用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

摘要

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH) 染色的斑马鱼胚胎样本。

摘要

斑马鱼胚胎现已被广泛用于基础和生物医学研究，以探讨发育过程的遗传调控机制，并建立先天性异常的模型。在生命的第一天内，斑马鱼胚胎会经历多个发育阶段，包括受精、卵裂、原肠形成、体节分化，以及肾脏、心脏和中枢神经系统等结构的器官发生。由于斑马鱼胚胎在发育过程中与一个球形的卵黄团紧密相连，其早期胚胎的解剖结构为许多发育事件中相关组织的观察与分析带来了挑战。因此，为了准确分析和成像尾芽期至20体节期（分别为受精后10小时和19小时）之间固定胚胎样本中的实验表型（例如经整体染色处理的样本），需要采用特定的技术手段。 原位 原位杂交（WISH）中，通常需要将胚胎从卵黄球中取出，并将其平铺在载玻片上。然而，平铺操作过程可能较为繁琐。因此，通过直观演示解剖技术，并使用有助于优化组织处理的试剂，可显著提高平铺制备的成功率和效率。本文提供了在斑马鱼胚胎中进行单色或双色基因表达检测的WISH实验方案，并演示了如何对染色后的固定样本进行平铺操作。该平铺方案广泛适用于研究斑马鱼早期发育过程中多种胚胎结构，且可与其他针对固定胚胎样本的染色方法联合使用。

引言

斑马鱼（Danio rerio）已成为发育生物学研究中广泛使用的模式生物。斑马鱼是一种属于鲤科（Cyprinidae）的热带淡水脊椎动物。最初，斑马鱼被用于环境研究，以评估潜在水污染物的危害，因其易于获取、成本低廉且易于饲养¹。在过去的三十年中，斑马鱼因其多种优势而被公认为一种遗传操作便利的脊椎动物模型系统。斑马鱼在解剖结构和生理功能方面与包括哺乳动物在内的高等脊椎动物具有高度保守性^2,3。近期的基因组序列注释表明，约70%的人类基因在斑马鱼中至少存在一个同源基因⁴。例如，已在两种物种间鉴定出许多在肾脏发育过程中发挥重要作用的直系同源基因^5-7。这种在细胞和分子生物学层面的高度保守性，使研究人员能够在斑马鱼中建立多种人类疾病的模型⁸，并且斑马鱼已成为利用化学遗传筛选手段鉴定潜在药物疗法的重要工具⁹。

此外，斑马鱼模型不仅能够重现人类中存在的多种复杂发育过程和疾病状态，还具备其他多项优势，使其成为胚胎学研究中极具吸引力的模式生物。斑马鱼为卵生动物，通过散播式产卵进行繁殖，使研究人员能够从受精开始就便捷地获取胚胎¹⁰。其他优势还包括胚胎体积适中、通体透明以及快速的体外发育过程¹⁰。此外，成年斑马鱼繁殖力高，通常每周可产下数量相对较多的卵，每窝产卵数一般在200至500枚之间，这使得研究人员能够轻松开展高通量实验，例如基于表型的化合物筛选⁹。

尽管斑马鱼模型展现出诸多优势，但在分析和呈现其早期发育阶段的实验结果时仍存在一些挑战。在某些情况下，斑马鱼胚胎固有的解剖结构可能会影响数据的可视化效果。受精后，初始细胞随着发育进程经历多次卵裂事件¹¹。原肠胚形成之后，在尾芽期（10 hpf）胚胎体轴出现，并围绕卵黄包裹成形¹¹。随着发育进入体节期，躯干部分不仅体积增大，还通过轴向伸长使尾部以及部分卵黄囊从中央卵黄团块中延伸出来¹¹。在尾芽期至20个体节期（19 hpf）之间，由于胚胎的几何形态以及卵黄囊的不透明性，使用如WISH等染色方法后，对特定发育特征的观察和拍照均可能变得困难。克服这些困难的一种方法是去除卵黄，然后将胚胎压平为二维样本，以便更直接地进行分析。

以下方案及视频资源介绍了在固定和染色后如何成功去除卵黄并进行胚胎平铺装片，以单色或双色WISH染色为例。WISH是一种广泛应用的技术，可用于检测保存样本中的特定核酸，从而定位基因在组织中的表达部位。WISH技术已有广泛描述，可使用多种显色底物以及荧光检测系统^12-20。本文提供了我们改良的WISH方案，适用于尾芽期至体节期发育阶段的斑马鱼胚胎。然而，其他WISH方案也可与本文所述的平铺装片步骤兼容，具体将在下文方案开始处予以说明。此外，平铺装片还可结合多种现有的可视化技术使用，例如整体免疫组织化学染色或细胞谱系示踪标记，但这些技术不在本方案的描述范围内。总体而言，平铺装片技术有助于更有效地分析和展示斑马鱼胚胎发育最早阶段实验所获得的数据。

方案

本方案中涉及的斑马鱼胚胎操作程序已获得圣母大学机构动物护理与使用委员会的批准。注意：第1至第5部分所述的操作步骤用于生成本文代表性结果中提供的胚胎图像。第1至第5部分中描述的程序可根据需要替换为其他WISH程序^12-16，或其他可视化技术，例如使用特异性抗体对特定蛋白质进行免疫组织化学标记。在采用第1至第5部分所述方案对WISH处理的斑马鱼胚胎进行平铺封片时，最初的胚胎固定以及最终染色后的固定步骤是影响能否成功去除样本中卵黄颗粒的关键操作。为获得最佳的平铺封片效果，建议初始固定使用 freshly thawed 的冰冻4%多聚甲醛（PFA）/1x PBS溶液，而WISH染色反应后的最终固定则使用冰冻4% PFA/1x PBS溶液（无需freshly thawed）。当将替代染色方法与第6至第8部分结合使用时，建议读者考虑此因素。

1. 胚胎收集、固定与保存

1. 通过将成年斑马鱼雄鱼和雌鱼放入系统水中并用隔板隔开，准备交配笼过夜。
2. 移除成虫之间的隔板，并在交配后约15–30分钟内使用细金属网茶筛收集受精卵，以获取胚胎发育阶段相近的卵块。
3. 将滤网倒置，用喷瓶挤出的细流E3溶液冲洗其表面，以将胚胎转移至含有约25 ml E3溶液的培养皿中。
4. 收集卵块后，将其分装至多个培养皿中，每皿约含50–60个胚胎，并加入25 ml E3溶液进行培养。注意：胚胎密度过高可能导致同一批次内胚胎发育严重不同步，应避免过度拥挤，以确保能及时收集到目标发育阶段的胚胎。
5. 在28.5 °C下孵育胚胎，以便根据斑马鱼标准分期系列进行发育评估¹¹.
6. 使用塑料移液管小心地将选定时间点（最多至20体节期，19 hpf）所需数量的胚胎转移至平底微量离心管中。注意：操作早期胚胎时需格外小心，因其较为脆弱，易因移液管挤压或剧烈操作而受损。 alternatively，可使用玻璃小瓶进行胚胎的固定和后续处理。在后续所有实验步骤的洗涤过程中均可使用塑料移液管，但核糖探针的添加与去除步骤（步骤3.11、3.14）除外。
7. 更换为预冷的含4% PFA的1x PBS溶液，将胚胎连同其绒毛膜在4% PFA/1x PBS中于室温固定4小时，或于4 °C过夜。注意事项：PFA具有毒性，配制和使用PFA溶液时应在通风橱内操作，并穿戴适当个人防护装备，包括手套和实验服。此外，配制母液时需格外小心处理PFA粉末，即使是颗粒状PFA也可能因静电而扩散。通常通过将1x PBS加热至沸腾以溶解PFA粉末来配制PFA溶液，随后将溶液分装并储存在-20 °C。若4% PFA/1x PBS溶液冷却后出现细微沉淀，应在分装冷冻保存前通过0.45 µm滤器系统过滤除菌。仅使用新鲜配制或新鲜解冻的PFA溶液进行本实验的初始固定步骤。即 胚胎的初次固定
8. 去除固定液，用1×PBST清洗胚胎两次，然后转移至孵育皿中。
9. 在体视显微镜下观察胚胎，使用两对精细镊子去除包围胚胎的卵膜，其中一对镊子用于轻柔地撬动胚胎，另一对镊子用于撕开卵膜。

2. 胚胎通透化

1. 将去壳的胚胎转移回微量离心管或玻璃小瓶中，然后用1×PBST冲洗两次，以去除残留的卵壳碎片。
2. 吸除1×PBST，并用100%甲醇（MeOH）洗涤胚胎两次。
3. 将胚胎置于-20 °C下至少20分钟。注意：胚胎可在MeOH中于-20 °C保存一年或更长时间。甲醇会使卵壳变黏，因此除非已完全去除卵壳，否则不得进行此步骤。
4. 通过吸除100% MeOH，在室温下依次用50% MeOH/1×PBST、30% MeOH/1×PBST各洗涤5分钟，再用1×PBST洗涤两次，以重新水化胚胎。
5. 制备新鲜的蛋白酶K工作液（5 µg/mL），即将25 µL freshly thawed蛋白酶K储备液（10 mg/mL）加入50 mL 1×PBST中混匀。
6. 吸除胚胎中的1×PBST，替换为蛋白酶K工作液，并根据胚胎发育阶段孵育：<= 5个体节孵育1分钟；10–12个体节孵育1.5分钟；15个体节孵育2分钟；20个体节孵育3分钟。
7. 吸除蛋白酶K工作液，并用1×PBST洗涤胚胎两次。
8. 吸除1×PBST，替换为冰上预冷的4%多聚甲醛（PFA）/1×PBS溶液，在室温下固定至少20分钟。

3. 核糖探针合成、预杂交、杂交及探针去除

1. 组装反义RNA探针 体外 在1.5 ml微量离心管中，于室温下进行转录反应，同时将酶置于冰上保存，加入含有目的基因对应序列的DNA模板（100–200 ng PCR产物或1.5 µg线性化DNA质粒，制备方法如前所述）^12,13），2 µl 地高辛或荧光素标记的核糖核苷酸，2 µl 相应的RNA聚合酶（SP6、T3、T7，根据PCR产物中插入或质粒DNA上存在的序列选择），2 µl 10x转录缓冲液，0.5 µl RNase抑制剂，用分子级去离子水（无DNase、RNase）补至总体积20 µl。注意：10x转录缓冲液应预先在37 °C水浴中温育10–20分钟，然后涡旋振荡，以确保所有组分完全溶解。若出现白色絮状沉淀，需再孵育5–10分钟并再次涡旋。若转录缓冲液未充分溶解并混匀，可能导致转录反应失败或产量低下。
2. 将各组分混合，每种反应体系置于水浴中37 °C孵育2小时。
3. 从水浴中取出反应管，向每个样本中加入5 µl 10x DNase I缓冲液、2 µl DNase I酶和23 µl分子生物学级蒸馏水，使总体积达到50 µl，以降解DNA模板；随后将各管置于水浴中37 °C孵育20分钟。
4. 在每个微量离心管中进行乙醇沉淀，加入5 µl 3 M乙酸钠（pH 5.2）和110 µl冰冻的100%乙醇，随后加入1 µl糖原母液以利于后续步骤中RNA沉淀的观察，然后将离心管置于-20 °C孵育至少1小时或过夜。
5. 将每个微量离心管在4 °C下以最大速度离心20分钟，然后弃去100%乙醇上清液，加入100 μl预冷的70%乙醇。
6. 将每个微量离心管在 4 °C 下离心 5 分钟，然后弃去 70% 乙醇上清液，将沉淀在空气中干燥 5 分钟。最后加入 100 µl 分子生物学级蒸馏水重悬沉淀，并使用 Nanodrop 分光光度计测定核糖探针储备液的浓度。注意：一旦沉淀完全溶解，核糖探针储备液应置于冰上，并于 -20 °C 保存。
7. 为准备固定胚胎的预杂交过程，从每个样品中移除4% PFA/1x PBS，并用1x PBST将胚胎洗涤两次。
8. 将25至40个胚胎转移至含有1×PBST的单个平底微量离心管中。注意：胚胎过多会导致后续染色不均，应谨慎控制每管胚胎数量，约为40个。
9. 将每管中的1x PBST替换为500–1,000 µl HYB+。
10. 将装有胚胎的管子放入设定为70 °C的烘箱中，在此温度下孵育4小时，以进行预杂交。
11. 将100–500 ng核糖探针（地高辛和/或荧光素标记）加入500 µl新鲜HYB+溶液中，配制核糖探针/HYB+溶液，并在进行步骤3.11前于70 °C孵育至少20分钟以预热。注意：若需同时检测多个基因转录本（采用单色和/或双色显色标记），则对应于这些基因的各核糖探针需混合成单一的核糖探针/HYB+混合液。
12. 移除各管胚胎中的预杂交液 HYB+，并加入足量的核糖探针/HYB+ 混合液以完全覆盖胚胎。注意：通常每管平底微量离心管中的胚胎需要 200–250 µl 核糖探针/HYB+ 混合液方可充分覆盖。添加和移除核糖探针/HYB+ 混合液时，通常使用移液器配合带屏障的吸头，以防止样品间的交叉污染。
13. 在70 °C下用ribroprobe/HYB+孵育胚胎过夜。
14. 准备以下洗液，并在70 °C预热过夜：50%甲酰胺/2x SSCT、2x SSCT和0.2x SSCT。注意：建议每种洗液配制50 ml分装液，多余部分可室温保存，后续可重新加热用于后续实验。
15. 用移液器和带滤芯的吸头移除核糖探针/HYB+，并于 -20 °C 保存。注意：通常每份核糖探针/HYB+ 混合液可多次使用（例如，3次或以上）而不减弱信号。尽管重复使用核糖探针/杂交缓冲液（HYB+）可降低背景，但需注意重复使用的核糖探针混合物可能发生降解。
16. 用50%甲酰胺/2x SSCT在70 °C下洗涤胚胎两次，每次30分钟。
17. 用2x SSCT在70 °C下洗涤胚胎一次，持续15分钟。
18. 用 0.2x SSCT 在 70 °C 下洗涤胚胎两次，每次 30 分钟。
19. 移除0.2x SSCT，并在室温下用MABT洗涤胚胎两次。

4. 抗地高辛抗体孵育与检测

1. 配制新鲜的封闭液。
2. 移除 MABT，替换为封闭液。
3. 将胚胎在封闭液中于室温孵育2-4小时。注意：较长的封闭孵育时间可为早期斑马鱼胚胎阶段提供最佳结果（<15 个体节）。进行长时间的封闭步骤时，在室温下封闭 8–12 小时，或在室温下孵育一段时间（最多约 8 小时）后，于 4 °C 过夜孵育。
4. 用新鲜的封闭液将抗地高辛抗体溶液按5,000倍稀释例如，每5 ml封闭液加入1 µl。
5. 移除封闭液，加入一抗/封闭液。
6. 用锡箔纸包裹样品，于4 °C孵育过夜，或于室温孵育4小时。
7. 移除抗地高辛/封闭液，并用 MABT 至少洗涤胚胎 10 次。注意：将胚胎转移至 12 孔板中进行 MABT 洗涤。此操作可提高洗涤速度，适用于处理大量样本，同时便于在体视显微镜下监测染色反应进程（步骤 4.11）。注意：在此步骤中，可将胚胎在 4 °C 条件下于 MABT 中过夜孵育，即“加强洗涤”，此处理适用于背景信号较高的探针，或在工作时间内需要长时间监测染色效果的情况，之后再进行步骤 4.8。
8. 配制预染缓冲液和所需的染色液（紫色或红色底物）。
9. 移除 MABT，然后在预杂交缓冲液中于室温下洗涤胚胎 5 分钟。
10. 移除预染缓冲液，加入染色液。
11. 每15-30分钟在体视显微镜下观察胚胎的染色情况，以监测室温下染色反应的进程。注意：若需延长染色完成时间，可将样品转移至4 °C以减缓反应速度。然而，一旦样品冷却至4 °C，反应无法通过恢复至室温而重新加速。
12. 染色反应完成后，移除染色液，加入1x PBST缓冲液。
13. 用1×PBST洗涤两次，每次5分钟。注意：若无需使用另一种底物检测其他基因，则将样品置于冰上预冷的4% PFA/1×PBS中固定至少20分钟，随后进行步骤6.1；否则直接进行步骤5.1。

5. 抗荧光素抗体孵育与检测

1. 除去1x PBST，用0.1 M甘氨酸（pH 2.2）在室温下洗涤胚胎两次，每次15分钟。注意：甘氨酸洗涤的时间对于完全终止第一次染色反应至关重要。
2. 移除0.1 M甘氨酸，用MABT在室温下洗涤胚胎两次，每次5分钟。
3. 用新鲜封闭液将抗荧光素抗体溶液稀释5,000倍，配制抗体工作液例如，每5 ml封闭液加入1 µl。
4. 移除 MABT，加入抗体/封闭液。按照步骤 4.6–4.13 进行荧光素标记的核糖探针检测。注意：当最终染色反应完成后，必须使用冰上预冷的 4% PFA/1X PBS 对样品进行最后一次固定。使用温度较高的 PFA 溶液固定容易导致卵黄黏连，从而在平铺标本制备过程中的解剖和去卵黄步骤中难以将卵黄从胚胎上清除。

6. 胚胎解剖及胚胎初步去卵黄

1. 选择一个已固定并染色的胚胎用于平展封片。
2. 使用移液器将选定的胚胎样本放入含有1x PBST的塑料或玻璃培养皿中。
3. 将培养皿置于体视显微镜下，用一对精细镊子或睫毛工具轻轻滚动胚胎，使其呈现侧视角度，并能观察到头部和尾部末端。
4. 用一对精细镊子在胚胎头部与尾部之间的卵黄中央位置做一切口，同时用另一对精细镊子固定胚胎，以提供切割卵黄所需的支点。注意：也可在卵黄上做两个主要切口，一个靠近胚胎头部，另一个靠近尾部。
5. 使用精细镊子和/或睫毛工具将卵黄细胞腔内的卵黄挖出。
6. 用1x PBST轻轻冲洗胚胎，以去除残留的卵黄。

7. 胚胎的精细去卵黄处理

1. 将胚胎转移至载玻片上，加入1-2滴1x PBST。
2. 使用睫毛工具和精细镊子，轻轻调整胚胎位置，使其腹面（卵黄面）朝上，平放在载玻片上。
3. 用睫毛工具将胚胎拖至1x PBST溶液边缘，使其紧贴载玻片并保持平展状态。
4. 用睫毛工具轻轻刮除胚胎腹面，以去除卵黄颗粒，同时避免撕裂胚胎；刮除过程中需用精细镊子固定胚胎。注意：去除卵黄颗粒可能需要重复刮除5-10分钟。
5. 若PBST溶液中卵黄过多或开始蒸发，可使用塑料或玻璃移液管向载玻片添加1-2滴新鲜的1x PBST，并将胚胎移至清洁溶液区域，继续去除残留卵黄颗粒。
6. 当卵黄基本去除后，使用移液管将胚胎轻柔转移回盛有1x PBST的塑料或玻璃培养皿中，进行最终冲洗，以清除散在的卵黄颗粒。
7. 使用塑料或玻璃移液管将去卵黄的胚胎转移至盛有100%甘油的塑料或玻璃培养皿中。
8. 将胚胎在100%甘油中孵育约5分钟，使其适应甘油环境。

8. 玻片封片

1. 将去卵黄的胚胎转移至洁净的载玻片上，加入1-2滴100%甘油。
2. 将胚胎腹面（原卵黄面）朝下贴附于载玻片。
3. 使用睫毛工具将胚胎拖至甘油液滴边缘，使其紧贴载玻片并保持平展状态。若胚胎轴线弯曲，可用精细镊子在残留的卵黄细胞膜上轻轻做微小切口以释放张力，从而使胚胎在载玻片上平展且轴线伸直。
4. 在18 × 18 mm的盖玻片四角放置少量塑型粘土。注意：也可用少量真空脂¹⁵替代塑型粘土。
5. 缓慢倾斜地将盖玻片覆盖在胚胎上，以尽量减少甘油周围产生气泡。
6. 在盖玻片边缘再添加一滴100%甘油，以填充盖玻片与载玻片之间的空隙。
7. 缓慢而小心地按压盖玻片的四个角，使胚胎牢固固定于载玻片之间，防止移位。注意：切勿压碎胚胎。
8. 若胚胎位置不理想，可用精细镊子取下盖玻片，使用睫毛工具重新调整胚胎位置，或用精细镊子进行额外切口，以便重新定位胚胎。重复步骤8.4–8.7。
9. 使用体视显微镜或复式显微镜观察和/或成像样本。
10. 将平铺封片标本置于纸板载片盒中，平放于4 °C避光保存数周，或暂时在室温下保存。注意：WISH染色会随时间逐渐褪色，尤其是红色底物反应，且无法在甘油中永久保存。与PFA相比，紫色染料在甘油中也更容易褪色（见步骤8.11）。有趣的是，已有文献报道，将胚胎封片于Permount中而非甘油中，可实现室温下的长期保存¹⁵。
11. 对于紫色底物染色样本的长期保存，需取下盖玻片，用1×PBST清洗胚胎两次，然后转移至含4% PFA/1×PBS的微量离心管中进行长期保存。注意：也可将处于1×PBST中的胚胎用于后续其他分析，例如DNA提取以进行基因分型。

结果

平铺封片技术的操作流程包括将斑马鱼胚胎从其正常解剖结构（即体轴环绕位于中央的卵黄球）转变为二维结构的制备过程（图1A）。由于胚胎体轴环绕卵黄的自然形态，对早期斑马鱼胚胎进行整体封片成像存在局限性。因此，整体封片染色标本的侧面或背侧观察通常只能捕捉到部分体轴，或使特定组织结构难以分辨（图1B）。相比之下，去除卵黄并展平胚胎可实现对整个胚胎体轴的同时可视化（图1B）。这些局限性可通过观察经WISH染色、并使用反义核糖探针标记irx3b（紫色，标记位于第7至13体节相邻区域的一类肾源性前体细胞）和myod1（红色，标记体节）的胚胎来说明（图1B）。在整体封片的侧视图中，irx3b+肾源性前体细胞区域因irx3b转录本在中枢神经系统中大量表达而被遮蔽，导致从侧面视角几乎无法观察该区域；此外，当胚胎旋转至背侧视角时，irx3b+肾源性前体细胞区域仍仅部分可见，因其结构仍环绕于卵黄周围（图1B）。然而，经平铺封片处理后，同一胚胎的背侧观察可清晰呈现整个irx3b+肾源性前体细胞区域，并能直观地分析其与躯干体节及其他胚胎结构的空间关系（图1B）。因此，该方法非常适合用于记录复杂的空间表达模式。

成功实施平铺制片技术涉及多个主要步骤。进行该操作时，必须首先将卵黄球从胚胎本体上分离（图2A），此步骤可在体视显微镜下使用精细器械（如一对精细镊子）完成。粗略去除卵黄球后，使用细小的睫毛工具刮除仍附着在胚胎上的卵黄颗粒（图2B）。清除残留的卵黄颗粒有助于更好地观察胚胎组织。最后，将去卵黄的胚胎调整至稳定位置，置于载玻片上（图2C），以便通过显微镜连接的成像软件和相机进行观察和样本记录。这些睫毛工具为自制装置，可通过使用强力胶将合适的睫毛固定于移液器吸头末端制成，必要时可加装手柄（图3A，材料表）。可获取不同类型的睫毛样本，以制作在长度和锥度上略有差异的睫毛工具（图3B），使用者在开始尝试平铺制片技术后，可根据个人偏好选择适合的类型。可用的睫毛样本包括自然脱落的人类睫毛、自然脱落的动物硬毛或触须，以及市售化妆品部门可购得的合成假睫毛。

可对置于载玻片上的样本及其周围局部区域进行成像，以实现高分辨率分析（图4A）。通过双色WISH技术，结合多种探针标记野生型胚胎早期发育阶段中形成肾脏的肾前体细胞，随后制备平铺样品以观察结果（图4B，4C）。在体节早期阶段，肾前体细胞因其表达pax2a转录本（紫色）而呈现出U形分布模式，环绕着同时表达delta C (dlc)（红色）的轴旁中胚层（左列，图4B）^6,7。相比之下，当使用紫色底物检测dlc转录本，并与后脑标志物krox20（红色）联合标记时，可观察到肾前体细胞中一个头侧亚区表达dlc（右列，图4B），此现象此前已有报道^6,7。平铺制备方法也可用于类似地研究后续体节形成阶段。在14个体节阶段，我们分析了肾标志物pax2a、slc4a4和slc12a3（紫色）与标记体节的smyhc1（红色）的表达情况（图4C）。这些组合标记能够利用pax2a完整描绘整个肾前体细胞区域，同时揭示其中一部分细胞位于头侧亚区并表达slc4a4a，而另一部分肾前体细胞则位于非重叠的尾侧亚区并表达slc12a3。

双色原位杂交（WISH）与整体封片制备方法在研究斑马鱼器官发生过程中细胞区域的变化时同样具有重要价值，尤其适用于存在基因突变或因环境暴露于小分子化合物而产生其他干扰的情况^6,7（图5）。斑马鱼的nls和lib突变体在醛脱氢酶1a2（aldh1a2，曾称为raldh2）基因上携带突变，该基因编码一种合成视黄酸（RA）所必需的酶。视黄酸对多种肾源性细胞类型的正常发育至关重要，包括足细胞的形成，而足细胞是胚胎肾脏滤血结构——肾小球的重要组成部分^6,7。本研究通过WISH同时标记足细胞前体细胞（使用wt1a探针）、发育中的体节（使用smyhc1探针）以及后脑区域（使用krox20探针），在野生型胚胎、nls突变体胚胎、lib突变体胚胎以及经醛脱氢酶化学抑制剂DEAB处理的胚胎中进行检测（图5）。结果显示，与野生型胚胎相比，aldh1a2表达缺陷的突变体胚胎中wt1a的表达水平降低，而经DEAB处理的胚胎则几乎完全丧失wt1a转录本信号（图5，右列）。综上所述，这些代表性结果展示了整体封片技术如何被用于精确分析和记录早期胚胎中的解剖学差异，因而可广泛应用于重要的发育生物学研究中。

图1. 斑马鱼胚胎平展制备的总体概述。A) 平展制备技术通过去除中央的卵黄团块并将胚胎稳定地固定在平面上，从而实现沿胚胎轴向组织的同步观察。B) 整体原位杂交染色胚胎的侧视图和背视图，以及完成平展制备后的图像。该胚胎使用反义探针进行染色，以检测编码irx3b（紫色）和myod1（红色）的基因转录本。

图 2. 斑马鱼胚胎平铺制备的示意图。A）首先对胚胎进行粗去卵黄，以去除大部分卵黄物质，然后（B）精细去除腹侧表面的残留卵黄颗粒，洗涤胚胎后（C）将其背侧朝上固定于玻璃载片上，用于显微观察和/或摄影成像。

图3. 示例睫毛工具与精细镊子的对比照片。A） 自制的睫毛工具与一对标准精细镊子并列成像，并置于公制尺旁作为尺寸参考。 B） 睫毛工具与精细镊子相邻的放大视图，视图顶部标有毫米刻度作为参考。图中显示了两种不同的睫毛工具，星号（*）标记的是来自自然脱落的人类睫毛的工具，双星号（**）标记的是来自自然脱落的猫科动物触须、经修剪形成较钝末端的工具。在每种情况下，均将睫毛穿入移液枪头中，并用数层速干胶逐层粘合，以逐步形成牢固的密封，从而将睫毛稳定固定于连接操作装置的移液枪头上。

图 4. 野生型斑马鱼胚胎中肾祖细胞区域发育变化的表征。A) 示意图显示了在（B、C）中用于分析的成像区域。B) 对1、3和5体节期的野生型胚胎进行双色原位杂交（WISH）染色，以评估形成胚胎肾脏（即前肾）的肾祖细胞区域的组成。（左列）编码转录因子pax2a的转录本（紫色染色）标记了胚胎中的多个细胞群，包括从中间中胚层衍生出的肾祖细胞区域。编码Notch配体dlc的转录本（红色染色）标记了由轴旁中胚层形成的体节。（右列）在同一胚胎中检测dlc转录本（紫色染色）和后脑菱脑节标记物krox20（红色染色）的表达时，可在紧邻第1至第5体节的肾祖细胞中观察到dlc在头侧亚区的表达，该信号在dlc与pax2a共染色时被掩盖。C) 对14体节期的野生型胚胎使用肾标记物（紫色）、体节标记物smyhc1（红色）以及后脑菱脑节标记物krox20（同样为红色）进行双重或三重染色。（上图）在此阶段，pax2a转录本继续标记肾祖细胞区域。（中、下图）在肾祖细胞区域内，头侧亚区由slc4a4标记，而编码slc12a3的转录本则标记尾侧亚区。

图 5. 利用平铺制片方法鉴定由基因突变或化学遗传干扰引起的表型，这些突变或干扰可调节视黄酸的生物合成。 在15体节期，比较了野生型与视黄酸（RA）合成缺陷的胚胎中 wt1a（紫色）和 smyhc1/krox20（红色）的WISH表达模式，RA合成缺陷由aldehyde dehydrogenase 1a2基因的突变（nls 和 lib 突变）或使用二乙氨基苯甲醛（DEAB）化学抑制视黄醛脱氢酶活性所致。在lib突变体中RA生成的减少程度略比nls突变体更严重，因此lib胚胎中wt1a转录本的染色强度略低于相同发育阶段的nls突变体胚胎；而对野生型胚胎使用DEAB处理则完全阻断了wt1a的表达。

讨论

近年来，斑马鱼已被证明是科研领域中一种极为重要的模式生物。斑马鱼在遗传上与高等脊椎动物具有高度保守性，其在解剖结构、繁殖特性和生命周期方面的优势使其非常适用于实验分析。此外，适用于斑马鱼的分子技术的进步进一步推动了该模式生物在科学研究中的广泛应用。例如，目前已构建了大量转基因斑马鱼品系，用于研究疾病进展以及回答有关器官发生等发育关键机制的诸多基础科学问题。

因此，鉴于斑马鱼在疾病和发育研究中的广泛应用，细胞标记方法和信号定量是数据分析中的关键环节。虽然可利用荧光抗体方法检测转基因斑马鱼中的蛋白表达，但研究人员通常依赖WISH^12-16等标准流程来分析固定后的非转基因斑马鱼样本中基因转录本的空间和时间定位。事实上，WISH是生物学中最广泛使用的技术之一¹⁶，也是用于表征基因突变和化学遗传干扰表型的重要工具。然而，WISH也存在若干潜在的陷阱和挑战。为验证反义RNA探针的特异性，可使用正义RNA探针作为对照，以评估反义RNA探针染色模式的特异性。尽管第4和第5节中描述的步骤顺序为先标记和检测地高辛标记的探针，再进行荧光素标记探针的检测，但该顺序可以调换。通常情况下，表达水平较低的基因信号较弱，最适合用地高辛标记的探针进行检测，并首先使用紫色底物显色；随后用红色底物检测并染色表达更丰富的基因（信号较强）。然而，若进行双色反应，建议测试不同标签与底物的组合，以确定最适合数据采集与分析的实验流程。此外，第4至第5节中提供的封闭、抗体孵育和洗涤时间适用于受精后24小时以内的胚胎；对较老的胚胎延长这些步骤的时间可能导致样本上盐分积累。有关标准斑马鱼胚胎WISH实验的大量故障排除建议已在文献中详细记录^12-16。其中最常见的问题可能是背景过高。我们建议根据需要将第4.7步中MABT洗涤次数增加至15–20次；但根据我们的经验，在进入第4.8步之前，结合使用过夜MABT“超级洗涤”以及10次或更多的短时MABT洗涤，效果尤为显著。另一个常见问题是探针渗透不良，这可能发生在较长的RNA探针中。在第3.6步之后通过碱性水解对RNA探针进行剪切可有效缓解此问题。根据我们对较年轻样本的操作经验，通常无需进行探针剪切。然而，应意识到此类参数可能会影响WISH实验的结果，我们建议在必要时参考社区中已公开发布的这些实用故障排除指南，以优化您自身研究中WISH实验的条件¹²。

除了传统的WISH技术^12-16外，WISH方法学和替代性实验方案也在不断取得进展。这些进展包括新的信号检测方式，例如利用荧光进行检测^17-19，以及能够实现微小RNA（microRNA）定位的方法²⁰。然而，尽管现有的细胞标记方法已有多项改进，但如果染料无法在目标时间点被清晰地观察到，则这些方法的有效性将大打折扣。这一局限性对研究人员尤为棘手，特别是在斑马鱼个体发育的早期胚胎阶段，可能导致我们对这些时期出现的各种发育过程的理解出现空白。在正常的斑马鱼发育过程中，随着胚胎的发育，卵黄囊会逐渐缩小¹¹。因此，在较晚的发育阶段（>受精后24小时），由于胚胎相对于相邻的卵黄囊更大，WISH染色结果的分析相对直接明了。然而，在尾芽期至早期体节形成期（此时胚胎团块位于卵黄周围），不透明的卵黄囊有时会遮挡染色信号，影响观察。因此，平铺装片（flat mounting）技术应运而生，旨在缓解早期斑马鱼胚胎样本在成像和数据分析方面的困难（如图1和图2所示），并在首次大规模遗传筛选中分离出基因突变后进行系统性表型分析以来被广泛采用²¹。

自从平铺装片技术出现以来，对早期发育阶段的分析得到了显著提升。一旦将胚胎中的卵黄去除，便可将胚胎以所需的朝向平铺在载玻片上进行成像。这种二维位置使得能够同时观察整个胚胎，从而无需旋转样品。许多组织位于胚胎的广阔区域中，例如形成血液和肾脏的前体细胞。此外，研究者可能需要同时比较多个不同的发育中组织。平铺装片技术使研究者能够同时观察这些细胞群的整个分布区域，因此可极大地方便诸如组织面积测量或细胞计数等定量分析。该技术最终推动了诸多重要发育机制的发现，涉及造血作用、神经发生以及器官发生等多个方面。因此，一旦掌握，这一简单技术对研究者而言具有广泛的应用价值。

例如，在一项研究造血过程中细胞谱系选择的研究中，利用14体节期（ss）和18体节期（ss）斑马鱼胚胎的平铺制片，展示了野生型与注射了gata1吗啉代寡核苷酸的胚胎中锌指转录因子pu.1表达模式的变化²²。该方法检测到在18 ss时pu.1表达区域扩大，表明gata1很可能在此时期调控中间细胞团（ICM）中pu.1的表达。另外，对染色显示不同红系基因（包括gtpbp1和epsin）表达的平铺胚胎分析表明，在vlt突变体（即gata1^-/-）中这些基因的表达丧失。进一步分析显示，对于已知不依赖gata活性的红系基因如biklf和testhymin，其表达未发生改变。因此，结合其他实验结果，研究揭示gata1在调控髓系-红系谱系细胞分化过程中起关键作用。在神经嵴发育的研究中，平铺制片被用于分析mont blanc（mob^m610）突变体中crestin的表达，以探究mont blanc和tfap2a基因功能的作用²³。在10和20 ss时，与正常野生型相比，mob^m610突变体头部的crestin表达完全消失，躯干部位的表达也显著降低，这帮助研究团队最终得出结论：mont blanc和tfap2a在神经嵴形成过程中的调控具有重要意义。此外，在器官发生研究方面，平铺制片技术有助于发现斑马鱼胚胎肾（前肾）发育早期肾前体细胞区域中存在不同的功能区。斑马鱼胚胎为研究肾前体细胞如何形成构成前肾的功能单位——肾单位（即肾发生过程）提供了一个进化上保守且解剖结构相对简单的系统^6,7（图4）。平铺分析已被证明在记录肾前体细胞区域以及解析视黄酸（RA）信号通路变化对前肾模式形成的影响方面具有重要价值^6,7（图5），而这些此前尚不清楚。综上所述，这些实例表明，该平铺制片方案在研究正常发育及疾病状态下多种生物学过程方面具有广泛的应用前景。

从概念上讲，这种平铺制片方法整体上相对简单。然而，若缺乏直观的视觉演示，要掌握该方法所需的操作技巧和精细程度可能极具挑战性。因此，本实验方案旨在为研究人员，尤其是刚接触斑马鱼模型的研究人员，提供一个更好地理解如何执行该技术的机会，并分享我们在优化组织处理的试剂选择方面的建议。我们希望本方案最终能帮助领域内的其他研究者优化用于高质量成像、数据分析以及在出版物中展示研究成果的最佳样品条件。最终，该技术应能帮助研究人员克服斑马鱼在早期胚胎发育过程中存在的解剖学障碍，这些障碍可能会影响实验结果的清晰呈现，而通过这一简单却重要的技术即可有效解决上述问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 X E3			250 mM NaCl、8.5 mM KCl、16.5 mM CaCl2、16.5 mM MgSO4，溶于蒸馏水中。添加亚甲蓝（1 × 10-5 M）（Sigma M9140）以抑制污染。
1 X E3			将50 X E3用蒸馏水稀释。
网眼茶滤器	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
胚胎培养皿	Falcon	35-1005
移液管	Samco	202, 204
平底微量离心管	VWR	87003-300; 87003-298
玻璃小瓶	Wheaton	225012
1x PBST			将10x PBS用蒸馏水稀释后配制的含0.1% Tween-20的1x PBS溶液。
Tween-20 储存液	American Bioanalytical	AB02038
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
多聚甲醛	Electron Microscopy Services	19210
4% PFA/1X PBS			将4% PFA（w/v）溶于1x PBS中，在通风橱内的加热板上加热至沸腾。冷却后分装并冻存于-20 °C。使用前解冻，切勿反复冻融。
滤膜除菌装置	Corning	430516	1 L滤器系统，0.45 μm CA
MeOH	Sigma	34860-4L
蛋白酶K	Roche	03-115-879-001	用蒸馏水溶解配制成蛋白酶K储存液（10 mg/ml），分装后于-20 °C保存。
HYB+			50% 甲酰胺、5x SSC、0.1% Tween-20、5 mg/ml 酵母torula RNA、50 μg/μl 肝素
DIG/FLU标记的体外转录核糖探针 in vitro 转录反应试剂	Roche	11175025910; 11685619910	请参考制造商说明书。
SP6 RNA聚合酶	Roche	11487671001
T7 RNA聚合酶	Roche	10881775001
T3 RNA聚合酶	Roche	11031171001
RNase 1抑制剂	Roche	3335399001
DNase 1抑制剂，10x DNase 1缓冲液	Roche	4716728001
糖原	Roche	10901393001
乙醇（EtOH）	Sigma	E7023	将100% EtOH和70% EtOH（用分子级水稀释）分别分装为50 ml，于-20 °C保存。
分子级蒸馏水	Mediatech	25-055-CM
水浴锅	Thermo	51221073	型号 2831
NanoDrop	Thermo	ND-2000c
甲酰胺	American Bioanalytical	AB00600	于-20 °C保存。
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
MAB			2 L配方：将23.2 g马来酸、17.5 g NaCl、55.0 g Trisma碱加入1.5 L蒸馏水中，混匀后加入8 ml 1M Tris-HCl（pH 9.5），再加水至2 L。高压灭菌。
MABT			MAB + 0.1%（v/v）Tween-20
封闭液			每次新鲜配制50 ml：10 ml BSA（来自10%实验室储存液）、5 ml FCS（来自储存液）、35 ml MABT。未使用的封闭液可于4 °C保存，用于抗体溶液。注意：BSA和FCS储存液应在37 °C–下解冻；若温度过高，会形成浓稠凝胶（不可使用）。
FCS（胎牛血清）储存液	Invitrogen	16140089	分装为5或10 ml，于-20 °C保存。
BSA（牛血清白蛋白）储存液	American Bioanalytical	AB00448	用MAB缓冲液在室温下快速搅拌溶解BSA粉末，配制成10%储存液，分装10 ml后于-20 °C保存。未溶解的BSA粉末应于4 °C保存。
抗地高辛抗体	Roche	11-093-274-910	于4 °C保存。
抗荧光素抗体	Roche	11-426-338-910	于4 °C保存。
12孔染色皿	BD-Falcon	35-3225
预染色缓冲液			100 mM Tris（pH 9.5）、50 mM MgCl2、100 mM NaCl、0.1%（v/v）Tween-20。需现配现用：该缓冲液在数天内会析出沉淀。
显色液-紫色			每需10 ml：向新鲜配制的预染色缓冲液（不得用于胚胎样品）中加入45 μl NBT和35 μl BCIP。
显色液-红色			每需10 ml：向新鲜配制的预染色缓冲液（不得用于胚胎样品）中加入31.5 μl INT和35 μl BCIP。
NBT 储存液	Sigma	N6876	于-20 °C保存；粉末用70% DMF和30%水配制成50 mg/ml溶液。
INT 储存液	Sigma	I8377	于-20 °C保存；粉末用70% DMF和35%水配制成55 mg/ml溶液。
BCIP 储存液	Sigma	B8503	于-20 °C保存；粉末用100% DMF配制成50 mg/ml溶液。
DMF（二甲基甲酰胺）	American Bioanalytical	AB00450
甘氨酸	Sigma	G8898	0.1 M 甘氨酸，pH 2.2
小型塑料培养皿	Corning	430589, 430588
甘油	Sigma	G7893
精细镊子	Roboz	RS-1050	Dumont 镊子型号 #55
睫毛工具			通过使用强力胶将合适的睫毛固定在移液器吸头（P10-P1000大小均可）上制成。我们使用自然脱落的人类睫毛、动物胡须或硬毛，或从药房或零售店美容部购买的天然或合成假睫毛（超长型睫毛更易于在移液器吸头上稳定固定）。将移液器吸头固定在一根直杆（8-10 cm长）上，例如持针器（e.g., Fisher 08-965-A），以便操作。参见图3以查看这些自制工具的图像。
载玻片	Thermo-Fisher	4445	白色磨砂面
盖玻片	Thermo-Fisher	12-540A	18 x 18 mm
橡皮泥	Hasbro	Playdoh	其他工艺橡皮泥产品可替代使用。
载玻片架	Thermo-Fisher	12-587-10	用于平放保存载玻片的纸板托盘。
体视显微镜	Nikon	SMZ645, SMZ1000
复合显微镜	Nikon	80i, 90i