体内T细胞应答评估用荧光靶标阵列的应用 In vivo

摘要

详细监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTAs）在一种 体内 评估T细胞功能的检测方法 >通过流式细胞术同时检测250个参数。

摘要

监测T细胞反应的能力 体内 对于深入理解免疫应答机制以及设计免疫疗法具有重要意义。本文描述了荧光靶标阵列（FTA）技术的应用，该技术利用活细胞染料，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）、紫光激光可激发染料（CellTrace Violet: CTV）和红光激光可激发染料（Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD），对小鼠淋巴细胞进行组合标记 >250 个可分辨的荧光细胞簇。这些 FTA 内的细胞簇可用主要组织相容性复合体（MHC）I 类和 MHC II 类结合肽进行脉冲处理，从而作为 CD8 的靶细胞⁺ 和 CD4⁺ T细胞。这些FTA细胞保持存活且功能完整，因此可被注射到小鼠体内，以评估CD8⁺ T细胞介导的FTA靶细胞杀伤及CD4⁺ T细胞对FTA B细胞靶细胞的实时辅助作用 体内 通过流式细胞术。由于 >可同时检测250个靶细胞，该技术能够监测T细胞对多个抗原表位在不同浓度下的应答，并可进行多次重复实验。因此，该技术可从定量（例如 反应的累积强度）和定性（例如. 功能亲和力和应答的表位交叉反应性水平。在此，我们描述了这些FTA的构建方法，并举例说明其在评估重组痘病毒疫苗诱导的T细胞应答中的应用。

引言

T细胞在适应性免疫应答中发挥核心作用，常被作为免疫治疗中进行干预的靶点。CD4⁺效应T细胞通过分泌细胞因子来响应外来抗原，这些细胞因子可调控免疫反应的多个方面，并可直接辅助B细胞产生抗体。CD8⁺细胞毒性T细胞（CTLs）也能通过分泌细胞因子来响应外来抗原，并在直接杀伤表达外来抗原的细胞过程中发挥核心作用。启动这些T细胞效应功能的基本相互作用，是T细胞受体（TCR）与细胞表面MHC分子上呈递的外来肽段之间的结合。CD4⁺T细胞识别抗原呈递细胞表面MHC II类分子所呈递的肽段，而CD8⁺T细胞则识别通常表达于微生物感染细胞表面的MHC I类分子所呈递的肽段。

为了评估T细胞在免疫应答中所起的作用，必须采用可靠且灵敏的技术来检测其效应功能。常用的T细胞应答检测方法包括：MHC I类/II类/肽四聚体反应性检测、酶联免疫斑点法（ELISPOT）和胞内细胞因子染色法检测细胞因子产生，以及通过细胞杀伤实验检测其杀伤能力 ⁵¹Cr释放实验。然而，这些实验通常进行 离体 与 体外 刺激，或对T细胞功能提供有限的见解。理想情况下，在测量T细胞反应时，最好能够评估它们 原位, 体内 因为它们的发生不涉及对T细胞的操作，从而避免因操作导致的功能参数改变 体外 刺激。一些最常用的 体内

方案

注意：本方案所使用的小鼠均按照澳大利亚国立大学动物实验伦理委员会的指南进行操作，小鼠通过颈椎脱位法实施安乐死。

1. 染料与多肽的制备

1. 染料制备
   注意：染料预先稀释成不同浓度，以便在不同的荧光强度下标记细胞。CFSE 使用七种浓度，通过 3.5 倍连续稀释获得；CTV 和 CPD 使用六种浓度，通过 3.7 倍连续稀释获得（见表 2-4）。表 2-4 中列出的染料储备浓度将用于将靶细胞标记至表 2-4 中所列的最终染料浓度。染料在接触水溶液后会发生反应，因此在打开染料瓶前，必须先将染料瓶平衡至室温，以尽量减少染料暴露于冷凝水汽中。
   1. CFSE
      注意：CFSE 通常以羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA, SE；分子量 557.47）形式购买，通常为 25 mg/瓶。
      1. 将 25 mg CFSE 溶解于 4.48 ml DMSO 中，得到 10 mM 的储备溶液。
      2. 对 CFSE 进行连续稀释：将 35 μl 的 10 mM CFSE 储备液加入 87.5 μl DMSO 中，重复此步骤使用稀释后的储备液，以获得表 3中所列的每种染料浓度。
   2. CTV
      注意：CTV....

结果

作为FTA检测应用的一个示例，一只BALB/c小鼠用表达HIV-I表位（VV-HIV）的重组痘苗病毒（VV）进行免疫，并通过252参数的FTA检测评估其对HIV-I CTL表位Gag、Gag mut、Env和Pol，VV CTL表位F2L和F2L mut，以及HIV-I T_H细胞表位Gag Th（如文献²所述）的免疫应答（图1B）。Gag（Gag mut）和F2L（F2L mut）的表位变异体不在VV-HIV载体中表达，因此针对这些表位的应答反映了表位变异体交叉反应性T细胞应答。同时，将未经免疫的 naïve 小鼠注射FTA作为阴性对照。通过PKH-26标记将FTA与宿主小鼠细胞区分开，并通过B220抗体染色在流式细胞术中区分FTA中的B细胞（图1A和图1B）。每个动物体内6个重复样本根据CPD荧光进行设门（图1C），而表达不同浓度表位的FTA靶细胞则根据CFSE和CTV荧光进行设门（图1D）。通过比较免疫动物中FTA聚集体的.......

讨论

基于FTA的检测方法的优势在于能够区分 >通过流式细胞术从单个宿主动物中分离出250个有活力且功能完整的靶细胞群体。这为研究带来了相当程度的复杂性 体内 基于流式细胞术的检测方法，实现了以往无法完成的实验。上述两项动物实验突显了该方法的优势：在单个动物体内，可同时对6个重复样本中7种不同病毒表位在6个浓度下的反应进行监测，从而获得AUC、EC等参数₅₀ 待确定T细胞应答 体内.

除了检测T细胞反应外 体内，基于FTA的检测方法可被改进以测量反应 体外¹这基本上涉及将FTAs加入培养的T细胞中，以在数小时内测量其反应。 体外一个可能的局限性在于 体外基于FTA的检测方法存在一个倾向，即FTA内被标记的细胞会将标记染料转移至周围细胞^1,3这可能导致FTA细胞簇的分辨率降低，因为各群体之间的荧光差异变得不那么明显。这一现象在 体外 与相比的检测方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	Sigma	R8758
胎牛血清	Serana	FCS-500
CTV	Invitrogen	C34557
CFDA, SE	Invitrogen	C1157
CPD	eBioscience	65-0840-90
抗-B220 PerCp-Cy5.5	eBioscience	110730
抗-CD69 brilliant violet 605	Biolegend	104529
PKH-26	Sigma	PKH26GL-1KT
涡旋振荡器	Scientific Industries Inc
离心机	Eppendorf
流式细胞仪（Fortessa 或具有蓝色、红色和紫色激光源的同等设备）	BD Bioscience