本文介绍了一种利用细胞贴附式膜片钳技术，从单个离子通道获得长时间电流记录的操作步骤。该方法能够实时观察离子通道开闭构象变化的模式，从而揭示生物信号产生的基础。这些数据可提供关于未受干扰的生物膜中离子通道特性的信息。
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本文内容
摘要
摘要
离子通道蛋白是生物膜间快速通讯的通用装置。它们所产生的离子流的时间特征取决于每个通道蛋白的内在特性，以及其产生和调控的机制，这是当前研究的重要领域。通过观察单个分子产生的长时间电流，可以获得有关离子通道蛋白运作动态的信息。本文描述了一种获得单通道细胞贴附式膜片钳电流记录的方案，用于在HEK293细胞中异源表达或在皮层神经元中天然表达的配体门控离子通道——NMDA受体。此外，还提供了如何将该方法应用于其他感兴趣离子通道的指导，以机械敏感性通道PIEZO1为例进行了说明。该方法可提供有关通道电导特性及其激活机制中开-闭构象变化的时间序列数据，从而有助于理解这些通道在健康与疾病状态下的功能。
引言
生物膜之间的快速通讯几乎完全依赖于寡聚孔道形成膜蛋白，这类蛋白通常被称为通道。这些蛋白在激活信号、门控机制和电导特性方面存在广泛差异。其孔道对离子具有选择性的通道蛋白被归类为离子通道；它们的激活会在膜上产生离子电流，且其反应可通过电生理技术以高分辨率实时记录。激活信号涵盖多种化学和物理输入，包括浓度梯度、机械力和电场力以及温度，因此可将离子通道进一步分类为配体门控型、机械敏感型、电压门控型或热敏感型。本文描述了使用膜片钳技术记录两种通道单通道活性的实验方案：一种是配体门控通道NMDA受体，另一种是机械敏感通道PIEZO1。
膜片钳电生理学是首个且应用最广泛的实验方法，其灵敏度足以实现对单个分子的观测1,2。除了这种极高的灵敏度外，该方法还极大地拓展了适用于电生理记录的生物样本范围，并使得在完整膜结构中观察离子通道成为可能。首先，由于电压钳制和电流记录均由同一电极完成，因此该技术可用于记录小细胞或膜片上的信号。该技术揭示，离子通道不仅存在于青蛙肌肉、电鳗电板或鱿鱼巨大轴突等可兴奋膜中3,4，更广泛存在于单细胞或多细胞生物的所有类型细胞膜中，包括细胞内膜系统，是跨膜信号转导机制中普遍存在的基本组分。尤为重要的是，仅需将玻璃微电极贴附于完整细胞表面即可记录跨膜电流，这为在天然、未受干扰的膜环境中记录离子通道活性提供了前所未有的机会。因此，本....
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方案
1. 细胞培养与蛋白表达
- 在单层培养条件下维持HEK293细胞（ATCC编号CRL-1573），传代次数控制在22至40代之间（包括ATCC进行的传代），使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素混合液的DMEM培养基，在5% CO2、37 °C条件下培养。实验间期，将细胞以5-20倍稀释度传代至T25培养瓶中，终体积为10 ml。注意：在此传代范围内使用细胞可确保良好的细胞状态，有利于形成理想的封接和保持膜片稳定性。
- 转染时，将HEK293细胞以约105个/皿的密度接种于35 mm培养皿中，相当于每皿接种约0.5-0.6 ml细胞悬液，并加入2 ml培养基培养18-24小时。
- 在无菌的1.5 ml离心管中，按以下顺序配制可供四个35 mm培养皿使用的转染混合液：(1) 每种cDNA各1 μg（GluN1、GluN2A和GFP）；(2) 315 μl双蒸水（ddH2O）；(3) 350 μl 42 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）；(4) 逐滴加入35 μl 2.5 M CaCl2，用于形成沉淀。
- 涡旋振荡管子5秒，然后将175 μl转染混合液分别加入前一天接种的四个35 mm培养皿中（此时细胞融合度约为50-60%），在37 °C孵育2小时。
- 吸除转染液，用PBS洗涤一次，更换为含2 mM MgCl....
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结果
重组NMDA受体
NMDA受体结合并响应两种共激动剂的协同作用：谷氨酸和甘氨酸。它们由两个结合甘氨酸的GluN1亚基和两个结合谷氨酸的GluN2亚基组装成异源四聚体。GluN2亚基由四个基因（A-D）编码，其中在脑组织中转录最广泛的亚型为成年动物中的GluN2A和幼年动物中的GluN2B。由于天然样本中NMDA受体亚型具有多样性，在HEK293细胞中表达受体（图1A）可实现对亚基组成的控制，同时也能够使用精细抛光的玻璃移液管记录通道电流（图1C）。
当移液管接触到细胞时，测试脉冲波形的幅度会明显降低（图2B），表明已具备形成封接的能力。一个包含单个通道的良好封接会产生清晰的通道活动，表现为基线向下的偏转，在施加正电压时具有良好的信噪比（图2C）。当两种激动剂均以高浓度存在，且无抑制剂和通道阻断剂时，可实现野生型重组NMDA受体的最大通道活性。这种条件较为理想，.......
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讨论
在离子通道研究领域，一个重要的研究方向是阐明导致通道开放或通道门控机制的一系列事件。对于大多数通道而言，这一过程十分复杂，涉及多个动力学步骤，而这些步骤无法从宏观的多通道信号中推导得出。相比之下，通过设计实验观察单通道记录中开放/关闭事件的序列，可以获得关于门控机制的更详细信息。本文所述方法利用了NMDA受体所具有的胞外配体结合域，从而可在恒定条件下进行微创的膜片钳记录。根据配体和受体的特性，该方案可能需要适当调整，方可适用于其他配体门控离子通道的研究。
单通道活性记录提供了两类有价值的信息。首先，由于可以直 接测量单通道电流幅度，因此可设计实验以获取有关孔道特性的信息，例如通道电导、通透性和选择性。其次，由于开放和关闭事件的持续时间也可从记录中直接测量，因此可设计实验以获得有关门控行为的动力学信息，从而推断通道的操作机制。对于这两类实验，有意义的统计分析都需要将电流轨迹中的每个单独数据点归类到特定的电导类别中。本文介绍了一种实现该目的的方法，即使用分段k-均值（SKM）11算法，但也可通过其他多种复杂程度不同的算法实现，包括半阈值法、SCAN12<.......
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披露
本文作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本工作由F31NS086765（KAC）、F31NS076235（MAP）、R01 NS052669（GKP）和EIA9100012资助。 作者感谢Eileen Kasperek在分子生物学和组织培养方面的专业知识和帮助；感谢Jason Myers分享了早期前额叶皮层神经元的相关数据。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | Sigma | Various | |
| 硼硅酸盐玻璃 | Sutter | BF-150-86-10 | |
| 明场倒置显微镜 | Olympus | 1x51 | Nikon 也提供类似显微镜 |
| 荧光光源箱 | X-cite | Series 120 | |
| 液体光导管 | X-cite | OEX-LG15 | |
| 微操纵器 | Sutter Instruments | MP-225 | |
| 示波器 | Tektronix | TDS1001 | |
| 放大器 | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| 防震台 | TMC | 63561 | |
| NIDAQ 数据采集卡 | National Instruments | 776844-01 | |
| 拉针仪 | Narishige | PC-10 | |
| 电极抛光仪 | Narishige | Microforge MF-830 | |
| 法拉第屏蔽笼 | TMC | 8133306 | |
| 高速压力钳 | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| 压力/真空泵 | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | 用于 HSPC-1 |
参考文献
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....
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重印与许可
