利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱研究光敏蛋白中的质子转移与蛋白质构象动力学

摘要

蛋白质功能的关键步骤，特别是主链构象变化和质子转移反应，通常发生在微秒到毫秒的时间尺度上。这些动力学过程可以通过时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱技术进行研究，尤其适用于其功能由光触发的蛋白质。

摘要

在蛋白质发挥功能的过程中，监测其质子化动态及蛋白质主链构象变化是理解其作用机制的关键步骤。质子化和构象变化分别影响氨基酸侧链和肽键的振动模式，这两者均可通过红外（IR）差谱技术进行探测。对于那些功能可由光重复且可重现触发的蛋白质，利用步进扫描傅里叶变换红外技术，可以在宽光谱范围内获得具有（亚）微秒级分辨率的红外差谱。通过约10²-10³次光反应循环——这是在合理光谱分辨率和带宽下完成一次扫描所需的最少重复次数——吸收差谱中的噪声水平可低至约~10^-4，足以追踪单个氨基酸质子化变化的动力学过程。通过进一步的数据平均和/或数学处理，还可实现更低的噪声水平。获得最佳结果所需的蛋白量为5–100 µg，具体取决于所采用的采样技术。关于其他要求，蛋白质需首先在低离子强度缓冲液中浓缩，然后干燥成膜。实验前需对蛋白膜进行水合，可通过滴加少量水滴或在受控的大气湿度下完成。所得水合程度（水的质量/蛋白的质量）可通过红外吸收光谱测定。为展示该技术的应用，我们研究了光驱动质子泵——细菌视紫红质在其天然紫色膜环境中的光循环，以及溶于去垢剂中的光控离子通道——通道视紫红质-2的光循环。

引言

为了充分阐明蛋白质如何发挥其功能，需要在蛋白质工作过程中对其进行测量。 即 沿着一条通常涉及一系列中间产物且跨越多个时间数量级的反应路径进行。蛋白质功能的关键步骤通常发生在微秒到毫秒的时间范围内¹，特别是膜蛋白中的骨架构象变化和质子转移反应。X射线晶体学堪称结构生物学的支柱，可从衍射质量良好的蛋白质晶体获得静态（时间平均）的电子密度图，但膜蛋白晶体 notoriously difficult to grow². 可以基于电子密度构建三维原子模型，尽管其中很少包含氢原子的位置。在时间分辨X射线晶体学方面已取得显著进展，该技术依赖于拉厄衍射³ 或飞秒X射线脉冲⁴为X射线晶体学固有的高结构信息增加了时间维度⁵但抛开技术和分析上的挑战不谈，晶体晶格可能限制主链的构象变化并改变蛋白质的动力学特性，这是基于蛋白质晶体的方法不可避免的缺点⁵因此，蛋白质的动力学特性仍然最适合采用光学方法进行研究，这一思路最早由闪光光解法开创^6,7，尽管存在结构信息有限这一普遍缺点。

傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）结合了光学光谱学的时间分辨率优势，以及对蛋白质结构的高度敏感性，后者已被广泛应用于大量关于膜蛋白的静态结构与功能研究中^8-11。特别是，FT-IR差谱技术已被证明是研究蛋白质从一个亚稳态转变为另一个亚稳态过程中微小光谱变化的理想工具^12-19。

除单分子水平的研究^20,21外，蛋白质动力学研究需要一个用于同步的触发过程。利用光作为触发手段，可快速且非侵入性地启动反应，这种方法常用于具有环状光反应的蛋白质研究。时间分辨研究面临的主要挑战在于，如何在保持良好光谱分辨率和适当信噪比的同时，实现足够的时间分辨率。此外，还需覆盖足够宽的光谱和时间范围。时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在上述各方面均表现出色²²，已有文献报道的光谱范围宽达3,900–850 cm^-1，时间动力学范围跨越约9个数量级，光谱分辨率可达3.5 cm^-1，时间分辨率达30纳秒^23–28。

与色散型仪器相比，傅里叶变换红外光谱仪具有更低的噪声和更高的光度准确性²⁹。然而，在常规快速扫描模式下，傅里叶变换红外光谱仪的时间分辨率受限于干涉仪移动镜完成一次扫描所需的最短时间，通常只能达到 ≥5–10 毫秒。相比之下，采用步进扫描技术可将动态事件的时间依赖性与干涉仪的扫描持续时间解耦。简而言之，移动镜以离散的步进方式移动，而非连续扫描完成整个过程。在每一步位置，移动镜被固定不动，并记录一次瞬态信号。因此，时间分辨率受限于汞镉碲（MCT）探测器的上升时间，通常在 10–100 纳秒范围内。在实际应用中，由于干涉图具有很大的动态范围（中心突发信号强，而两侧翼信号弱），为实现适当的数字化，需要使用 16–24 位的模数转换器（ADC），导致采样速率通常不超过约 200 kHz（5 µsec）³⁰。通过仅测量干涉图的变化量，可实现纳秒级时间分辨率，此时使用 8–12 位的 ADC 即已足够^23,31–33。时间分辨步进扫描技术的若干技术细节^30,34,35及其应用^36–38已在其他文献中进行了详细讨论。

本文的目的是提供一种时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）用于光敏膜蛋白研究的实验方案，详细描述该技术的实际操作细节。本文以两种采样方法为例展示了该技术的应用：透射模式和衰减全反射（ATR）模式。使用ATR模式可在过量水存在的条件下进行实验，这不仅能够确保蛋白质处于充分水合的状态，还允许对样品的pH值和离子强度进行精确调控^49,50。本文以细菌视紫红质和通道视紫红质-2两个选定系统为例，展示了步进扫描实验的具体实施过程。

光驱动质子泵细菌视紫红质（bR）在过去四十多年中一直是众多生物物理研究的主题^39,40，使其成为迄今为止理解最透彻的膜蛋白。在用于研究bR功能的众多技术中，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）技术 arguably 产生了最大的影响。特别是，FT-IR光谱在鉴定跨膜质子转移过程中所涉及的基团方面起到了关键作用，其他文献对此已有详细阐述^13,41,51。

通道视紫红质（ChR）是自然界中发现的第一种光控离子通道^42,43。ChR 在光激发下会瞬时打开离子通道。它的发现为光遗传学的发展奠定了基础，该技术利用光来控制分子过程^44,45。ChR 与 bR 一样，同属于微生物视紫红质家族，但与 bR 相比，其功能机制的研究尚不充分⁵²。ChR2 兼具离子通道功能和质子泵活性^46,47。最近，我们采用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外（FT-IR）光谱技术，解析了 ChR2 中的蛋白质内部质子转移反应以及蛋白质骨架构象变化的动力学过程⁴⁸。

方案

1. 样品与仪器准备的一般事项

1. 使用配备时间分辨步进扫描测量功能的商用FT-IR光谱仪。为获得最佳结果，应将FT-IR光谱仪置于隔振光学平台上。
2. 将光学室抽真空至几毫巴。用干燥空气或氮气吹扫样品室。
3. 在傅里叶变换红外光谱仪的MCT检测器前方放置一块对可见光不透明但对红外光透明的材料。此预防措施对于防止在步进扫描实验中激发激光脉冲产生伪影至关重要。注：我们使用直径为25 mm的锗（Ge）窗口。由于其折射率较高，会导致不必要的强度损失，使用带有抗反射涂层的Ge滤光片可大幅避免该问题。
4. 用液氮冷却MCT探测器杜瓦瓶。注意：优先使用光伏型MCT探测器而非光导型，因其具有线性响应，从而具备更优的光度测量准确性和基线稳定性^31,53.
5. 将用于实验的样品在低（缓冲液中）浓缩至至少 2 mg 蛋白质/ml<20 mM）的离子强度，以防止蛋白质悬浮液在干燥形成均一蛋白质膜的过程中产生盐结晶。对于发生沉降的样品，通过超速离心进行洗涤/浓缩例如，脂质体或细胞膜碎片中的膜蛋白）。对于不发生沉降的蛋白质，使用合适截留分子量的超滤离心管（centricons）例如去垢剂溶解的膜蛋白
6. 为获得最佳结果，请使用：a）尽可能纯净且具有活性的蛋白质样品；b）对于存在于细胞膜微区或重组于脂质体中的蛋白质，脂质/蛋白质质量比 ≤ 3；c）对于去垢剂增溶的蛋白质，去垢剂/蛋白质质量比 ≤ 1。避免使用其振动峰与蛋白质振动峰重叠的去垢剂或脂质。例如CHAPS

2. 嗜盐菌紫红质全反射衰减实验的准备 on Bacteriorhodopsin

1. 将ATR附件安装到傅里叶变换红外光谱仪的样品室中。注意：我们使用具有5次有效反射的ZnSe/金刚石ATR。应避免使用锗或硅等半导体材料作为ATR附件的内反射元件（IRE），因为这些材料的光学性质会受到激发用可见激光的影响。
2. 测量一个宽范围（约 4,000–800 cm⁻¹）^-14 厘米处的能量谱^-1 通过常规快速扫描傅里叶变换红外光谱法测定洁净IRE表面的分辨率。将此光谱用作参考光谱，以便在后续阶段计算吸收光谱。
3. 用后续用于样品复水的缓冲液覆盖ATR的IRE表面，体积为20 μl（例如，4 M NaCl 和 100 mM NaPi（pH 7.4））。测定该缓冲液的红外吸收。
4. 移去缓冲液，用水冲洗 IRE 表面。避免触碰表面。用强气流吹干 IRE 表面上的残留液体。
5. 在IRE表面（约0.2 cm²）滴加约3 μl细菌视紫红质（bR）紫色膜溶液（去离子水中蛋白浓度约6 mg/ml）² 区域）。在温和的干燥空气流下干燥蛋白悬液，直至形成一层薄膜。
6. 测量干膜的吸收光谱（参见 图1).
7. 轻轻加入 20–40 μl 高离子强度缓冲液以重新水化干燥的薄膜（例如，4 M NaCl 和 100 mM NaPi（pH 7.4））。注意：高离子强度可防止膜膜过度膨胀，从而尽可能保留接近探测表面的蛋白质图2).
8. 用盖子盖住ATR支架以防止水蒸发。可选地，可放置连接至循环浴且温度设定为25 °C的保温套以控制温度。对于具有长光循环的蛋白质（>秒），温度控制可能会提高基线稳定性。
9. 测量吸光度光谱。通过减去缓冲液的吸收光谱，估算薄膜再水化后表面残留样品的百分比。图3).
10. 通过在复水后每隔5-20分钟记录吸收光谱，确认薄膜溶胀的稳定性图4此步骤为可选，但建议执行。

3. 对去垢剂溶解的通道视紫红质-2 进行透射实验

1. 将10 μl ChR2（约10 mg蛋白/ml）溶解于5 mM NaCl、5 mM HEPES（pH 7.4）和去氧麦芽糖苷（DM）中，加至直径为20 mm的BaF₂窗片中心。用移液枪头辅助将溶液铺展至直径6–8 mm（蛋白表面密度约为200 μg/cm²）。
2. 通过轻柔的干燥气流形成薄膜。为获得最佳效果，确保薄膜均匀，且其直径大致与最大光圈处红外光束的尺寸相匹配。
3. 在干燥薄膜周围滴加3–5滴甘油/水混合液（3–5 μl），使薄膜水合，并使用厚度≥1 mm的平硅胶O型圈将第二片窗片紧密封合。注意：甘油/水混合液的比例控制两片窗片间的相对湿度⁵⁴。对于吸湿性样品，使用3/7或2/8的甘油/水质量比（w/w）。甘油/水液滴不得直接接触蛋白膜。
4. 将夹有BaF₂窗片的样品装入样品架中。用不透红外光的材料（如纸片）覆盖样品窗片，纸片上开孔大小应与水合薄膜尺寸一致，以防止直射光到达探测器。将样品架放入样品室中。
5. 通过连接至温控循环浴的恒温套控制样品架温度为25 °C。
6. 测定吸收光谱。确保酰胺I区（约1,700–1,620 cm^-1）的最大吸收值在0.6–1.0范围内。
7. 利用水、DM及代表性膜蛋白的参考消光系数光谱（图5），根据水合薄膜的吸收光谱估算蛋白/去垢剂/水的质量比和摩尔比（图6）。
8. 在进行步进扫描实验前，需等待水合水平稳定（≥1小时）。

4. 激发激光的调节与同步

对于细菌视紫红质（bR）实验，使用脉冲Nd:YAG激光器的二倍频输出（λ = 532 nm）来触发光循环。对于涉及ChR2的实验，使用由Nd:YAG激光器三倍频（λ = 355 nm）驱动的光学参量振荡器（OPO）提供的λ = 450 nm激发光。确保激光脉冲足够短（约10纳秒），以尽量减少二次光激发。注意：激光脉冲的能量应尽可能保持恒定。在我们的实验装置中，通过连接至瞬态记录仪的光电二极管测量激光反射并积分其响应，确认激光强度在平均值附近波动不超过10%（图8）。

1. 将激光耦合到样品。使用功率计调节样品处的激光能量密度，使其达到每脉冲 2-3 mJ/cm²。
   1. 对于ATR装置，将光纤放置在ATR盖顶部。
   2. 对于透射实验，使用反射镜将激光引导至样品，并在需要时使用透镜对激光束进行准直或发散，使其光斑直径略大于样品薄膜尺寸。
2. 通过光谱仪的数据记录与激光脉冲同步。利用Nd:YAG激光器电子系统的Q开关同步输出TTL脉冲来触发光谱仪。将Nd:YAG激光器的激发频率分别设置为bR 10 Hz，ChR2 0.25 Hz。
3. 若Nd:YAG激光器的重复频率不易调节，可使用脉冲延迟发生器（PDG）控制激光激发频率。
   1. 将Nd:YAG激光器的灯同步输出连接至PDG的外部触发输入端。PDG向Nd:YAG激光器的Q开关同步输入端提供一个约190 μsec延迟的TTL脉冲以触发激光。设置PDG仅在上一次接受触发后的特定时间间隔后才接受下一次外部触发（bR为100 msec，ChR2为4 sec）。

5. 时间分辨步进扫描的准备与设置

1. 在光路中放置一个低通光学滤光片。在1,800–850 cm⁻¹范围内进行时间分辨步进扫描测量时，^-1 光谱范围，使用在1,950 cm以上不透光的滤光片^-1 且具有良好的透射性（>50-80% 低于 1,800 cm⁻¹^-1 (图7).
2. 将检测器从交流耦合模式更改为直流耦合模式。注意：调整后，干涉图信号将不再围绕零值振荡，而是围绕一个称为直流电平（DC-level）的值振荡。
3. 使用光谱仪尽可能大的入射光束孔径，以获得更高的光子通量，从而提高信噪比，但需确保处于探测器的线性响应范围之内。
4. 将干涉图的直流电平调整至零，并重新调节电子增益，以更充分地利用模数转换器（ADC）的动态范围。通过在前置放大器输出的信号上施加电压偏置，实现直流电平偏移。注：现代傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）通常包含此功能；否则，可在前置放大器与ADC之间连接自制的外部装置以实现该功能。 ³⁸需要注意的是，应确保此类设备的电子元件具有快速且线性的响应特性。
5. 启动傅里叶变换红外光谱仪的步进扫描菜单。将步进扫描测量的目标光谱带宽设置为 1,975.3–0 cm⁻¹。^-1. 将光谱带宽调节至He-Ne激光波数的几分之一（1/8^th 在本案例中），略微超过光学滤光片的截止值。
6. 禁用任何高通电子滤波器，以防止后期动力学信号发生畸变。当低通电子滤波器的截止频率等于或高于模数转换器（ADC）的采样率时，使用该滤波器有助于降低噪声混叠。
7. 将光谱和相位分辨率设置为 8 cm^-1 和 64 cm^-1分别将干涉图采集模式设置为单侧前向。采用这些参数时，采集一个干涉图大约需要500个数据点。
8. 将ADC的采样率设置为光谱仪中可用的最高值例如，160 kHz，或 6.25 μsec）。将“实验触发”设置为“外部” 即，激光为主控。设置记录的线性等距数据点数量：bR 为 7,000 个（最长至 42 毫秒），ChR2 为 20,000 个（最长至 125 毫秒）。注意：可通过波形发生器输出的准对数时间间隔外部 TTL 脉冲触发数据采集，从而覆盖更长时间尺度，而不会超出 ADC 存储容量 ³⁸，或使用两个并行的瞬态记录仪作为内部ADC的替代^31,32.
9. 保存约100个触发前数据点，作为样品暗态的参考。注意：在毫秒时间尺度下，数据质量通常受限于移动镜的波动。因此，将触发前数据点增加至100以上，预计不会显著提高数据质量。
10. 设置累加次数， 即，每个镜面位置的光反应平均次数。对于bR，使用20次累加（在10 Hz激发频率下测量时间为20分钟）。对于ChR2，使用2次累加（在0.25 Hz激发频率下测量时间为70分钟）
11. 重复实验10次 对于bR，以及35倍 在三种不同的ChR2样品膜上进行测量，最终使每个镜片位置获得约200次累加。

6. 数据处理

1. 通过比较首次和末次测量获得的光诱导红外差谱，确认样品的状态。若差谱强度降至首次测量值的60%以下，应考虑舍弃该部分测量数据。
2. 对记录的干涉图进行平均。
   1. 使用FTIR光谱仪的OPUS软件，选择需平均的时间分辨干涉图，并将其添加至“光谱计算器”中。
   2. 点击“=”以获得干涉图的平均值。
      注：若测量过程中干涉图的相位保持恒定，则对干涉图或单通道光谱进行平均并无区别。可通过计算并比较首次与末次记录的干涉图的相位谱来确认相位是否恒定。
3. 对平均后的时间分辨干涉图进行傅里叶变换，以获得平均后的时间分辨单通道光谱。
   1. 使用与步骤6.2.1相同的软件，选择平均后的时间分辨干涉图，并点击“干涉图转光谱”图标。采用Mertz相位校正法，补零因子为2（每仪器分辨率对应两个数字点），并选择一种切趾函数（例如，三角函数、Blackmann-Harris 3项函数等）。
   2. 点击下方的“转换”按钮，将时间分辨干涉图转换为时间分辨光谱。
4. 在OPUS软件中使用“另存为”图标，将时间分辨单通道数据导出为“数据点表格”或“matlab”文件。后续在外部程序中继续进行数据处理。
   1. 对激光前的单通道光谱进行平均，并将时间分辨单通道数据转换为时间分辨吸收差谱。
   2. 利用激光前100个单通道光谱的噪声标准偏差ε和均值S₀(ν)，计算差谱中各波数下的预期噪声标准偏差向量（图12）：ε / S₀(ν)。其中ε的估计方法为：将连续的单通道光谱相减，并将所得差值的标准偏差除以√2进行校正。
   3. 去除噪声过大而无法使用的光谱区域（例如，高于1,825 cm^-1 和低于850 cm^-1 的区域）。
   4. 进行准对数平均（例如，每时间量级取20个光谱）。该处理可改善数据外观，并将光谱数量从约10⁴ 减少至约10²，且不损失显著信息（图9）。
   5. 通过傅里叶插值（补零后插值）将光谱点密度提高四倍（至1点/cm^-1）。
      注：我们使用自行编写的MATLAB程序完成步骤6.4.1至6.4.4。
5. 对获得的时间分辨光谱（图10A）进行奇异值分解（SVD）处理（图13）。通过仅使用有限个显著的SVD分量重构数据，实现去噪（图10B）。注：我们在MATLAB中使用内置的“svd”函数完成SVD计算。

结果

图1展示了在用于ATR光谱分析的金刚石内反射元件表面沉积的bR干膜的吸收光谱。肽键振动（酰胺A、酰胺I和酰胺II）的特征吸收带清晰可辨。根据所添加的蛋白量（18 μg）、ATR元件的表面积（~0.2 cm²），并假设蛋白密度约为1.4 g/cm³⁵⁸，脂质密度为1.0 g/cm³⁵⁹，以及紫膜中脂质/蛋白质量比为1/3⁶⁰，可估算该干膜的近似厚度为~1 μm。

将干燥的薄膜用过量的4 M NaCl、100 mM NaPi（pH 7.4）溶液重新水化（图3）。通过计算数字去除水吸收带所需的缩放因子，可推断出衰逝波探测体积内的水合程度和有效蛋白质浓度。最佳缩放因子为0.87，表明在此情况下，缓冲液占表面附近体积的87%，样品占13%。结合紫膜中蛋白质和脂质的密度以及脂质/蛋白质比例（见上文），可推断出衰逝波探测体积内的有效蛋白质浓度为125 mg/ml。根据水合程度可推断，在此特定情况下，薄膜在重新水化后厚度膨胀了约6倍，从约1 μm增至约6 μm。对于45°入射角（在本实验及大多数ATR装置中具有代表性），在1,800–850 cm^-1波数范围内，水化蛋白膜中衰逝场的穿透深度（d_p）介于0.3至0.6 μm之间⁶¹。由于衰逝场对位于两倍d_p以上区域的样品几乎不敏感⁶¹，因此我们推断，原则上可将ATR实验中使用的蛋白质用量减少5倍，而不会造成明显的信号损失。

当使用离子强度较低的缓冲液时，薄膜膨胀程度更大，而隐逝场探测体积中的蛋白含量则减少（图2）。薄膜膨胀程度与缓冲液离子强度之间的具体关系取决于多种因素，其中包括脂质的性质。例如，对于在大肠杆菌（E. coli）极性脂质中重组的膜蛋白，仅使用0.1 M NaCl即可达到本实验中紫膜细菌视紫红质（bR）在4 M NaCl条件下所观察到的类似薄膜膨胀程度⁶²。如果样品占据的探测体积不足5%，应考虑改用离子强度更高的缓冲液重新进行水合步骤。水合后的薄膜膨胀需要一定时间才能达到稳定（图4）。对于紫膜中的bR，该过程呈单指数型，时间常数为12分钟：完全稳定的再水合薄膜通常在30至60分钟内即可形成。

图5展示了通过透射法测得的ChR2水合薄膜的红外吸收光谱。此处，水合过程是通过将干燥薄膜暴露于由甘油/水混合物提供的受控湿度环境中实现的。该光谱可分解为水、去垢剂和蛋白质各自的贡献。我们利用消光系数光谱对每种组分的含量进行了估算，并将其按比例拟合至实验光谱。对于水，我们采用了文献中报道的消光系数光谱⁶³；对于DM，则从100 mg/ml溶液中测得其消光系数光谱（图6）。此外，我们还使用了两种代表性膜蛋白的消光系数：线粒体ADP/ATP载体⁶⁴和bR（图7）。拟合的比例因子表明，薄膜中水和DM的质量面密度分别为260 μg/cm²和200 μg/cm²。剩余的吸收（图5中红线）主要来自蛋白质，根据两种不同膜蛋白的酰胺II带消光系数估算，其面密度约为250 μg/cm²（见图6）。基于分子质量分别为35 kDa、480 Da和18 Da，计算得到蛋白质/去垢剂/水的摩尔比为1/60/2000。

一种典型的bR时间分辨步进扫描傅里叶变换红外实验的三维图谱如图所示 图10A，通过ATR获得，数据采集时间为200分钟。可在特定时间点提取光谱，例如当bR光循环的L、M和N中间态预计达到最高布居数时图11）。它们的光谱特征已被广泛描述^13,41,65 此处不再进一步讨论。 图12 显示在某些选定波数下的时间轨迹。即，在 1,762 cm⁻¹ 处动力学信号的上升^-1 (t_1/2 ~60 μsec) 报道了视黄醛席夫碱Asp85质子化的动力学过程⁶⁶，其衰减至零表明在基态恢复过程中发生去质子化⁶⁷. 动力学在 1,740 cm 处的负增长^-1 (t_1/2 ~1毫秒）反映了Asp96侧链的去质子化过程，该残基是席夫碱的质子供体⁶⁸强度衰减至零反映了其从细胞质中的再质子化过程⁶⁷蛋白质构象变化的动力学可通过酰胺I和酰胺II区吸收变化进行探测，该变化在室温下约3毫秒时达到最大。^67,69.

SVD 在光谱学问题中的应用此前已有综述^55,56。简而言之，SVD 将实验数据以矩阵 A 的形式进行分解，表达式为：A = U S V^T。该分解方法可进行改进，以考虑噪声对波数的依赖性，并对基线的波动/漂移进行惩罚处理⁵⁷。矩阵 U 和 V 的列分别包含每个 SVD 组分的正交归一化光谱和时间轨迹向量。S 为对角矩阵，其元素为所谓的奇异值。U 和 V 中的（抽象）光谱-时间组分按其对实验数据的最小二乘意义下的描述重要性依次递减排列，重要性由对应的奇异值量化。图13A 展示了奇异值随组分序号的变化情况，并重现了 U 的前八个列/组分（抽象光谱，图13B）以及 V 的前八个列/组分（抽象时间轨迹，图13C）。信号主要集中于前五个组分（与包含五个中间态的光循环预期一致），更高序号的组分则主要由随机噪声及其他误差源主导。实验数据的重构仅使用了 U 和 V 的前五列，以及 S 的前五行和前五列。通过 SVD 重构的数据代表了对实验数据在秩为五的矩阵下的最优最小二乘逼近。重构后的数据质量得到显著提升（图10B），具体表现为噪声大幅降低，同时基线中一些原本难以察觉的波动和漂移也得以抑制（这在时间分辨步进扫描光谱中较为常见²⁵）。SVD 处理在改善毫秒量级实验时间轨迹的质量方面尤为有益（图12 中的红线）。

使用上述透射实验方案（图14A）获得了ChR2光循环的时间分辨步进扫描数据，累计测量时间约为120小时。步进扫描采集的时间分辨数据范围从6.25 µsec延伸至125 msec。ChR2的光循环完全恢复约需60秒。光循环的后期阶段可通过快速扫描傅里叶变换红外光谱（rapid-scan FT-IR）覆盖，且步进扫描与快速扫描数据集可合并处理，方法见其他文献⁴⁸。ChR2的光谱变化幅度约为bR的十分之一，因此测量更具挑战性。特别是在毫秒范围内的基线漂移在如此低的吸收变化下变得尤为明显。这些漂移源于动镜在毫秒时间尺度上的微小振荡²⁵。通过奇异值分解（SVD）可显著去除这些振荡及部分噪声，从而极大改善数据的外观（图14B）。

图1. 紫膜中细菌视紫红质（bR）在ATR附件金刚石表面干燥后的吸收光谱。 标注了肽键振动（酰胺I、II和A）对应的吸收带。

图2. 使用不同离子强度缓冲液（4 M NaCl 的稀释液，100 mM Na）复水后 bR 薄膜的吸收光谱₂HPO₄/NaH₂PO₄ 在 pH 7.4 时。 注意酰胺II带的减弱， 即，随着缓冲液离子强度降低，薄膜溶胀增加。（插图）通过1,541 cm处吸光度强度定量的靠近表面的蛋白质相对含量^-1 （减去缓冲液吸收贡献后的酰胺II带最大值）

图3. 用本体缓冲液（4.3 M 离子强度）再水合的bR薄膜的吸收光谱，以及扣除缓冲液贡献后的光谱。 差减因子0.87的选择是为了消除3,700–3,000 cm^-1范围内的强水吸收峰，并使2,700–1,800 cm^-1范围内的基线保持平坦。

图 4. 紫膜蛋白（bR）在用离子强度为 4.3 M 的缓冲液再水合后的吸收光谱（为清晰起见，已扣除缓冲液吸收，方法同图 3）。 插图显示了再水合后薄膜溶胀的演变过程，通过蛋白质酰胺 II 键在 1,541 cm^-1 处的吸光度进行追踪。单指数拟合表明薄膜溶胀达到稳定的时间常数为 12 分钟。

图5. 通过透射法测得的 ChR2 水合薄膜的吸收谱（蓝色线）。 水的消光系数谱（虚线橙色线）和 DM 的消光系数谱（虚线青色线）经标度后被扣除（红色线）。

图6. 在25 °C下液态水（http://www.ualberta.ca/~jbertie/JBDownload.HTM#Spectra）和水合ADP/ATP载体（AAC）薄膜的质量消光系数光谱的再现结果⁶⁴。 DM（100 mg/ml）的质量消光系数光谱在溶液中测得，bR的质量消光系数光谱则在水合薄膜中测得。

图7. 时间分辨扫描-扫描傅里叶变换红外测量中所用光学滤光片的透射率。

图8. Nd:YAG激光器的二倍频（532 nm）输出激光脉冲的性能。 1,000个激光脉冲的相对能量变化直方图，拟合为标准差为0.05的高斯分布。

图9. bR在三个代表性波数下等时间间隔的光诱导吸光度变化（绿色、黑色和蓝色曲线），以及经准对数平均至约每十倍频程20个数据点后的结果（红色曲线）。 注意对数平均后的噪声显著降低，揭示了毫秒时间尺度上时间轨迹的振荡行为。

图10. 在 pH 7.4（4 M NaCl，100 mM NaPi）条件下通过ATR记录的bR光诱导吸光度变化的三维表示。A) 原始数据。B) 使用五个SVD组分重构的数据。请点击此处查看该图的高清版本。

图11. bR光循环在三个选定时间点的傅里叶变换红外（FT-IR）差示吸收光谱，此时L（12.5 µsec）、M（300 µsec）和N（6 msec）中间体的含量最高。

图12. 利用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外差谱技术解析bR光循环中的质子转移与蛋白质骨架动力学。 在 1,762 cm 处的吸光度变化^-1 报道了Asp85的质子化/去质子化动力学，并在1,741 cm⁻¹处^-1 关于 Asp96 去质子化/再质子化动力学的研究（包括质子化前氢键变化） 300 μsec）。1,670 和 1,555 cm⁻¹ 处的时间轨迹^-1 报告了对肽骨架构象敏感的酰胺 I 带和酰胺 II 带振动的变化。背景曲线对应原始数据，红色曲线对应经SVD处理的数据。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图13. bR光循环实验时间分辨步进扫描傅里叶变换红外数据的奇异值分解（SVD）（参见图10A）。 在考虑波数对噪声标准偏差的依赖性后，对实验数据进行加权，随后执行了SVD分析。图15）；结合1^st 微分处理以降低基线波动的统计权重，具体方法如前所述⁵⁷. A) 前50个组分的相对奇异值图（黑色圆圈）。前五个组分被指定为信号组分（红色圆圈）。其余组分呈指数衰减，符合噪声组分的预期特征（见虚线灰色线）。 B) 前八个抽象光谱（U₁ 至 U₈). C) 前八个抽象时间轨迹（V₁ 到 V₈）。指派给信号的抽象光谱和时间轨迹用红线表示，其他情况用黑线表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图14. 采用步进扫描法在透射模式下记录的 ChR2 光诱导红外吸光度变化的三维表示。 步进扫描数据持续至 125 msec，仅覆盖光循环的一部分。A) 原始数据。B) 使用五个 SVD 组分重构的数据。请点击此处查看此图的放大版本。

图15. 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）中估计的噪声水平。 在每次镜面位置采集1次累加（500次光反应）或约200次累加（10⁵次光反应）的实验条件下，时间分辨率为6.25 μsec、光谱分辨率为8 cm^-1时获得的差示吸收光谱。图中显示了衰减全反射（ATR）和透射模式下的结果。

讨论

在对蛋白质进行时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱（FT-IR）实验时，首先需要考虑的一个方面是将样品制备成适合红外光谱分析的形式。必须尽量减少除目标蛋白质以外其他物质的红外吸收，尤其是水的吸收。最常用的方法是将样品中的大部分水分蒸发，形成薄膜。该薄膜可通过滴加少量水溶液或将其暴露于受控湿度的环境中进行再水合。我们已展示在这两种情况下，均可通过红外吸收光谱法估算所达到的水合程度（见图3和图5）。尽管所得的水合水平与溶液中的相比可能显得较低，但实际上接近活细胞内的水合状态⁷⁰，因此对水合蛋白质薄膜的研究具有功能相关性。除了水之外，还必须了解并控制样品中脂质或去污剂的含量。两者的含量均应足够低，以减少其在红外吸收中的光谱干扰，但又需足够高，以维持目标蛋白质的完整性和功能活性。

时间分辨步进扫描光谱法仅可直接应用于可通过光重复触发可逆反应的蛋白质（但参见步进扫描与快速缓冲液交换联用方面的进展⁷¹）。在步进扫描中，反应至少需要重复约 500 次，这是完成覆盖 1,800–850 cm^-1 区域、分辨率为 8 cm^-1 的干涉图所需的最少次数。然而在实际操作中，通常需要进一步的数据累加以降低噪声水平。对于每个镜面位置进行 200 次累加（即反应重复 10⁵ 次），可在 ATR 实验中获得分辨率为 6.25 μsec 的吸收差谱，其噪声标准偏差介于 2 × 10^-5 至 2 × 10^-4 之间，在透射实验中则介于 5 × 10^-6 至 3 × 10^-5 之间（图15）。由于透射模式具有更高的光子通量，其噪声水平比 ATR 低约 7 倍，这对于成功研究如 ChR2 等产生微弱吸收变化的样品尤为关键。另一方面，ATR 实验所需的样品量比透射实验少 5 至 25 倍。

对于具有缓慢光循环的蛋白质而言，应用时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱（FT-IR）存在困难：通过步进扫描记录干涉图可能需要过长的时间，变得不切实际。已有若干方法被提出以应对这类情况^72,73，这些方法通常依赖于使用多个可更换样品，以加快测量速度，但代价是增加蛋白质消耗和实验复杂性^27,74。在某些情况下，可在光循环尚未完全结束时即对样品进行再次激发，从而绕过此问题。以ChR2为例，其光循环在光激发后需要60秒才能恢复99%，但在4秒时恢复程度已达到80%⁴⁸。若每次激光脉冲的激发效率为10%，则在光激发后4秒，已有98%的ChR2分子回到暗态，因此可实现以0.25 Hz的激光重复频率进行实验。

数据处理是获得最佳结果所需的最后一个技术环节。对数平均可以降低噪声，更重要的是，它能在不引入失真的情况下减小数据量，这一特性对于后续使用奇异值分解或全局拟合进行数据分析至关重要。然而，对数平均在消除测量过程中由移动镜的振荡及其他1/f噪声源引起的时间轨迹波动方面效果有限（图9）。这些基线波动可能超过毫秒范围内的噪声水平，从而影响数据质量。奇异值分解利用数据的冗余性来降低噪声，经过一些改进后⁵⁷，也可有效减少基线波动。

最后，时间分辨步进扫描傅里叶变换红外光谱（FT-IR）实验中最困难且最耗时的部分是对谱带的归属以及对数据的光谱和动力学解释。对于细菌视紫红质，由于多年来众多研究团队的积累工作，其红外差谱中出现的许多谱带已被归属或解释。而对于研究较少的蛋白质（如通道视紫红质-2），上述时间分辨红外实验需要与定点突变体的平行实验相结合，并辅以其他互补技术提供的信息，才能实现对反应机理的解释⁴⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
傅里叶变换红外光谱仪	Bruker	Vertex 80v	配备光伏型MCT检测器、外部全局接口和无油泵，固件版本2.3。
BaF2窗口片	korth Kristalle
金刚石ATR附件	Smiths detection		九次反射DuraDisk
恒温浴槽	Julabo	F25
隔振光学平台	OPTA
带倍频器的脉冲Nd:YAG激光器	Continuum electro-Optics	Minilite
光学参量振荡器（OPO）	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
数字延时/脉冲发生器	Stanford Research Systems	DG535
带三倍频器的脉冲Nd:YAG激光器	Spectra-Physics	Quanta-Ray
各类光学反射镜和透镜	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		用于控制Vertex 80v光谱仪的软件
MATLAB运行环境	Mathworks		用于运行自编可执行程序以预处理数据