组间miRNA表达的差异情况图2A）。与iPS-RPE相比，在iPS中差异表达的miRNA共有83个，其中47个在iP...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

综上所述，本报告描述了诱导多能干细胞（iPS细胞）、iPS来源的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿RPE细胞的培养方法。由iPS细胞衍生的RPE在形态和功能上均与胎儿RPE相似。iPS-RPE还表达典型的RPE相关基因，包括RPE65、CRALBP、PEDF和LRAT16。为了进一步表征这些细胞，提取RNA并进行微阵列分析，以鉴定差异表达的miRNA。信号强度分析显示，在胎儿RPE与iPS-RPE的比较中检测到的差异表达miRNA数量最多，提示iPS-RPE可能更为成熟。后续研究计划采用RT-PCR验证这些结果。

在本实验过程中，有几个关键步骤必须谨慎操作，以确保检测成功并获得准确的数据。第一个关键步骤发生在iPS细胞的培养过程中。iPS细胞必须保持在多能状态，以维持其干性。需每天仔细检查细胞是否出现分化迹象。未分化的iPS细胞以紧密的多细胞集落形式生长，具有较高的核质比和明显的核仁。iPS细胞集落具有清晰的边界，中心区域由多层细胞构成。分化迹象包括集落边界模糊、细胞形态不均一，以及出现明显的特定细胞类型（如神经元和成纤维细胞）。已分化的单个细胞可通...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文作者的观点或主张仅为个人见解，不应被视为官方立场，也不应解释为美国陆军部或国防部的观点。

本研究是在作者 Whitney A. Greene、Alberto Muñiz 和 Ramesh R. Kaini 于美国陆军医学研究与发展司令部（USAISR）担任国家研究委员会博士后研究协会成员期间完成的。

微阵列实验由位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心Greehey儿童癌症研究中心微阵列核心实验室和生物信息学部门完成。

本工作由美国陆军临床康复医学研究计划（CRMRP）和军事作战医学研究计划（MOMRP）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
mTeSR1 培养基 + 5X 补充剂Stem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-巯基乙醇SigmaM-7154
非必需氨基酸Hyclone(Fisher)SH30853.01
无血清替代物Life Technologies10828-028
庆大霉素 Life Technologies15750-060
MEM 培养基Life Technologies10370-021
N1 补充剂SigmaN-6530-5ML
牛磺酸SigmaT-8691-25G
氢化可的松SigmaH0888-1G
胎牛血清Hyclone(Fisher)SH3008803HI
三碘甲腺原氨酸钠盐SigmaT6397
氢氧化钠SigmaS5881
胎儿视网膜色素上皮细胞培养基 RTEGM 试剂盒Life Technologies195406
分散酶Life Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
磷酸盐缓冲液Hyclone(Fisher)10010-023
胰蛋白酶Hyclone(Fisher)25200-072
Miltenyi Biotec 洗涤缓冲液StemGent130-092-987
Miltenyi Biotec 冲洗缓冲液StemGent130-092-222
抗 TRA-1-60 磁珠分选试剂盒StemGent130-095-816
Miltenyi Biotec 细胞分选柱StemGent130-021-101
RNeasy 微量提取试剂盒Qiagen74004
QIA shredderQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip 试剂盒AgilentG2938-90046
人 miRNA 微阵列 v16AgilentG4471A

参考文献

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

胎儿RPERNA提取微阵列分析通路分析细胞分化细胞培养流式细胞术
人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。