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单通道细胞贴附式膜片钳记录

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DOI：

10.3791/51629

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2014年6月9日

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1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用细胞贴附式膜片钳技术，从单个离子通道获得长时间电流记录的操作步骤。该方法能够实时观察离子通道开闭构象变化的模式，从而揭示生物信号产生的基础。这些数据可提供关于未受干扰的生物膜中离子通道特性的信息。

摘要

离子通道蛋白是生物膜间快速通讯的通用装置。它们所产生的离子流的时间特征取决于每个通道蛋白的内在特性，以及其产生和调控的机制，这是当前研究的重要领域。通过观察单个分子产生的长时间电流，可以获得有关离子通道蛋白运作动态的信息。本文描述了一种获得单通道细胞贴附式膜片钳电流记录的方案，用于在HEK293细胞中异源表达或在皮层神经元中天然表达的配体门控离子通道——NMDA受体。此外，还提供了如何将该方法应用于其他感兴趣离子通道的指导，以机械敏感性通道PIEZO1为例进行了说明。该方法可提供有关通道电导特性及其激活机制中开-闭构象变化的时间序列数据，从而有助于理解这些通道在健康与疾病状态下的功能。

引言

生物膜之间的快速通讯几乎完全依赖于寡聚孔道形成膜蛋白，这类蛋白通常被称为通道。这些蛋白在激活信号、门控机制和电导特性方面存在广泛差异。其孔道对离子具有选择性的通道蛋白被归类为离子通道；它们的激活会在膜上产生离子电流，且其反应可通过电生理技术以高分辨率实时记录。激活信号涵盖多种化学和物理输入，包括浓度梯度、机械力和电场力以及温度，因此可将离子通道进一步分类为配体门控型、机械敏感型、电压门控型或热敏感型。本文描述了使用膜片钳技术记录两种通道单通道活性的实验方案：一种是配体门控通道NMDA受体，另一种是机械敏感通道PIEZO1。 

膜片钳电生理学是首个且应用最广泛的实验方法，其灵敏度足以实现对单个分子的观测1,2。除了这种极高的灵敏度外，该方法还极大地拓展了适用于电生理记录的生物样本范围，并使得在完整膜结构中观察离子通道成为可能。首先，由于电压钳制和电流记录均由同一电极完成，因此该技术可用于记录小细胞或膜片上的信号。该技术揭示，离子通道不仅存在于青蛙肌肉、电鳗电板或鱿鱼巨大轴突等可兴奋膜中3,4，更广泛存在于单细胞或多细胞生物的所有类型细胞膜中，包括细胞内膜系统，是跨膜信号转导机制中普遍存在的基本组分。尤为重要的是，仅需将玻璃微电极贴附于完整细胞表面即可记录跨膜电流，这为在天然、未受干扰的膜环境中记录离子通道活性提供了前所未有的机会。因此，本实验方案所描述的细胞贴附式膜片钳技术，能够在离子通道的天然环境中持续监测其活性达数十分钟甚至更长时间。

在正常的热涨落条件下，所有蛋白质（包括离子通道蛋白）都会在较宽的时间尺度上发生结构变化，其中最快且最频繁的重排最可能表现为侧链运动，而较慢且较少发生的改变则表现为整个结构域或亚基的重新定位，或在某些情况下表现为翻译后修饰或蛋白质-蛋白质相互作用5,6。观察单个分子产生的长时间活性有助于理解完整生理膜中离子通道的功能动力学，并为所观察分子的操作机制提供有价值的信息。 

与目前对不同细胞类型和发育阶段中离子通道多样性的日益深入理解相比，关于天然细胞膜中离子通道分子组成的知识仍然有限。所有离子通道均为多聚体蛋白，且大多数天然离子通道由多种亚基组装而成，从而产生分子多样性广泛的蛋白质，这通常伴随着不同的电导和门控特性。因此，具有明确分子组成的离子通道通常通过在异源表达系统中进行表达来研究。特别是HEK293细胞——一种永生化的人胚胎肾细胞的克隆系7，已被广泛接受为表达重组离子通道的首选系统。将 HEK293细胞作为离子通道电生理学研究的首选系统，其诸多优势包括培养和维持长期稳定细胞系的简便性与低成本，其具备对哺乳动物蛋白进行翻译后折叠、加工和转运的能力，以及在许多情况下，其对目标通道的内源性表达水平极低甚至完全缺失7,8。在HEK293细胞中表达重组离子通道并研究其功能特性，仍是获取离子通道结构-功能关系信息、特定离子通道亚型特性及其在天然组织中作用的重要方法。本文所述的实验方案既适用于在HEK293细胞中表达的重组离子通道，也适用于天然离子通道。

总之，膜片钳技术凭借其无与伦比的单分子信号分辨能力，至今仍是观察单个分子行为的最直接方法。在细胞附着模式下，膜片钳记录可实现长时间的观测，若用于单个分子，可为离子通道的功能机制提供极为深入的见解。以下介绍一种从含有单个离子通道蛋白的细胞附着式膜片上获得高分辨率电流记录的实验方案。

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方案

1. 细胞培养与蛋白表达

  1. 在单层培养条件下维持HEK293细胞（ATCC编号CRL-1573），传代次数控制在22至40代之间（包括ATCC进行的传代），使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM培养基，在5% CO2、37 °C条件下培养。实验间期，将细胞以5-20倍稀释度传代至T25培养瓶中，终体积为10 ml。注意：在此传代范围内使用细胞可确保良好的细胞状态，有利于形成理想的封接和保持膜片稳定性。
  2. 转染时，将HEK293细胞以约105个/皿的密度接种于35 mm培养皿中，相当于每皿接种约0.5-0.6 ml细胞悬液，并加入2 ml培养基培养18-24小时。
  3. 在无菌的1.5 ml离心管中，按以下顺序配制可供四个35 mm培养皿使用的转染混合液：(1) 每种cDNA各1 μg（GluN1、GluN2A和GFP）；(2) 315 μl双蒸水（ddH2O）；(3) 350 μl 42 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；(4) 逐滴加入35 μl 2.5 M CaCl2，用于形成沉淀。
  4. 涡旋振荡管子5秒，然后将175 μl转染混合液分别加入前一天接种的四个35 mm培养皿中（此时细胞融合度约为50-60%），在37 °C孵育2小时。
  5. 吸除转染液，用PBS洗涤一次，更换为含2 mM MgCl2的2 ml生长培养基，以防止NMDA受体介导的兴奋性毒性9。注意：转染后24-48小时可进行电生理记录。

2. 电极制备

  1. 使用垂直拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃管，制备2个对称的记录电极。根据所得尖端的大小和几何形状，进一步使用抛光仪修整电极。注意：尖端尺寸可通过视觉和电学方法评估。视觉上，外径应在1.4–5.6 μm范围内。电学上，当充满细胞外溶液时，理想尺寸的尖端应产生12–24 MΩ范围内的电阻（见图2B）。
  2. 使用一种灌注液，对于细胞贴附式实验，该溶液应模拟可产生最大通道活性和高电流幅度的细胞外环境。注意：对于NMDA受体，该溶液应包含饱和浓度的激动剂（谷氨酸和甘氨酸）、1 mM EDTA（用于螯合二价阳离子抑制剂和阻断剂），并以生理浓度的钠离子（150 mM）作为唯一的通透性离子（单位为mM：1 谷氨酸、0.1 甘氨酸、150 NaCl、2.5 KCl、1 EDTA 和 10 HEPBS，用1 N NaOH调节pH至8.0）。

3. 细胞贴附式膜片钳记录

  1. 打开 QuB 数据采集软件（www.qub.buffalo.edu），在“layout”下选择采集窗口。通过点击“File”下拉菜单中的“New Data”创建一个新的 QuB 数据文件（QDF），并输入以下初始参数：采样率 40 kHz；A/D 缩放 3,000；输出通道 1；A/D 数据大小 2。通过右键点击数据文件，选择“properties”，然后点击“data”选项卡，将幅度缩放调整为 0.1 V/pA。注意：这些参数可使用细胞贴附模式下的模型细胞针对每个实验系统进行优化。有关使用 QuB 软件进行数据采集及 QDF 属性的更多说明，请访问 www.qub.buffalo.edu。
  2. 选择一个含有表达离子通道细胞的 35 mm 培养皿，将培养基替换为含钙和镁的 2 ml PBS；将培养皿安装到显微镜载物台上，使用相差显微镜聚焦细胞区域，以评估细胞健康且以单层形式牢固贴附于培养皿（图 1A）。切换至荧光检测以确认转染成功（图 1B）。注意：荧光强度的范围可作为蛋白表达水平的粗略指标。
  3. 进行单通道记录时，将放大器输出增益设为 ×10，补丁配置设为 β = 1，模拟滤波器设为 10 kHz，模式设为电压钳，施加电压设为 +100 mV。在电压保持命令处于“OFF”位置时，选择“seal test”按钮。
  4. 根据荧光强度和细胞健康状况选择待补丁的细胞。在相差显微镜下确认细胞牢固贴附于培养皿，细胞表面有较大区域暴露可用于补丁，并且整体形态健康。注意：在接近和进行膜片钳操作期间，应保持相差照明，以避免细胞荧光漂白。
  5. 用一支新抛光的移液管吸取适量溶液，使其刚好接触电极，并轻轻摇动以排除可能滞留在尖端的气泡。通过拧紧移液管夹的密封螺丝，将记录移液管固定在放大器头架上，并确保银丝浸入移液管溶液中。
  6. 使用一个小型（5 cc）塑料注射器，通过连接管路与移液管夹相连，轻轻施加正压，以防止杂质进入并在接近过程中堵塞移液管尖端（图 2A）。
  7. 使用显微操作器将移液管导入浴液，并将其定位在选定用于补丁的细胞正上方（图 1C），以闭合电路。注意示波器上的信号，应显示一个矩形波形，对应放大器的封接测试信号（图 2B）。注意：移液管进入浴液后，其电阻在理想范围内为 12–24 MΩ。对于 5 mV 的测试信号，测得的电流范围约为 20–40 pA。
  8. 在通过显微镜目视监测移液管位置的同时，通过示波器电学监测移液管电阻，逐步微调接近，直至移液管轻轻接触细胞，测试信号略有下降，表明电阻增加（图 2B）。
  9. 为形成封接，拿起注射器，通过拉动注射器活塞，经侧向管路施加轻微负压，使细胞膜被吸入记录移液管尖端，从而启动 GΩ 级电阻封接的形成10。注意观察示波器上的测试信号波形，封接形成时波形完全变平，仅可见电容瞬变（图 2B）。注意：若信号未完全变平或基线变嘈杂，表明封接较弱，存在显著的电流泄漏。这将导致无法分辨单个通道电流。若出现此情况，应将移液管从细胞上撤回并移出浴液，从头架上取下并丢弃。使用新抛光的移液管重复操作，直至获得足够质量的封接（≥ 1 GΩ）。
  10. 在放大器上，将外部命令开关从“seal test”切换至“off”；将电压保持命令切换至“正”（此前设为“off”）；并将增益提高至 ×100。在示波器上观察通道活动，若存在活动，将显示为从先前平坦基线上出现的方形向上偏转（图 2C）。
  11. 若示波器上显示通道活动，通过按下“play”按钮，随后按下“record”按钮，将数据采集至此前打开的 QuB 数字文件中。要停止数据采集，按下 QuB 中的停止按钮，并通过“File”下拉菜单中的“Save Data As…”将 QDF 文件保存至计算机硬盘上易于检索的位置。

4. 数据预处理与理想化

注意：通过统计分析可以从单通道记录中提取重要信息，该分析将每个数据点分配到适当的电导类别（在最简单的情况下，为关闭或开放状态）。此过程称为数据理想化，以下简要描述在 QuB 中使用分段 k 均值（SKM）方法11进行数据理想化的过程。

  1. 在 QuB 中打开数据文件，并在“Layout”下的“Pre”界面中查看电流轨迹。通过取消勾选标有“Fc.”的复选框，显示未经过数字滤波的原始记录数据。
  2. 目视检查记录以发现异常和伪迹（图4A）。对于轨迹中出现的短暂电流尖峰（图4A），可通过选择同一电导水平下相邻的干净区域，高亮该区域，右键并选择“set erase buffer”进行校正。放大尖峰至可分辨单个采样点，选中需替换的区域，仅高亮该部分后右键选择“erase”进行擦除。
  3. 通过选择记录早期基线稳定的区域，高亮后右键选择“set baseline”，为整段记录定义零电流基线。请验证出现的参考线是否准确代表基线水平（在 图4B 中以紫色显示）。
  4. 识别原始数据基线明显偏离所设基线的区域。通过在偏离区域内选择一小段基线，右键并选择“add a baseline node”命令进行校正。
  5. 识别记录中包含过多噪声或无法轻易校正的伪迹区域（图4C）。高亮需删除的区域，右键并选择“delete”。注意：此操作将导致动力学信息丢失：处理后的记录会变短，拼接点之后的数据点将看似与噪声前区域连续。
  6. 使用 SKM 算法11对记录进行理想化处理时，首先高亮轨迹中包含开放和关闭事件的部分，进入“Layout”下的“Mod”界面。在“model”面板中，高亮一段能代表整个文件基线的干净轨迹区域，右键黑色方块（关闭态）并选择“grab”。对通道开放事件，高亮开放电导区域，右键“model”面板中的红色方块并选择“grab”。
  7. 通过在“Data Source”下的“File”按钮中选择整个记录进行理想化处理。右键“Modeling”部分下方的“Idealize”标签，确认分析所需参数设置正确，然后点击“Run”。理想化结果以及整段文件的幅度直方图将叠加在原始数据上，以便直观检查理想化效果（图5）。注意：理想化不充分可能导致生成“假事件”，即 QuB 检测到并未真实发生的通道开闭事件。在由放大器模拟滤波器和采样率决定的记录分辨率范围内，SKM 检测开/闭事件的分辨率可通过设置分析的“dead time”进行控制。最佳 dead time 需通过试错法确定，且依赖于采样率，但通常的经验法则是选择 2–3 个采样点的 dead time12。
  8. 为验证理想化结果是否准确反映原始数据，需手动扫描理想化轨迹。若发现理想化错误，高亮假事件所在轨迹段，右键并选择“Join Idl”。注意：有关 QuB 中各项命令和功能的更多选项及详细说明，请参阅 QuB 在线手册（www.qub.buffalo.edu）。

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结果

重组NMDA受体

NMDA受体结合并响应两种共激动剂的协同作用：谷氨酸和甘氨酸。它们由两个结合甘氨酸的GluN1亚基和两个结合谷氨酸的GluN2亚基组装成异源四聚体。GluN2亚基由四个基因（A-D）编码，其中在脑组织中转录最广泛的亚型为成年动物中的GluN2A和幼年动物中的GluN2B。由于天然样本中NMDA受体亚型具有多样性，在HEK293细胞中表达受体（图1A）可实现对亚基组成的控制，同时也能够使用精细抛光的玻璃移液管记录通道电流（图1C）。

当移液管接触到细胞时，测试脉冲波形的幅度会明显降低（图2B），表明已具备形成封接的能力。一个包含单个通道的良好封接会产生清晰的通道活动，表现为基线向下的偏转，在施加正电压时具有良好的信噪比（图2C）。当两种激动剂均以高浓度存在，且无抑制剂和通道阻断剂时，可实现野生型重组NMDA受体的最大通道活性。这种条件较为理想，...

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讨论

在离子通道研究领域，一个重要的研究方向是阐明导致通道开放或通道门控机制的一系列事件。对于大多数通道而言，这一过程十分复杂，涉及多个动力学步骤，而这些步骤无法从宏观的多通道信号中推导得出。相比之下，通过设计实验观察单通道记录中开放/关闭事件的序列，可以获得关于门控机制的更详细信息。本文所述方法利用了NMDA受体所具有的胞外配体结合域，从而可在恒定条件下进行微创的膜片钳记录。根据配体和受体的特性，该方案可能需要适当调整，方可适用于其他配体门控离子通道的研究。

单通道活性记录提供了两类有价值的信息。首先，由于可以直 接测量单通道电流幅度，因此可设计实验以获取有关孔道特性的信息，例如通道电导、通透性和选择性。其次，由于开放和关闭事件的持续时间也可从记录中直接测量，因此可设计实验以获得有关门控行为的动力学信息，从而推断通道的操作机制。对于这两类实验，有意义的统计分析都需要将电流轨迹中的每个单独数据点归类到特定的电导类别中。本文介绍了一种实现该目的的方法，即使用分段k-均值（SKM）11算法，但也可通过其他多种复杂程度不同的算法实现，包括半阈值法、SCAN12<...

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披露

本文作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作由F31NS086765（KAC）、F31NS076235（MAP）、R01 NS052669（GKP）和EIA9100012资助。  作者感谢Eileen Kasperek在分子生物学和组织培养方面的专业知识和帮助；感谢Jason Myers分享了早期前额叶皮层神经元的相关数据。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂SigmaVarious
硼硅酸盐玻璃SutterBF-150-86-10
明场倒置显微镜Olympus1x51Nikon 也提供类似显微镜
荧光光源箱X-citeSeries 120
液体光导管X-citeOEX-LG15
微操纵器Sutter InstrumentsMP-225
示波器TektronixTDS1001
放大器Molecular DevicesAxon Axopatch 200B
防震台TMC63561
NIDAQ 数据采集卡National Instruments776844-01
拉针仪NarishigePC-10
电极抛光仪NarishigeMicroforge MF-830
法拉第屏蔽笼TMC8133306
高速压力钳ALA Scientific InstrumentsALA HSPC
压力/真空泵ALA Scientific InstrumentsALA PV-PUMP用于 HSPC-1

参考文献

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NMDA PIEZO1 HEK293 QUB

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