单通道细胞贴附膜片钳记录

Summary

这里描述的是获得当前记录的很长一段距离与细胞贴附膜片钳技术一种离子通道的过程。这种方法允许观察，实时的背后的生物信号开闭通道构象的图案。这些数据的通知关于在不受干扰的生物膜通道属性。

Abstract

离子通道蛋白是通过生物膜快速通信的通用设备。离子通量它们产生的瞬时签名取决于固有的每个通道蛋白，以及由其所产生和控制的机制的属性和表示当前研究的重要领域。关于离子通道蛋白的经营动态信息，可通过观察当前很长一段由单个分子制造来获得。这里描述的是一种协议，用于获取一条通道细胞贴附膜片钳记录电流为配体门控离子通道，NMDA受体，异源表达在HEK293细胞中或在本地皮层神经元。本发明还提供关于如何通过呈现在机械性敏感通道PIEZO1的例子中，方法适应其他感兴趣的离子通道的指示。这种方法可以对于该通道的电导特性和氧化聚乙烯的时间序列数据提供正封闭构象组成通道的激活机制，从而有助于了解他们在健康和疾病的功能。

Introduction

过生物膜的快速通信几乎完全依赖于低聚孔形成的膜蛋白，通常被称为信道。这些蛋白质在活化信号，门控机制，传导性能有很大的出入。通道蛋白的毛孔是有选择性的离子被列为离子通道;它们的活化产生的离子电流穿过细胞膜，并且它们的响应可以使用电生理技术来记录具有高分辨率的实时性。激活信号跨越的化学和物理输入，包括浓度梯度，机械和电气的力量和温度浩如烟海;因此，进一步的分类离子通道进入配体门控，机械敏感性，电压门控，或热敏感的类型。在这篇文章中，协议被描述为从一个配体门控通道，NMDA受体和机械敏感性离子通道，PIEZO1记录单声道活动，用膜片钳技术。0;

膜片钳电是最早，最广泛使用的实验方法足够灵敏，以允许观察单个分子^1，2。除了这个精致的灵敏度，它已大大扩展了生物制剂适合于电生理记录，并允许离子通道在细胞膜完整的观察。首先，因为这两个电压钳位与当前记录被完成与同一电极，它可以用来通过小的细胞或膜的补丁记录的信号。该技术表明，离子通道并不局限于蛙肌肉，鳗鱼electroplaques或乌贼巨轴突^3，4，而是它们所代表的跨膜信号传导机制无处不装置及有固有的单向或所有细胞膜类型的可兴奋膜多细胞有机体，并且还细胞内膜。进口antly，通过简单的连接玻璃吸管，以完整的细胞，记录跨膜电流的能力提供了前所未有的机会，从离子通道在家乡不间断的膜录制活动。因此，细胞贴附式膜片钳技术，这是在本协议中所述，允许连续监测离子通道的活性数十分钟或在他们的母语环境的时间。 ....

Protocol

1，细胞培养和蛋白表达

1. 保持HEK293细胞通道22和40之间（ATCC编号CRL-1573），它包括由ATCC执行的，在DMEM中单层培养在补充有10％胎牛血清（FBS）的通路，并在5％CO ₂的1％青霉素/链霉素的混合物和37°C。实验之间，传代细胞进T25烧瓶在10毫升的最终体积5-20倍稀释液。注意:在这些通道使用的细胞可以保证良好的健康细胞，这将使以获得最佳的密封形成和补丁的稳定性。
2. 对于转染，板的HEK293细胞于35 mm培养皿中以约10 ⁵细胞/皿的密度，它对应于〜0.5-0.6毫升每皿的细胞悬浮液，并于2ml培养基中生长的细胞18-24小时。
3. 在无菌1.5毫升离心管中，加入（按顺序）四个35mm培养皿准备转染混合物:（1）1微克每一个基因（GluN1，GluN2A，和GFP）的; （2）315微升双蒸水（双蒸₂ O）; （3）350微升42毫4 - （2 -羟乙基）-1 -哌嗪乙磺酸（HEPES），和（4）35微升的2.5M的CaCl ₂滴，这是用于形成沉淀物。
4. 涡流管，持续5秒，并在每四个35mm培养皿中添加175微升转染悬浮液的镀覆的前一天，现在包含的细胞在50-60％汇合，并于室温孵育在37℃下搅拌2小时。
5. 抽吸掉转染培养基，洗净，用PBS并用2ml生长培养基补充了2mM MgCl ₂的更换，以防止NMDA受....

Results

重组NMDA受体

NMDA受体结合并以两个共激动剂随之而来的行动作出回应:谷氨酸和甘氨酸。他们组装成两个甘氨酸异源结合GluN1亚基和两个谷氨酸结合GluN2亚基。 GluN2亚基是由这四个基因（AD）和编码在大脑的最广泛形式的转录是GluN2A在成年和GluN2B在幼龄动物。由于NMDA受体亚型在原生的准备，表达受体在HEK293细胞（ 图1A）允许控制的亚基组成的，以及记录从目前的渠道使用精细抛光的玻璃吸管（ 图1C）的能力的多样性。

一旦吸管接触细胞，明显减少在测试中的脉冲波形的振幅发生（ 图2B），这表明以形成密封的能力。含一个足够的密封通道产生清晰通道活性，显示为从基线向下变形，具有良好的信号为正电压（ 图2C）的噪声提出申请的比例。可以实现对野生型重组NMDA受体通道的最大活动时，两个受体激动剂是目前在高浓度的，当抑制剂和通道阻滞剂缺席。这是理.......

Discussion

在离子通道字段，一个重要的研究领域致力于了解的事件，导致信道的开口或通道的门控机制的序列。对于大多数信道，该过程是复杂的，涉及不能从宏观的多声道信号推导出几个反应步骤。相比之下，实验可设计其中观察在单通道记录打开/闭合事件的顺序可以产生约门控机制的更详细的信息。在这里所描述的方法，由NMDA受体所具有的位于外部的配体结合域允许将在恒定条件下执行微创的膜片钳记录。这个协议可能需要被修改以适合于调查其他的配体门控离子通道取决于这两个配位体和受体的性质。

单通道活动的记录提供了两种类型的有价值的信息。首先，由于整体式电流振幅，可直接测量，实验可设计成获得关于孔隙性质如沟道电导，渗透性和选择性的信息。第二，由于打开和关闭事件的持续时间，也可以直接从记录测量，实验可设计成获得关于门控动力学信息，因此，使左右通道的操作机构的推论。对于这两种类型的实验，有意义的统计分析需要分级每一个人​​的一点从目前跟踪到一个特定的电导类。这里介绍的是这样的一个这样的方法，通过使用段的^{k-means（SKM）11}算法，但是，这可以由几个或多或少复杂的算法，包括半阈值，扫描¹²

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化工产品	Sigma	各种
硼硅酸盐玻璃	Sutter	BF-150-86-10
明场倒置显微镜	Olympus	1x51	尼康也有类似的显微镜
Fluroescent box	X-cite	Series 120
液体光导	X-cite	OEX-LG15
显微作器	Sutter Instruments	MP-225
示波器	Tektronix	TDS1001
放大器	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ 卡	National Instruments	776844-01
拉拔器	Narishige	PC-10
抛光器	Narishige	Microforge MF-830
法拉第笼	TMC	8133306
高速压力夹	ALA 科学仪器	ALA HSPC
加压/真空泵	ALA 科学仪器	ALA PV-PUMP	用于 HSPC-1