一种透化方法 果蝇 用于小分子活性检测的胚胎

摘要

向发育中的Drosophila胚胎引入小分子化合物在表征新型化合物、药物和毒素的生物活性，以及探究基本发育通路方面具有巨大潜力。本文所述方法概述了克服该方法天然屏障的步骤，从而拓展了Drosophila胚胎模型的应用价值。

摘要

果蝇（Drosophila）胚胎长期以来一直是阐明控制发育的分子与遗传机制的强大实验室模型。该模型易于进行遗传操作，因而取代了在其他动物模型和基于细胞的检测中常见的药理学方法。本文描述了一种最新改进的实验方案，可用于将小分子应用于发育中的果蝇胚胎。该方法详细说明了在保持胚胎活力的同时克服卵壳不通透性的各个步骤。通过使用先前报道的d-柠檬烯胚胎通透性溶剂（EPS¹），并在处理前将胚胎在较低温度（18 °C）下老化，可在广泛的发育阶段实现卵壳的通透化。此外，本文还介绍了一种远红染料（CY5）作为通透化指示剂的使用方法，该染料与后续实验中常用的红色和绿色荧光染料兼容，适用于活体或固定样品的分析。该实验方案可用于利用生物活性化合物研究发育机制，也适用于评估未知小分子的致畸性或药理活性的研究。

引言

该 果蝇 胚胎仍然是研究发育基本机制的首选模型²这一强大的模型得到了一系列分子遗传学工具的支持，这些工具能够在任何时间点及任何发育器官中对几乎所有基因进行操作。其个体小巧、发育迅速，且形态发生过程已被广泛表征 果蝇 胚胎使其成为遗传筛选的首选模型，许多此类筛选已揭示了基本的发育通路^3,4. 多种表型在 果蝇 胚胎表型特征明确且易于解读，常可借此识别导致异常性状的潜在分子遗传学机制。

从历史上看，果蝇胚胎模型的一个不足之处在于难以将小分子引入胚胎组织。这一障碍导致了以下两方面的局限性：1）无法利用已知的生物活性小分子作为探针来研究发育机制；2）无法利用这一成熟的模型来评估未知小分子的致畸性或药理活性。因此，果蝇胚胎在小分子活性表征方面的筛选潜力尚未得到充分利用。

向果蝇胚胎递送小分子可通过两种方法实现：1）卵壳通透化处理；2）显微注射。本文介绍了一种在常规 Drosophila 实验室条件下易于操作的卵壳通透化方法的改进。值得注意的是，近年来基于微流控技术的显微注射方法也在不断发展，为向胚胎引入化合物提供了新的途径^5,6。果蝇卵壳的蜡质层会阻碍分子进入胚胎⁷。Drosophila 卵壳由五层结构组成，从内到外依次为：卵黄膜、蜡质层、内绒毛膜层、内壳膜和外壳膜⁸。通过将胚胎短暂浸入稀释的漂白剂中，可去除最外层的三层绒毛膜结构，该步骤称为去壳（dechorionation）。随后，暴露出来的蜡质层可通过有机溶剂（如庚烷和辛烷）处理而被破坏^7,9，从而使去壳后的胚胎具备通透性，同时仍保留其下方的卵黄膜包裹结构。然而，这些有机溶剂具有毒性，且其强烈的通透化作用难以精确控制，这两方面因素均会显著降低胚胎的存活率^9,10。

先前已描述了一种使用称为胚胎通透化溶剂（embryo permeabilization solvent, EPS）的组分进行通透化的方法¹。该溶剂由d-柠檬烯和植物来源的表面活性剂组成，使其能够与水相缓冲液混溶。由于d-柠檬烯的低毒性以及可将溶剂稀释至所需浓度的特性，该方法能够有效制备具有高存活率的通透性胚胎¹。然而，两种内源性因素仍持续限制其应用。首先，即使在严格控制胚胎发育阶段的情况下，经EPS处理后的胚胎在通透性上仍表现出异质性。其次，孵化后约八小时以上的较老胚胎难以实现通透化，这与产卵后卵壳逐渐硬化的过程一致¹¹。

本文介绍了一种EPS方法的改进，该改进：1）有助于识别和分析近乎相同通透程度的胚胎，即使在固定和免疫染色步骤完成后仍可进行；2）能够实现对发育后期阶段（>8 小时，12期及以后）胚胎的通透处理。具体而言，本文描述了一种远红染料CY5羧酸的应用，该染料可作为通透性指示剂，在胚胎发育过程中以及甲醛固定后仍保留在胚胎内。此外，结果表明，在18 °C条件下培养胚胎可使卵壳保持对EPS敏感的状态，从而实现对晚期胚胎（12–16期）的通透处理。

这些进展克服了前述EPS方法的局限性。因此，该应用将为研究人员提供一种手段，可在胚胎发育的特定时间点引入感兴趣的小分子，同时保持胚胎的存活能力。

方案

1. 果蝇培养物、溶液及胚胎操作装置的准备

1. 准备一个笼养培养 黑腹果蝇将500只以上目标品系的交配果蝇放入带有10 cm葡萄糖琼脂平板和少量酵母糊的群体培养笼中。在25 °C、湿度可控的培养箱中维持培养。注意： 笼养培养需要经过一到两天的驯化，以获得稳定的胚胎产出模式。在驯化期间，每天早晨和晚上各更换一次含酵母糊的葡萄培养板。
2. 制备 EPS。在 37 °C 下预热表面活性剂（椰油酰胺 DEA 和乙氧基化醇）溶液。用移液器将 18 ml 的 d-柠檬烯加入一个带有小型搅拌子的玻璃闪烁瓶中。再分别加入 1 ml 的两种表面活性剂（每种终浓度为 5%），充分混合后取出搅拌子。注意：该 EPS 储存液在室温下可稳定保存约 2 个月。使用前需在 37 °C 下加热并轻轻涡旋，以充分溶解表面活性剂。EPS 和 d-柠檬烯应储存于玻璃容器中，因为它们会随时间推移溶解某些塑料材料。
3. 配制胚胎去壳液、孵育培养基、染料和药物溶液。将25 ml 次氯酸钠溶液与25 ml H₂O，并放入浅盘中。根据之前的配方配制改良基础孵育培养基（MBIM）和 MBIM-T^1,12. 按照生产商的说明书配制Shields和Sang M3细胞培养基及PBS（见材料列表）。用DMSO配制10 mM浓度的透化染料储备液。
4. 组装胚胎操作装置和所需用品：
   1. 制备去卵膜和EPS处理篮（参见 图1A）。用细齿锯切下一节3 cm长的一次性50 ml聚丙烯离心管/培养管。将管段在固定于实验台表面的砂纸上摩擦，使焊接面平整。将管段边缘在火焰上熔化后，压在玻璃板上的Nitex尼龙网上进行焊接。冷却后剪去多余的网膜。注意：管壁与底部垂直，便于在相应步骤中快速且彻底地冲洗掉残留的次氯酸钠和EPS。 焊接步骤应在通风橱内进行。
   2. 制备一个发育篮。将一个50 ml离心管/培养管的顶部切下，使其与管盖边缘齐平。通过在盖子中央切出一个开口，并在边缘切出若干缺口，对盖子进行移除和改造，具体如图所示。 图1B将盖子拧到网格上，并旋紧在截断的管段螺纹上，修剪多余的网格。注意：盖子边缘带有缺口，当其置于60 mm储液皿中时，可允许物质向主体培养基扩散。图1B’).
   3. 准备载片腔室的组件。裁剪一块比载片腔室开口更大的DO膜。在开口内侧边缘涂抹极薄的一层真空脂。将DO膜固定于开口处，并用固定环将其压紧在真空脂上以实现密封。通过沿固定环附近剪除多余部分来修整DO膜。注意：载片腔室的规格可参见Kiehart 等¹³该装置尚未商业化，需通过机械加工车间定制加工。

2. 胚胎的分期、去膜及EPS处理

1. 通过定时收集对胚胎进行分期。在上午将新鲜的葡萄/酵母培养板放入果蝇培养笼中，在25 °C条件下让果蝇产卵1小时。弃去该培养板，更换为新的葡萄/酵母培养板，继续在25 °C条件下产卵2小时。收集该培养板并转移至18 °C培养箱中，以进行进一步的发育分期。注意：在25 °C下发育1小时相当于在18 °C下发育2小时。18 °C与25 °C老化处理对维持晚期胚胎EPS通透性的影响可见于 图2.
2. 脱膜。用25 °C自来水和画笔轻轻将胚胎从葡萄糖培养皿冲洗至筛网篮中。在筛网篮中用轻柔的自来水流冲洗胚胎，去除多余的酵母。将筛网篮浸入50%次氯酸钠溶液中2分钟。用自来水流彻底清洗胚胎。注意：使用塑料移液管间歇性地轻轻将次氯酸钠溶液喷洒在胚胎上。虽然通常2分钟足以完成完全脱膜，但仍需通过直接观察检查孵育时间，并据此进行调整。将脱膜后的胚胎保留在浸于自来水中的筛网篮内，并立即进入EPS步骤。
3. EPS 处理
   1. 准备六个60 mm培养皿，每皿中加入约10 ml PBS。在50 ml玻璃烧杯中，通过涡旋混合将75 µl EPS溶于2.925 ml MBIM中，制备1:40稀释度的EPS溶液。注意：A 该混合物形成白色乳状液。
   2. 用实验室擦拭纸擦去网篮底部多余的水分。将网篮浸入烧杯中的稀释EPS溶液中，并立即轻轻旋转，使胚胎分散到网篮底部的EPS溶液中。持续旋转30秒。注意：可通过调整EPS的稀释度和处理时间来控制胚胎通透性。建议根据所使用的果蝇品系，通过实验确定最佳的EPS稀释比例和处理时间。对于12期及更晚期的胚胎，将处理时间延长至60–90秒效果更佳。
   3. 取出篮子，用实验室擦拭纸吸去多余的EPS。在60 mm培养皿中用10 ml PBS进行六次连续洗涤。每次洗涤时，使用塑料移液器轻轻将PBS喷洒于胚胎上。随后进行染色和药物处理步骤。注意： EPS 可倒入水槽处理。

3. 通透化胚胎的染料与药物处理

1. 染料处理
   1. 在1.5 ml微量离心管中，向1 ml MBIM-T（终浓度为50 µM）加入5 µl 10 mM CY5羧酸染料*，涡旋混匀。注：*染料的选择取决于后续分析。CY5羧酸染料适用于后续需进行固定和免疫染色的分析；罗丹明B适用于活体胚胎的分析。罗丹明B发出红色荧光，其代谢产物发出绿色荧光¹，可能对后续的荧光应用造成一定干扰。可在染色液中加入药物或毒素，以在此阶段启动处理，或仅在此阶段进行脉冲式药物/毒素处理。处理和处置药物与毒素时，应严格遵循材料安全数据表（MSDS）及环境安全标准。
   2. 使用画笔将胚胎从网格篮转移至染料溶液中。盖紧管盖，反复倒置，确保胚胎在染料溶液中自由悬浮。将管子置于室温下振荡摇床中孵育15分钟。
   3. 从摇床上取下离心管，静置使胚胎沉降。用细口移液器吸除染料溶液，加入1 ml MBIM-T洗涤液进行清洗。轻轻颠倒离心管，充分重悬胚胎。待胚胎沉降后，再用MBIM-T重复清洗三次。最后一次清洗后彻底吸除所有MBIM-T，随后进入孵育步骤。
2. 胚胎发育培养
   1. 将胚胎转移至以下两个腔室之一：发育篮或载玻片腔室。注意：对于较长的发育阶段，优先使用发育篮；若需进行后续的固定和免疫染色步骤，则必须使用发育篮。载玻片腔室适用于高分辨率的延时成像，最适合短时间的发育观察。例如，早期胚胎事件）。可在培养基中加入不同浓度的药物或毒素，利用活体胚胎实时监测胚胎发育，或采用标准的固定和免疫染色方法在终点进行观察。
   2. 篮中发育
      1. 用70%乙醇喷洒发育篮进行清洗，再用去离子水彻底冲洗，并用实验室擦拭纸吸干。配制6 ml含有所需浓度药物或毒素的孵育培养基。将发育篮放入盛有培养基的60 mm培养皿中，注意避免网格底部滞留气泡。注：常用两种培养基：单独使用MBIM，或按50:50比例混合MBIM/M3，后者在较长时间的发育培养中效果更佳。
      2. 用画笔将透化的胚胎转移至篮子底部网格表面。用周围储液槽中的培养基轻轻冲洗胚胎。用画笔将胚胎分散，使其在网格上形成单层。注意： 进行显微成像，评估样品的通透性和活力特征（见步骤4）。
   3. 载玻片培养室中的发育
      1. 倒置载玻片腔室，并在开口边缘涂上少量真空脂。在开口内的DO膜表面加入150 µl含有所需浓度药物或毒素的培养基。 注：常用的培养基有两种：单独使用MBIM，或按1:1比例混合的MBIM/M3，后者在较长时间的发育培养中效果更佳。
      2. 用画笔将透化的胚胎转移至含有培养基的液滴中。分散胚胎，使其沉降在液滴内的膜上。
      3. 小心地将一个25 mm的圆形盖玻片覆盖在开口上，从而压平培养基。轻轻按压盖玻片边缘，使其与凡士林形成密封。注意： 进行显微成像以评估样品的通透性和活力特征（见步骤4）。

4. 透化活体胚胎的鉴定

1. 鉴定已透化的胚胎。使用配备数字相机的落射荧光显微镜观察胚胎。采用固定的显微镜和相机设置，在蓝光波长下获取多个视野的图像（用于确定卵黄自发荧光的分布轮廓）。
2. 根据相对荧光强度判断胚胎的透化程度。使用具有较大工作距离的体视显微镜，以便容纳篮状装置并允许对胚胎进行操作。显微镜应配备可编程的X-Y-Z载物台、落射荧光照明系统和数字相机。成像时需仔细记录每个胚胎图像的曝光参数和载物台位置，以便在后续时间点重新评估同一组胚胎（参见图3中的代表性结果）。注意： 染料摄取的模式会因所用染料种类、暴露时间长短以及胚胎发育阶段的不同而有所差异。单次处理的样本中出现广泛的染料摄取范围是典型现象，反映了透化程度的差异。
3. 鉴定可存活胚胎。在标记透化胚胎的位置后，将胚胎继续在室温或25 °C条件下培养。将篮状装置或载玻片培养室重新放回显微镜下，通过蓝光通道荧光观察，并对先前已识别的透化胚胎采集卵黄自发荧光图像。根据卵黄分布的正常进展来评估胚胎活力（参见Rand et al.¹ 及图3中的代表性结果）。注意： 也可利用明场显微镜观察胚胎的其他形态学特征来评估其活力。建议针对每种使用的染料和果蝇品系，通过实验经验确定与胚胎活力相容的透化程度。
4. 在透化且具活力的胚胎中评估药物或毒素的作用效应。
5. 经上述方案处理的胚胎，在药物或毒素暴露后可适用于多种常规分析。下文讨论部分将探讨若干类型的分析方法，包括对活体胚胎进行形态发生过程的直接观察，以及固定后的免疫荧光染色分析。这两种方法均可借助活体染料（例如，GFP）加以增强，以揭示基因表达模式、细胞谱系及细胞形态特征。

结果

图 1 展示了用于胚胎操作的装置，以帮助读者直观理解上述方案中所使用的“自制”操作工具。图 2 所示结果表明，在 18 °C 条件下培养胚胎对其在发育后期被 EPS 通透的能力具有显著影响。该条件应用于方案步骤 2.1 中。图 3 显示了 CY5 羧酸染料在揭示 EPS 处理胚胎中通常出现的不同通透性水平方面的有效性。图 3 还展示了染料在卵黄中分布的发育动态，揭示了用于评估胚胎活力的一个标准，如方案步骤 4.2 所述。图 4 的结果说明了 CY5 染料在毒素处理、甲醛固定和免疫染色后确定胚胎通透性的实用性。

讨论

上述方法概述了一种获取具有活力的Drosophila胚胎的手段，这些胚胎在广泛的发育阶段内均可接受小分子处理。该方法提出了一项新颖且简便的发现：在18 °C下对胚胎进行老化处理，可使晚期胚胎的通透性达到此前仅在早期胚胎中观察到的水平。此外，使用远红染料CY5羧酸作为通透性指示剂，在固定后的应用中已被证明有效，且不会干扰可用于揭示发育表型的传统红色和绿色荧光标记物。这些发现显著提升了EPS方法的有效性和实用性。

该方法适用于对活体和固定胚胎样本的分析。利用明场显微镜和载玻片腔室装置，在胚胎发育前半阶段可观察的典型特征包括形态发生运动，例如囊胚的细胞化、头褶形成、原肠带伸长及原肠带回缩¹。使用GFP或RFP报告基因可识别更特异的终点事件，e.g. 早期体节化模式以及发育后期神经结构的形成¹。GFP和RFP报告系统还可实现对活体透化胚胎中发育事件的观察，适用于载玻片腔室和发育篮两种样本制备方式。一种简单评估施加药物或化学物质整体毒性的方法是：通过蓝色荧光通道监测卵黄蛋白自发荧光的模式，以判断发育是否出现延迟或...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇饲养笼	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
椰油酰胺 DEA [Ninol 11-CM]	Stepan Chemical	需电话订购	http://www.stepan.com/
乙氧基化醇 [Bio-soft 1-7]	Stepan Chemical	需电话订购	http://www.stepan.com/
d-柠檬烯（超纯级）	Florida Chemical Co.	需电话订购	http://www.floridachemical.com/
次氯酸钠	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS 粉末	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
罗丹明 B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 羧酸	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Shields 和 Sang M3 培养基	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex 尼龙筛网	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
溶解氧（DO）膜	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm 圆形一号盖玻片	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
葡萄糖-琼脂培养板混合物	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
旋转混合仪	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/