开发干扰素-γ ELISpot检测法评估脐带血移植后水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫反应

摘要

新型功能性检测方法，如γ干扰素（IFN-γ）ELISpot，可在单细胞水平检测细胞因子的产生，同时对T细胞应答进行定量和定性表征，可用于评估针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞介导免疫应答。

摘要

水痘-带状疱疹病毒（Varicella zoster virus, VZV）是脐带血移植（umbilical cord blood transplantation, UCBT）后发病率和死亡率的重要原因。因此，通常对接受UCBT的儿科患者系统性地给予抗疱疹病毒预防治疗，以预防与VZV感染相关的并发症；但目前尚无基于充分证据的明确共识来定义其最佳预防持续时间。由于T细胞介导的免疫应答在控制VZV感染中起关键作用，评估UCBT后VZV特异性T细胞应答的重建情况，可能为是否需要继续维持或可以停止预防治疗提供依据。为此，开发了一种VZV特异性的γ干扰素（IFN-γ）酶联免疫斑点（enzyme-linked immunospot, ELISpot）检测方法，用于表征T淋巴细胞在受到VZV抗原刺激后产生IFN-γ的情况 体外 使用经辐照的减毒活水痘-带状疱疹病毒（VZV）疫苗进行刺激。该检测方法可快速、可重复且灵敏地测量VZV特异性细胞介导免疫，适用于临床环境中监测VZV特异性免疫的重建情况，以及评估对VZV抗原的免疫应答能力。  

引言

首次于1989年实施的脐带血移植（UCBT）正越来越多地用于治疗儿童多种肿瘤性和非肿瘤性血液疾病¹水痘-带状疱疹病毒（VZV）是一种具有细胞病变效应的人α疱疹病毒，可引起两种不同的疾病：原发感染后的水痘和再激活后的带状疱疹。原发感染后，VZV终生潜伏于宿主背根神经节的感觉神经中。脐带血移植（UCBT）后最严重的感染性并发症之一与VZV相关。^2-4在我们的临床中心，若未进行水痘-带状疱疹病毒（VZV）预防，在脐带血移植后3年内VZV疾病的累积发病率为46%²在这些患者中， 从头合成 水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染或再激活常伴随内脏播散，累及中枢神经系统、肺和肝脏^5-7因此，通常对接受非血缘脐带血移植（UBCT）的受者给予阿昔洛韦、伐昔洛韦或泛昔洛韦的预防性治疗。^8,9然而，这种治疗策略未考虑水痘-带状疱疹病毒（VZV）特异性T淋巴细胞的保护潜力，也未考虑VZV特异性T细胞应答重建的动力学过程。长期抗疱疹病毒预防用药的广泛使用可能带来的问题包括：a）患者过度治疗；b）抗病毒药物耐药性的产生^10,11；以及水痘-带状疱疹病毒特异性免疫重建受损^12,13因为检测到具有功能性的水痘-带状疱疹病毒特异性T淋巴细胞与长期抵御水痘-带状疱疹病毒感染以及更佳的临床转归相关^4,14,15监测移植后时期针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞介导免疫反应，可能有助于临床医生更合理地使用抗病毒治疗，从而区分出哪些患者可从VZV预防性治疗中获益，哪些患者的免疫系统已具备控制VZV复制的能力^4,13.

IFN-γ ELISpot 检测被广泛用于监测多种实验体系和临床条件下的细胞介导免疫反应。斑点的形成源于显色底物的裂解，从而在反应位点产生可见且稳定的沉淀物。每个独立的斑点因此代表一个分泌细胞因子的单个细胞的印记。IFN-γ ELISpot 不仅可测量单个细胞产生 IFN-γ 的能力， 离体 产生干扰素-γ以响应 体外 通过同源抗原刺激，还可估算特定细胞群体中应答细胞的频率^16,17除了具有高灵敏度外，IFN-γ ELISpot 检测操作简便，因此可在个性化临床方案中用于指导抗病毒治疗的启动或终止。下述步骤详细描述了一种ELISpot检测方法，专门用于检测和定量外周血单个核细胞在受到刺激后产生IFN-γ的情况。 体外 使用水痘-带状疱疹病毒（VZV）来源的抗原进行刺激。

方案

本研究方案已获得在加拿大魁北克省蒙特利尔市圣犹斯通大学医院中心（CHU Sainte-Justine）进行研究所属机构伦理审查委员会的批准。已向所有研究参与者及其父母或法定监护人获取知情同意。第1天和第2天进行的所有操作均须在无菌条件下执行（即 在层流罩下操作。处理人血时应严格遵守标准安全规程。

1. 包被平板

1. 向 96 孔 MultiScreen IP 白色 ELISpot 板的底部聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜中每孔加入 20 μl 的 35% 乙醇，作用 1 分钟，以进行膜的通透处理。膜应略微变为半透明。
2. 立即使用多通道移液器或类似装置，每孔加入 200 μl 的 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄，2 mM KH₂PO₄，pH 7.4)，洗涤 3 次。此步骤至关重要，因为残留的乙醇可能影响细胞活力及捕获抗体的结合。ELISpot 板较为脆弱，应小心操作：不建议使用自动洗板机。
3. 将纯化的鼠抗人 IFN-γ 捕获抗体用 1× PBS 稀释至终浓度为 10 μg/ml，每孔加入 10 μl 涂布于孔内。用普通塑料封口膜覆盖板子，并于 4 °C 下孵育过夜。

2. 封闭平板

1. 吸干孔内液体，轻拍使孔干燥，然后用 200 μl 的 1× PBS 洗涤 5 次。
2. 每孔加入 200 μl 完全 RPMI 1640 培养基，在 37 °C 下孵育 2 小时（封闭步骤）。
3. 用 200 μl 的 1× PBS 洗涤 5 次，并在细胞准备接种前始终保持孔内充满 1× PBS。

3. 细胞接种与刺激

1. 采用标准方法，通过Ficoll-Paque密度梯度离心法从人静脉血样本中分离外周血单个核细胞（PBMC）。或者，采用标准方法复苏液氮中冻存的PBMC分装样品。最后一次离心后，将细胞重悬于终浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/ml 的完全RPMI 1640培养基中，并在37 °C、5% CO₂条件下于水套式培养箱中孵育过夜。
2. 从培养箱中取出PBMC，将其重悬于5 ml完全RPMI 1640培养基中。
3. 在室温下，将PBMC与10 μl来自Serratia marcescens的基因工程内切酶共同孵育5分钟。
4. 取50 μl PBMC样品，与50 μl台盼蓝染料混合。使用血细胞计数板和显微镜检查（染料排斥法）进行细胞计数并估算细胞活力百分比。也可采用各种自动化方法进行细胞计数和细胞活力评估。PBMC的活力应>95%。若细胞活力低于95%，则弃用该样品。
5. 将PBMC在700 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用添加了2%（v/v）灭活人血清（HIS）的AIM-V培养基重悬细胞，终浓度为2 × 10⁶ 个细胞/ml。保持于37 °C，直至将刺激混合物加入孔板中。
6. 逐滴向各孔中加入100 μl相应的刺激混合物。应使用以下三种刺激混合物：
   1. 使用添加了2%（v/v）灭活人血清（IHS）的AIM-V培养基作为阴性对照。
   2. 将抗CD3单克隆抗体（克隆OKT3）用添加了2%（v/v）IHS的AIM-V培养基稀释至终浓度为0.5 μg/ml，作为阳性对照。
   3. 使用水痘-带状疱疹病毒（VZV）抗原，形式可为γ射线照射（10,000 Gy；照射时间30分钟）的减毒活VZV疫苗（1,350斑块形成单位[PFU]/ml），用添加了2%（v/v）IHS的AIM-V培养基稀释1:200；或使用基于VZV立即早期（IE63）磷酸化蛋白序列合成的67种肽段（每种含15个氨基酸残基）等摩尔混合物，终浓度为1 μg。通过在PBMC培养4天后观察是否出现细胞病变效应的可见迹象来验证照射的有效性。
   4. 所有孔均需设复孔。
7. 逐滴向各孔中加入100 μl步骤5.4中制备的细胞悬液至相应孔中。应设置两个不加细胞的孔作为阴性对照。在37 °C、5% CO₂条件下于水套式培养箱中孵育20小时。孵育期间不得振荡、移动或叠放培养板。

4. 斑点显色与检测

1. 弃去细胞，用含0.05% (v/v) Tween 20 的1×PBS（PBST）洗涤板孔10次。Tween 20有助于在过夜孵育后使黏附于PVDF膜上的细胞脱落。
2. 使用多通道移液器，每孔加入100 μl用含0.5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS稀释的0.5 mg/ml 生物素标记的抗IFN-γ单克隆抗体（4S.B3克隆）。室温孵育2小时。
3. 用PBST洗涤6次，每孔加入100 μl用含0.5% (w/v) BSA的1×PBS按1:1,000稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素。盖好板，室温孵育1小时。
4. 用PBST洗涤3次，再用1×PBS洗涤3次。每孔加入100 μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）/硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）底物溶液，室温孵育5分钟。
5. 用流动的蒸馏水冲洗板。取下ELISpot板的底部部分，用蒸馏水冲洗膜的两面。将板自然晾干。
6. 使用体视显微镜观察各孔并计数斑点，或使用自动斑点计数仪扫描板。若无法在当天检测，请将板避光保存。
   1. 取对应重复孔中斑点数的平均值，并从实验孔的斑点数中减去阴性对照孔（无细胞）的斑点数。
   2. 以每10⁶个外周血单个核细胞（PBMC）中斑点形成单位（SFU）的数量表示IFN-γ的产生水平。
   3. 若实验样本中SFU数量每10⁶ PBMC超过>50，且高于阴性对照（细胞+添加2% (v/v) IHS的AIM-V培养基）2个标准差（SD），则认为该样本为阳性。
   4. 当斑点过多无法计数时，按每孔400个SFU计算。
7. 使用Kolmogorov-Smirnov检验判断ELISpot数据是否呈正态分布。若数据呈正态分布，采用Student’s t 检验（两组）或ANOVA结合Bonferroni事后检验（多组比较）进行统计分析；若数据非正态分布，则采用Mann-Whitney U 检验（两组）或Kruskal-Wallis检验结合Dunn’s事后检验（多组比较）。

结果

上述IFN-γ ELISpot方案由本实验室开发并优化，用于测量针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞介导免疫应答的强度和质量⁴。在刺激步骤中可使用多种来源的VZV抗原，包括：a）商品化的、经去污剂灭活的VZV感染Vero细胞提取物¹⁸；b）来自特定VZV编码蛋白（包括IE63¹⁵和ORF4¹⁹）的重叠合成肽段混合物；c）减毒活水痘-带状疱疹疫苗²⁰；以及d）来自裂解的VZV感染MRC细胞上清液中经紫外线（UV）灭活的VZV抗原制剂¹⁴。在本研究中，我们优先选用减毒活VZV疫苗的不同稀释液，而非细胞培养来源的VZV，以确保抗原来源和制备的一致性，并在临床环境中限制对活体野生型VZV毒株的培养与操作，因为院内传播是一个严重关切的问题¹⁰。此外，相较于UV灭活，我们更倾向于采用γ射线辐照²¹，因为γ辐射剂量的施加更为精确，且与UV不同，γ射线能够有效穿透密封的含VZV小瓶。对病毒储备液进行辐照后，在所有测试的VZV抗原稀释度下，从健康供体获取的外周血单个核细胞（PBM...

讨论

改进与故障排除：IFN-γ ELISpot 检测已被用于研究针对多种微生物病原体的细胞介导免疫应答，包括人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）^24,25、丙型肝炎病毒（HCV）^26,27 和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）^28,29 等。本文描述了一种开发 IFN-γ ELISpot 检测方法以测定针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞免疫应答的过程，旨在明确儿科脐带血移植受者免疫重建过程中与 VZV 特异性免疫相关的指标。

该检测方法的关键特征有四点。第一，无需预先 体外 T细胞扩增耗时较长。其次，该方法可使用冻存的外周血单个核细胞（PBMC）样本进行，这有助于最大限度地减少不同检测批次间的变异性。此外，样本的冻存与平行处理特别适用于需要分批处理样本的纵向研究。第三，为防止PBMC在解冻过程中出现细胞聚团现象，可采用一种超纯的基因工程内切核酸酶处理 粘质沙雷氏菌 使用了该方...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leucocep 管	VWR	89048-936/89048-932	可根据血液体积选用 12 ml 或 50 ml 的管子。
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	避光保存。
Benzonase 核酸酶	Novagen	70746-3	置于 -20 °C 保存。
MultiScreenHTS-IP 滤膜板	Millipore	MSIPS4W10	无菌，孔径为 0.45 µm。
小鼠抗人 IFN-γ 捕获抗体	BD Biosciences	551221	NIB42 克隆。
Pepmix VZV IE63	JPT 肽技术公司	PM-VZV-IE63	将一瓶内容物溶于 40 μl DMSO 中。六个月内使用完毕。
生物素标记的抗 IFN-γ 单克隆抗体	BD Biosciences	554550	4SB3 克隆。
碱性磷酸酶标记的链霉亲和素	Bio-Rad 生命科学	170-3554	当天配制稀释液使用。
BCIP/NBT	Bio-Rad 生命科学	170-6432	避光保存。