一种可适应的斑马鱼反向遗传学方法，通过心室注射基因特异性吗啉代寡核苷酸，用于评估基因在发育后期及生理性稳态（如组织再生）过程中的功能。
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摘要
摘要
斑马鱼是研究器官和附属结构再生过程中细胞与分子生物学的重要模型。然而，目前尚未充分建立适用于反向遗传学的分子策略，以评估斑马鱼胚胎发生后幼体阶段的基因功能，或组织稳态中的基因作用，且斑马鱼幼体内的多个组织难以靶向。针对这些阶段尚无法以时间可控的方式对斑马鱼基因进行基因组靶向操作的问题，基因特异性吗啉代寡核苷酸（morpholino）心室注射提供了一种替代方法。该方法可实现吗啉代寡核苷酸在全身多种组织中的充分扩散与后续整合，包括此前难以触及的结构，例如常用于无创研究组织再生的幼体尾鳍。在幼体鳍褶再生过程中激活的多个基因，也在成年脊椎动物再生组织中表达，因此幼体是研究成体再生机制的有用模型。这种吗啉代寡核苷酸扩散方法可快速、简便地鉴定幼体组织再生及其他胚胎发生后调控组织稳态的生理过程所必需的基因。因此，该递送方法为胚胎发生后基因功能评估提供了目前亟需的时间可控策略。
引言
器官和附肢的再生对于生存和适应性至关重要；然而，包括人类在内的多种脊椎动物的再生能力十分有限。尽管目前已有一些具有强大再生能力的动物模型，但在这些模型中用于评估器官和附肢再生过程中基因功能的反向遗传学技术仍然非常有限或尚不存在。因此，需要开发新的方法来解析这些模式生物中再生过程的分子生物学机制。
斑马鱼是研究器官和附属结构再生过程中细胞与分子生物学机制的成熟模型1，这不仅因其具有显著的多种器官、组织和附属结构再生能力，还因为已有多种转基因鱼系可用于细胞示踪和基因构建体的过表达2,3。然而，斑马鱼幼体中的基因抑制主要局限于显性负性构建体的过表达，而这类方法并非适用于所有目标基因，且其转基因产物可能产生非生理性获得性功能效应，无法真实反映基因的内源性活性。因此，需要一种替代方法，通过基因敲除或基因沉默特异性地消除基因表达，以克服上述问题。
利用TALENs进行基因特异性靶向是一种通过反向遗传学手段敲除基因功能的方法；然而，这种敲除策略通常仅限于在早期胚胎发育过程中进行功能评估，因为基因的早期必需性会阻碍胚胎发育的进一步进行。因此，使用TALENs无法研究发育完成后诸如再生或器官稳态等后期生物学现象4,5。因此，需要一种替代的基因去除策略，能够在早期发育之后靶向基因功能，以评估基因在完全形成的器官和结构中的必要性。
研究表明，吗啉寡聚核苷酸注射在少数成体器官及成体再生鳍中具有靶向基因的作用6-8，但这些方法需要电穿孔，而许多内脏器官由于位置较深或对电刺激敏感，难以进行有效的电穿孔。此外，某些幼体组织也难以直接注射，因为直接注射可能破坏其结构完整性，或因其体积过小而受限。幼体的尾鳍即属于此类结构，因其鳍褶无法进行直接注射。因此，需要一种替代电穿孔和直接注射的方法，以实现对过小而无法注射或无法电穿孔的组织中基因的靶向操作。
为了在幼体尾鳍再生过程中靶向并抑制特定基因的功能，我们改进了现有的吗啉代寡核苷酸（morpholino）技术，从而能够在晚期幼体阶段研究尾鳍再生过程中的基因功能。该方法采用心室腔内递送9荧光素标记的吗啉代寡核苷酸，并联合使用Endo-Porter转染试剂10。一旦注入心室，吗啉代寡核苷酸与Endo-Porter的混合物便通过血液循环迅速扩散至整个幼体，并进入以往难以靶向的组织。该注射方法可进一步优化，以实现特定组织中基因的靶向抑制，并且很可能适用于目前尚缺乏反向遗传学手段来抑制基因功能的其他动物模型。因此，该技术提供了一种快速、简便的方法，具有广泛的应用潜力，可用于立即研究幼体阶段器官稳态维持及再生过程中的基因功能。
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方案
1. 玻璃针的制备（图1）
- 使用直径为 0.75 mm 的玻璃毛细管制备注射针（图 1A）。
- 将玻璃毛细管放入拉针仪中，使用以下参数拉制针头：加热循环值：463；拉伸循环值：230；速度：150 毫秒；时间：150 毫秒（图 1B）。
- 在带有微米目镜的体视显微镜下，使用钟表匠镊子折断拉制好的玻璃毛细管，制成直径为 20 µm 的针尖。
- 使用带有湿润橡胶旋转轮的车床对针头进行打磨，形成 20 µm 的斜面（图 1C 和 图 1D）。注意：锋利且带有斜面的针头可更轻松地插入脑室，从而最大限度减少组织损伤，并使穿刺后的肌肉在针头拔出后能够重新闭合（图 1E-G）。
2. 反义吗啉环寡核苷酸溶液的制备
- 将冻干的吗啉代寡核苷酸溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为7.5 mM的吗啉代储备液。[具体操作详见生产商说明书（参见材料表）]。
- 取2.5 µl吗啉代储备液（7.5 mM）与2.8 µl Endo-Porter储备液（1 mM）混合，配制吗啉代注射溶液，终浓度为3.5 mM吗啉代和0.5 mM Endo-Porter（参见 材料表）。
3. Morpholino 注射液的制备（图 2）
- 使用带有10 µl微量加样吸头的微量移液器，将5 µl该溶液装入斜面玻璃针中。
- 将玻璃针插入连接至气动皮升泵的显微操作器针夹中（图2A-C）。
- 将针夹放置在显微镜旁，使玻璃针仅需在一个平面方向移动即可插入幼虫的心室（图2A）。
- 调整注射角度至约45°。
- 设定显微注射仪参数如下：维持压力：20磅每平方英寸（psi）；喷射压力：15 psi；门控时间范围：100毫秒，周期值1.9（对应10.9毫秒）。
- 使用标准微波炉将琼脂糖在1×PBS中融化，制备20 ml的1.5%（w/v）凝胶。将融化的凝胶倒入10 cm培养皿中。将带有凹槽的注射模具放入温热的琼脂糖中，待其凝固后形成凹槽，用于放置麻醉后的幼虫11（图2D和2E）。
4. 注射（图3）
- 将幼虫置于含有 20 mg/L 三卡因（L-乙基-m-氨基苯甲酸甲烷磺酸盐）的 100 ml 水族箱水中进行麻醉，直至其对触碰无反应。
- 使用塑料巴斯德吸管小心地将麻醉后的幼虫转移至湿润琼脂糖模具的凹槽中，使幼虫腹侧紧贴凹槽的垂直琼脂糖壁（图 3A）。
- 将琼脂糖平板置于体视显微镜下，使心室朝向远离注射针的方向（图 3A）。
- 降低针头，将其插入心脏心室，插入深度仅为 1–2 µm，注意避免插入过深（图 3B 和 图 3C）。
- 针头插入后，以 4–6 次脉冲将吗啉寡核苷酸溶液注入心室，每次脉冲注入 3 nl 溶液，脉冲之间留有间隔，以便心脏内容物排出（图 3D 和 图 3E）。
- 注射完成后，将针头沿插入平面平行方向抽出，然后使用装有 E3 培养基的塑料巴斯德吸管小心地将幼虫转移回含有新鲜 E3 培养基的培养皿中。
- 将针头放入盛有 1× PBS 的培养皿中，以防止在转移已注射幼虫时针头干燥。
- 在实验期间，每隔 12–24 小时重复步骤 4.1–4.6 。注意：重复注射可确保吗啉寡核苷酸在细胞中的摄取和维持。
5. 注射分析（图4）
- 将鱼置于含有20 mg/L三卡因的100 ml养殖水体中麻醉，直至其对触碰无反应。
- 将幼虫侧向放置于盛有E3培养基的湿润1.5%（w/v）琼脂糖平板上。
- 使用体视显微镜进行明场和荧光成像观察幼虫。注意：由于幼虫具有透明性，荧光素标记的吗啉代寡核苷酸在注射后可直接在动物全身的血管中呈现绿色荧光。15分钟后，该荧光将进一步扩散至血管化组织中。 (图4A-4C).
6. 再生出芽的评估
- 使用 Fiji Image J 免费软件（http://fiji.sc/Fiji）评估捕获的图像。为研究再生情况，使用线条追踪工具测定对照组和注射吗啉代寡核苷酸（morpholino）的幼虫中发生的再生生长量。
- 为校准图像，通过将原始图像文件拖放到主 Fiji 窗口中来打开其中一个文件。
- 为设置后续所有图像的标尺，请在主菜单中选择 "Analyze" 选项。
- 在下拉菜单中点击 "Set scale"。
- 在此窗口中，通过勾选复选框启用 "Global" 选项。
- 再次通过拖放方式打开需要测量再生生长量的图像（参见步骤 6.1）。
- 在工具栏中选择 "freehand selections" 工具。
- 圈出待测区域（图 4J-4L）。
- 按下 Ctrl+M。这将打开一个新的 "Results" 窗口，显示所圈区域的面积（单位为平方像素）。
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结果
当从背侧进针时，锋利的斜面注射针可轻松插入斑马鱼幼鱼的心室（图3A）。尽管针头存在于心脏内，心脏仍持续跳动，血流得以维持（图3B 和 图3C）。即使将吗啉代注入心脏（图3E），谨慎的操作注射也不会破坏心室形态或心脏收缩活动（图3D）。
数分钟内，吗啉代寡核苷酸-Endo-Porter 溶液通过脉管系统分布至全身（图 4A 和 图 4B）。随后，吗啉代寡核苷酸从脉管系统分布到不同组织中，例如鳍褶和脑组织，并至少持续 12 小时或更长时间，这一点可通过荧光观察证实（图 4C）。
在此方法中，我们去除鳍褶的远端尖端、脊髓的远端尖端、远端躯干肌肉、远端脊索以及色素细胞（图4D 和 4H）；由于这些组织...
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讨论
脑室内注射提供了一种快速且可靠的评估方法，用于检测基因在发育后期或机体稳态过程中的功能，同时不影响胚胎发生期间的基因功能。为确保该技术的成功，需注意四个关键点：1）针头尺寸，2）防止针头干燥，3）最小化注射体积，4）尽量缩短在镇静溶液中的暴露时间。过小的针头 会频繁堵塞，而过大的针头则会损伤心室并导致大量出血。尽管推荐使用20 µm的针头，但针头直径绝不可超过心室腔大小的五分之一。第二个关键点是防止针头干燥和堵塞。由于针头尺寸较小，且在麻醉、转移和固定幼体过程中不可避免地频繁暂停，足以导致针尖处的吗啉寡核苷酸干燥，从而堵塞针头。为防止这种情况，可将针头浸入盛有1×PBS的培养皿中。第三个关键点是避免因注射体积过大而导致心室过度膨胀。如果剂量受限于针头尺寸，则 增加注射次数始终优于增加注射体积：较大体积可能导致心脏拉伸损伤。第四个关键点是麻醉程度。麻醉时间应根据操作所需时长来确定。幼体可以保持 在麻醉液中，幼鱼会保持数分钟的镇静状态，因为它们体质较强，复苏也较为容易。然而，若将幼鱼在麻醉剂中停留时间过长，会影响其恢复；时间过短，则可能导致其在注射过程中苏醒。因此，应仅麻醉在4分钟内能够完成注射的幼鱼数量。&#...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助，我们感谢Ayele Tsedeke Taddese提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带有 3´荧光素标记的吗啉代寡核苷酸 | Gene Tools 公司 | 定制 | 更多信息请访问 www.gene-tools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools 公司 | 更多信息请访问 www.gene-tools.com | |
| 琼脂糖 | Serva | 120623 | 用于制备培养皿，以在注射和成像过程中放置斑马鱼 |
| 三卡因（L-乙基-m-氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐） | Applichem | 用于麻醉 | |
| E3 培养基（5 mM NaCl；0.17 mM KCl；0.33 mM CaCl2；0.33 mM MgSO4） | 用于幼鱼饲养 | ||
| 培养皿 | Sarstedt | 821.472 | 用于在注射和成像过程中放置斑马鱼 |
| 薄壁玻璃毛细管 | World Precision Instruments 公司 | TW100F-3 | 用于制备注射针头 |
| 微量移液器加样尖（Microloader） | Eppendorf | 5,242,956,003 | 用于向针头中加样 |
| 巴斯德吸管（3 ml/1 ml） | Brand | 747760/ 74775 | 用于转移幼鱼 |
| Flaming/Brown 型针头拉制仪 | Sutter | 更多信息请访问 www.sutter.com | |
| 钟表匠镊子（Dumont 镊子，5 号） | World Precision Instruments 公司 | 501985 | 用于在磨针前折断针尖 |
| 解剖显微镜 | Olympus、Leica、Zeiss | 根据制造商不同而异 | 整体注射装置的组成部分 |
| 荧光相机 | Olympus、Leica、Zeiss | 根据制造商不同而异 | 用于注射后成像荧光信号 |
| PicoNozzle 套件（微注射器固定架） | World Precision Instruments | 5430-12 | 用于微注射 |
| 气动 PicoPump（微注射器） | World Precision Instruments | SYS-PV820 | 用于微注射 |
参考文献
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish: a practical approach. 261, University Press. Oxford. 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D'Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
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