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成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析

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DOI：

10.3791/51644

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2014年8月9日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

本文内容

摘要

成年斑马鱼的肾脏是进行肾脏再生和疾病研究的优良体系。此类研究的一个关键方面是评估肾单位的结构和功能。本方案描述了多种可用于评估肾小管组成及肾重吸收功能的方法。

摘要

斑马鱼模型已成为研究肾脏发育、再生及疾病的有力体系。斑马鱼胚胎期和成体肾脏均由称为肾单位的功能单位构成，这些肾单位在包括哺乳动物在内的其他脊椎动物中高度保守。近期斑马鱼研究显示，成体肾单位在受到损伤后会发生两种独特现象：首先，已有肾单位内部发生显著再生，以替换被破坏的肾小管上皮细胞；其次，通过一种称为新生肾单位形成（neonephrogenesis）的过程，由肾脏前体细胞生成全新的肾单位。相比之下，人类及其他哺乳动物似乎仅具备有限的肾单位上皮细胞再生能力。迄今为止，介导这些肾脏再生现象的机制仍不清楚。由于成体斑马鱼肾脏同时具备肾单位上皮再生和新生肾单位形成的能力，因此为研究这些事件提供了极佳的实验范式。此外，斑马鱼模型拥有丰富的遗传学与药理学工具，可用于解析调控肾脏再生的细胞与分子机制。此类研究的一个关键环节是对肾单位结构与功能的评估。本实验方案描述了一组可用于评估成体斑马鱼肾脏组成及肾单位功能的标记技术。因此，这些方法可广泛应用于未来成体斑马鱼肾脏损伤模型的表型特征分析，包括但不限于肾毒性物质暴露模型，或通过硝基还原酶介导的细胞消融技术等遗传手段实现靶向细胞死亡的模型。此外，这些方法还可用于研究成体肾脏发育过程中的遗传干扰，并可用于评估慢性疾病建模过程中的肾脏状态。

引言

肾脏是一个复杂的器官，在体内承担多种生理功能。肾脏最主要的功能是代谢废物的排泄，这一功能与体液稳态的维持密切相关。肾脏通过过滤血液并形成尿液来完成这些任务，同时调节血压、电解质水平以及酸碱平衡。一种高度特化的上皮性小管结构——肾单位（nephron），是肾脏的基本功能单位1,2。在成年脊椎动物中，肾单位通常以紧密盘绕的方式排列，围绕一个集中的排泄系统分布，从而使大量小管能够密集地容纳于相对较小的器官内。例如，每个人类肾脏可包含超过100万个肾单位3。其他哺乳动物如小鼠，每侧肾脏则约有8,000至10,000个肾单位4。由于肾单位总数及其在肾脏内的结构布局存在差异，这些哺乳动物与其他脊椎动物之间的肾脏复杂程度各不相同。脊椎动物在发育过程中会相继形成最多三种肾脏结构，每一种在肾单位的数量和排列方式上均表现出逐步增加的复杂性：前肾（pronephros）、中肾（mesonephros）和后肾（metanephros）。最终保留下来的肾脏结构即为成体的肾脏器官——通常是中肾或后肾2。然而，每种类型的肾脏均以肾单位为基础构成2。

肾单位是肾脏的功能核心，负责血液过滤以及代谢物的分泌和重吸收。肾单位是由上皮细胞构成的简单管状结构，具有节段性组织，其中不同区域为高度特化的上皮细胞域，各自执行特定功能。按照滤过液在肾单位中的流动顺序，每个肾单位通常由三个主要部分组成：（1）肾小体，（2）具有近端、中段和远端节段的肾小管，以及（3）集合管1。近端小管主要负责有机溶质的重吸收，尤其是葡萄糖和氨基酸1。中段小管（即亨利氏袢）是盐分和水分调节的主要部位1。最后，盐分及其他离子的精细调节发生在远端小管和集合管，该过程受到内分泌系统的高度调控1。随后，滤过液经输尿管进入膀胱，最终作为废物排出体外1。

肾功能的丧失可能由多种原因引起，这些原因会阻碍肾单位的正常活动。这些原因可能发生在肾脏发育过程中，例如 导致肾单位畸形的先天性缺陷5，或由不同类型的损伤（源于遗传和环境因素）引起。获得性损伤通常被 broadly 分为急性肾损伤（AKI）和慢性肾损伤（CKD）。AKI 涉及肾功能的突然丧失，通常由缺血或毒素暴露引起6,7。在哺乳动物中，此类损伤后肾单位上皮细胞具有一定的修复能力8，许多人在经历 AKI 后可完全恢复肾功能。然而，AKI 也与较高的发病率和死亡率相关，其发生率在 30–70% 的广泛范围内均有报道6,7。相比之下，CKD 与肾功能进行性丧失相关，通常由多年持续损伤引起，常伴有纤维化8,9。此外，AKI 与 CKD 之间存在相互作用，两者均可使个体更易发生另一种疾病10–12。例如，曾患 AKI 的个体更易发展为 CKD，甚至死亡13。无论在美国还是全球范围内，肾脏疾病的发病率已达到流行病水平，并且随着老龄人口的增加，预计将进一步上升——因此，迫切需要开发针对肾脏的再生医学干预手段14,15。

尽管已知急性肾损伤（AKI）患者可能恢复，长期以来人们一直认为肾脏是一种不具备内在再生能力的器官。近年来，这一传统观点发生了根本性改变16。针对小鼠和大鼠在AKI后肾损伤的研究表明，肾单位小管上皮细胞能够增殖并重建具有功能的肾单位17-20。虽然哺乳动物具备这种再生肾单位的适应性能力，但其再生能力存在明显局限性，且可能触发不良适应性反应，导致肾纤维化和慢性肾病（CKD）21。例如，最近一项研究表明，在小鼠肾单位中反复进行上皮细胞消融会导致再生能力下降并引发肾纤维化，提示肾单位的再生能力存在一定的阈值限制22。目前尚无证据表明成年哺乳动物的肾脏能够生成新的肾单位以替代丢失或受损的肾单位，因此肾单位的破坏将导致永久性的肾单位缺失8,9。有趣的是，某些脊椎动物在发生急性肾损伤后，不仅能够再生肾单位上皮，还能生成新的肾单位，这一过程被称为新肾单位生成（neonephrogenesis）或肾单位新生（nephron neogenesis）23。在鱼类中，新肾单位生成可在毒素暴露或部分切除后发生，历史上用于研究的动物模型包括金鱼24,25、罗非鱼26、鳐鱼27、青鳉28，以及近年来广泛使用的斑马鱼29,30。其中，斑马鱼为探索肾脏再生相关的细胞与分子通路提供了可行的遗传学研究模型。

在本视频文章中，我们演示了如何对成年斑马鱼的肾单位节段进行标记。了解肾单位的解剖结构、分子特征和功能特性，对于未来成功开展基于斑马鱼的肾脏研究至关重要。成年斑马鱼的肾脏为中肾结构，其肾单位数量和组织结构的复杂性天然低于成年哺乳动物、鸟类和爬行动物所具有的后肾结构31。然而，斑马鱼肾单位节段的组织方式与哺乳动物相似，这一相似性最初通过胚胎肾脏的基因表达研究得以证实31-35。斑马鱼胚胎的肾单位包含线性排列的肾小管节段，包括近曲小管（PCT）、近直小管（PST）、远端早期（DE）和远端晚期（DL）31-35 （图1）。成年斑马鱼的肾单位也具有类似的管状节段30,31,36,37 （图1）。PCT还可通过其功能表型加以识别：循环中存在的荧光标记葡聚糖化合物（分子量为10–70 kDa）可被PCT上皮细胞摄取，该特性已被用于胚胎和成年斑马鱼肾脏中评估 近端小管细胞的内吞摄取功能38-41 （图1）。斑马鱼与哺乳动物肾单位节段之间的一个差异在于，斑马鱼缺乏中间小管或亨利氏袢30-37；由于该节段在哺乳动物中主要发挥保水功能，而斑马鱼为淡水物种，无须浓缩尿液，因此其缺乏该结构并不令人意外32,33。因此，斑马鱼与哺乳动物肾脏的肾单位整体组成在很大程度上是保守的32,33。这些相似性使得斑马鱼成为研究肾组织表达基因在发育性肾单位形成过程中功能的有效研究工具32-35,42，并可用于模拟多种肾脏疾病43,44，从而进一步扩展了可利用斑马鱼进行研究的人类疾病谱系45,46。

目前，成年斑马鱼肾脏因其基因操作的便利性以及可用于研究该物种基因功能和信号通路的技术资源日益丰富，已成为开展肾脏再生比较研究的理想模型。已有多个研究利用斑马鱼中肾来探究急性肾损伤（AKI）后再生的机制29,30,37。为了持续推进基于成年斑马鱼肾脏的AKI研究，必须具备精确标记不同肾单位区域的方法，以及评估肾单位功能状态的技术。目前已有多种成年肾脏分析方法是从胚胎肾脏实验方案改进而来。在成年斑马鱼中通过腹腔注射荧光标记的葡聚糖，可经由内吞作用标记中肾肾单位的近端小管上皮细胞30，这与斑马鱼胚胎中的标记方式一致38-41   （图1）。该方法已被用于观察急性肾损伤后近端小管何时恢复其重吸收功能，从而实现对生理功能恢复情况的一种评估30 （图1）。肾单位近端小管的另一特征是该节段的上皮细胞具有刷状缘37，且表现出高水平的内源性碱性磷酸酶活性。因此，可通过一种称为ELF-97（酶标荧光法，Enzyme-Labeled Fluorescence-97）的荧光技术，在成年斑马鱼肾脏中直观地定位近端上皮细胞47。

此处，我们介绍如何进行荧光标记葡聚糖摄取实验30,48 在成年斑马鱼肾脏中，以获得对近端小管的功能评估，并绘制该小管节段的大小和轮廓。接下来，我们描述了使用荧光标记碱性磷酸酶对成年肾单位近端小管区域进行标记的技术。第三，我们首次证明了罗丹明标记的凝集素 Dolichos biflorus 凝集素（DBA），已被用作哺乳动物肾脏集合管的通用标记物49，标记成年斑马鱼肾脏的远端小管。由于DBA与碱性磷酸酶染色互不重叠，这些标记物可用于广泛区分成年斑马鱼肾单位中的全近端与全远端区域。在对整体标本及冷冻切片进行这些荧光染色的过程中，我们将这些标记与特异性表达于各肾单位节段的溶质转运蛋白基因的表达区域相对应。因此，本方案还包含针对成年组织整体标本的改良组织处理步骤指南 原位 基于胚胎WISH实验方案的杂交（WISH）分析50这些步骤可以以多种组合方式使用（图2) 以记录成年斑马鱼肾脏肾单位的形态学和功能特征。因此，这些方案可应用于再生研究、其他肾脏疾病模型的表型表征，甚至可用于成年肾脏形成的机制研究。

方案

本方案中涉及斑马鱼操作的程序已获得圣母大学机构动物护理与使用委员会的批准。注：提供了斑马鱼肾脏及肾单位解剖结构的示意图（图1）。本方案所描述方法的概览以流程图形式展示（图2） ，用以说明如何在同一肾脏样本上进行多种标记操作。在第7部分关于成年斑马鱼肾脏研究的WISH制备中，此处提供的步骤说明了如何对斑马鱼胚胎的处理流程进行修改（如近期发表文献50所述），从而为肾脏器官成功开展WISH分析提供技术指导。

1. 目标右旋糖酐腹腔注射成年斑马鱼

  1. 配制所需荧光标记葡聚糖储备液：将葡聚糖粉末溶于蒸馏水中，配制成50 mg/ml的溶液，分装至微量离心管中，于-20 ºC避光保存。注意：市面上可提供多种荧光标记的葡聚糖。根据实验需求选择合适的葡聚糖 根据所需的其他标记组合，确保所使用的显微镜配备相应的荧光滤光片。赖氨酸可固定葡聚糖在活体样本、安乐死后获取的未固定组织样本以及固定后的样本中均能显示荧光，无需额外的标记步骤。
  2. 解冻所需的葡聚糖储备液，在进行步骤1.3–1.5期间将其置于冰上并避光保存。操作时用铝箔包裹微量离心管，以避免光照。
  3. 将一条5至7个月大的成年斑马鱼放入含有0.02%三卡因或0.001% 2-苯氧乙醇的培养皿中，麻醉约1–2分钟。注意：建议使用此年龄段的成年斑马鱼，因为较年轻的鱼肾脏较小，难以解剖；而老年鱼的肾脏组织可能含有大量无法分析的瘢痕组织。当斑马鱼被充分麻醉后，将不再对触觉刺激产生反应，可通过使用勺子或钝头探针轻轻触碰鱼的尾鳍来检测其反应。
  4. 使用塑料勺将鱼从培养皿中取出，倒掉溶液，小心地将鱼腹面朝上放置于湿润的海绵模具上。
  5. 使用31 G 1.0 cc胰岛素注射器，将20 μl解冻后的葡聚糖储备液注入腹腔。针头应以较浅的角度插入腹部腹侧中线。为避免刺伤器官，先插入针头，然后略微上抬，以提起鱼体壁并形成可注射葡聚糖溶液的空间。48注意：或者，可对葡聚糖储备液进行稀释， 例如， 以1:2或2:1的比例（葡聚糖：蒸馏水）混合，以降低样品中的背景荧光。
  6. 轻轻地将鱼放回水箱，使其从麻醉状态中恢复。注意：近端小管段对葡聚糖的摄取发生在注射后8–12小时之内，且在注射后至少3天内仍可检测到信号。在注射后第3天（dpi）进行分析，可获得较强的肾小管信号，同时肾脏间质细胞群体的背景荧光较低。如果不需要额外标记，可直接进入第2部分，进行葡聚糖摄取的全封片观察。若需进行组合标记，则进入第3部分，准备用于葡聚糖摄取全封片观察的组织样本，随后进入第4部分，与碱性磷酸酶进行双重标记，或进入第5部分，进行DBA双重或三重标记。对于使用组织学切片的研究，请进入第6部分，获取制作精细切片的操作说明。 使用冷冻切片机对肾脏进行切片以及染色方法 使用各种标记物和/或一抗与二抗进行免疫组织化学染色。

2. 从未经固定的成年斑马鱼样本中解剖并制备肾脏平铺标本，以观察近端小管的荧光葡聚糖标记

  1. 将注射了葡聚糖的成年斑马鱼放入含有0.2% Tricaine（pH 7.0）的培养皿中4–5分钟，以实施安乐死。注意：在继续操作前，务必仔细观察确认鱼的鳃部运动已停止且心脏已停止跳动36。
  2. 使用塑料勺将鱼从Tricaine溶液中取出，倾去溶液，并将鱼体置于纸巾或滤纸上。
  3. 使用锋利的解剖剪在鳃盖后方剪开，移除头部。
  4. 立即用解剖剪从头部至尾鳍基部沿腹侧做一长切口，打开鱼体。
  5. 使用精细镊子去除鱼的内脏器官。
  6. 使用超细解剖针将体壁固定展开，以便观察附着于动物背部体壁的肾脏器官。
  7. 使用精细镊子将肾脏从背部体壁上分离下来。
  8. 将肾脏轻轻放入含有1X PBS的5 ml玻璃小瓶中，每次用3–5 ml新鲜1X PBS洗涤，共洗涤3次，每次5分钟 。注意：使用玻璃小瓶处理成年斑马鱼肾脏样本有助于组织的可视化，并允许使用较大体积（相对于组织质量）的洗涤液（约3–5 ml）。也可使用12孔细胞培养板。虽然可以使用塑料微量离心管，但标准尺寸的管子（1.5 ml）可能限制洗涤效果。
  9. 用移液器将肾脏取出，置于洁净的载玻片上，加入1–2滴1X PBS 。
  10. 使用精细镊子将肾脏在载玻片上压平，确保组织无卷曲或翻折。注意：也可使用钨丝工具在结缔组织上做微小切口，以帮助肾脏平整放置。
  11. 在18 × 18 mm玻璃盖玻片的每个角上放置少量油灰，然后缓慢将盖玻片盖在肾脏上。注意：放置盖玻片时应略微倾斜，以尽量减少溶液中气泡的滞留50。油灰凹陷的直径约为2 mm（图2A）。也可用真空脂代替油灰制作凹陷。如有需要，可额外添加一滴1X PBS ，以填充盖玻片与载玻片之间的空隙。
  12. 将载玻片置于体视显微镜或复合显微镜的视野中，使用适当的滤光片观察和/或成像肾脏。注意：参见图2A了解该玻片制备的宏观外观。

3. 成年斑马鱼肾脏的固定、解剖、通透及色素去除

  1. 配制新鲜的固定液，含4%多聚甲醛（PFA）/ 1X PBS / 0.1% DMSO，或解冻一份冻存的4% PFA/1X PBS 溶液并加入0.1% DMSO。注意：PFA具有毒性，配制和操作PFA溶液时应在通风橱中进行，并佩戴适当个人防护装备，包括手套和实验服。此外，配制母液时应小心操作PFA粉末。
  2. 在解剖托盘中加入足量固定液，以完全浸没整个动物样本。
  3. 安乐死后，将选定的斑马鱼置于固定液中固定（参见步骤2.2–2.6）。注：所选鱼类可以是未经处理的斑马鱼肾脏标本，或之前接受过腹腔注射葡聚糖的斑马鱼所分离的肾脏（第1部分）。
  4. 在4 oC条件下对样本进行过夜（12–16小时）固定。
  5. 次日，使用精细镊子小心地将肾脏从背部体壁上分离，并用移液器将其转移至玻璃小瓶中。注：也可使用12孔或24孔培养板。虽然可使用塑料微量离心管，但标准尺寸（1.5 ml）可能限制洗涤效果。
  6. 用3–5 ml 含0.05% Tween的1X PBS 对解剖出的肾脏进行3次洗涤，每次5分钟。
  7. 去除含0.05% Tween的1X PBS，加入3 ml 5%蔗糖溶液（溶于1X PBS）冲洗肾脏，持续30分钟。
  8. 更换为3 ml 30%蔗糖溶液（溶于1X PBS），在4 oC条件下过夜（12–16小时）保存。注：蔗糖溶液可使细胞膜通透化，从而使标记试剂能够穿透组织并实现特异性标记。
  9. 次日，去除30%蔗糖溶液，用5 ml 含0.05% Tween的1X PBS对肾脏进行两次洗涤，每次5分钟。
  10. 将含0.05% Tween的1X PBS替换为3–5 ml 漂白液，以去除肾脏器官上的黑色素细胞色素沉着。
  11. 将玻璃小瓶置于摇床上，密切观察色素消失情况。注：在蔗糖处理后进行漂白通常约需20分钟，但有时可能长达60分钟。若漂白液作用时间过长，可能导致器官解体；建议每10–15分钟检查一次样本，以评估组织完整性。
  12. 当肾脏色素完全去除后，用3–5 ml 含0.05% Tween的1X PBS洗涤两次。
  13. 将含0.05% Tween的1X PBS替换为3–5 ml 4% PFA溶液，在室温下固定1小时。
  14. 去除4% PFA溶液，用3–5 ml 含0.05% Tween的1X PBS对肾脏进行3次洗涤，每次5分钟。注：固定完成后，也可将肾脏直接封片于载玻片上，通过执行步骤2.8–2.12，在无黑色素干扰的情况下评估葡聚糖摄取情况。
  15. 去除含0.05% Tween的1X PBS ，替换为3–5 ml 封闭液，然后在室温下封闭孵育2小时。
  16. 封闭完成后，直接进入所选染色方案。注：此时肾脏可进一步进行一个或多个其他处理步骤，以使用不同试剂开展多重标记研究。若仅使用碱性磷酸酶对近端小管进行整体封片标记，请进入第4节；若仅对远端小管进行整体封片标记，请进入第5节。或者，可依次连续执行第4节和第5节，以实现整体封片中的双重检测。

4. 使用碱性磷酸酶检测标记成年肾脏近端小管节段

  1. 取出组织块，用 3 - 5 ml 含 0.05% Tween 的 1X PBS 洗涤肾脏 3 次，每次 5 分钟，然后将含 0.05% Tween 的 1X PBS 替换为 3 - 5 ml 不含 Tween 的 1X PBS，让肾脏浸泡至少 10 分钟。注意：在此期间，如果组织先前保存在玻璃小瓶中进行前续操作步骤，请将其转移至 12 孔或 24 孔培养板 中。
  2. 用足量的工作浓度碱性磷酸酶底物溶液（参见材料表中的检测试剂盒）覆盖样品，然后将样品置于旋转器上，在室温下孵育 30 分钟。 避光保存样品。
  3. 用碱性磷酸酶洗涤缓冲液洗涤肾脏以终止反应。 
  4. 用洗涤缓冲液更换 3 次，每次间隔 10 - 15 分钟。注意：完成此步骤后，若还需进行 DBA 标记，则直接进入第 5 部分第 5.1 步（即暂时跳过第 4.5–4.6 步）。可选步骤：如需对器官中的细胞核进行标记和可视化，可将肾脏浸泡于碘化丙啶溶液中。配制碘化丙啶储存液：将粉末溶于蒸馏水中，浓度为 1 mg/ml（1.5 mM）。将储存液用 2X SSC 稀释至 500 nM，并将肾脏在此溶液中孵育 30 分钟。用 1X PBS 洗涤后，进入第 4.5 步。
  5. 移除洗涤缓冲液，将肾脏置于干净的载玻片上，并使用标记试剂盒中提供的磷酸酶封片介质封片（参见第 2.9–2.12 步）。注意：封片介质已替代第 2.9 步中的 1X PBS。
  6. 使用配备 Hoechst/DAPI 滤光片组的体视显微镜或复合显微镜观察经碱性磷酸酶染色的肾脏。注意：可选步骤：使用四甲基罗丹明（TRITC）或德克萨斯红滤光片观察碘化丙啶荧光信号。

5. 使用罗丹明DBA界定成年肾脏远端小管节段

  1. 通过将DBA（2 mg/ml）以1:100的比例溶于1X PBS中，配制200 μl的工作浓度DBA溶液。
  2. 用200 μl DBA溶液替换1X PBS中的0.05% Tween溶液。
  3. 室温下置于旋转器上孵育1小时。
  4. 移除DBA溶液，并用3–5 ml 的1X PBS洗涤肾脏3次，每次5分钟。注意：可选步骤：若需与DBA染色同时标记和观察器官中的细胞核，可将肾脏浸泡在DAPI溶液中，使用Hoechst/DAPI滤光片进行检测（罗丹明DBA染色可用TRITC或Texas red滤光片检测）。配制DAPI储存液：将粉末溶解至浓度为5 mg/ml（14.3 mM）；将储存液稀释至300 nM的2X SSC溶液中，将肾脏在此溶液中孵育20分钟；用1X PBS冲洗 后，进入步骤5.5。如果已进行第4部分处理，请注意DAPI和碱性磷酸酶均使用Hoechst/DAPI滤光片检测。
  5. 移除1X PBS，将肾脏置于洁净的载玻片上（参见步骤2.9–2.12）。
  6. 使用荧光体视显微镜或复合显微镜上的标准TRITC或Texas red滤光片组观察经DBA染色的肾脏远端节段。注意：可选步骤：使用Hoechst/DAPI滤光片观察DAPI染色。

6. 成年斑马鱼肾脏组织的包埋、冷冻切片及染色（活体染料和免疫组织化学标记）

  1. 选择用于分析的鱼类，随后处死，并按照前述步骤进行固定和通透处理（步骤 3.2–3.8）。注意：成年鱼应使用 9:1 的乙醇：甲醛/0.1% DMSO 固定，替代 4% 多聚甲醛/1× PBS / 用于冷冻切片程序的0.1% DMSO，以制备用于葡聚糖、碱性磷酸酶和DBA显色的切片。但需注意，基于多聚甲醛的固定方法可能适用于某些免疫组织化学实验。此外，成年肾脏在进行冷冻切片分析时无需漂白，因为黑色素细胞位于表层，不会影响构成肾单位的肾细胞的显色观察 "内部" 肾脏器官的
  2. 次日，移除30%蔗糖溶液，替换为1:1组织冷冻介质：30%蔗糖，室温孵育4小时。
  3. 移除1:1溶液，将肾组织样本置于冷冻模具中的100%组织包埋剂中，并置于-80℃ o至少 1 小时保持在 C。
  4. 对整个成年肾脏进行横向连续切片，每片厚度约为12 μm。
  5. 将冷冻切片贴附于防脱载玻片上，室温下晾干1小时 oC.
  6. 将载玻片保存于 -80 oC，直至使用。
  7. 当冷冻切片准备就绪可进行标记时，从-80℃冰箱中取出载玻片 oC，并置于50℃载玻片加热台上 o45 分钟，4°C
  8. 使用液体阻隔笔在冷冻切片周围画圈，并在50 °C的切片加热板上干燥15分钟 oC.
  9. 从载玻片加热板上取下载玻片，室温下平放于湿盒中。
  10. 向载玻片上画圈区域加入含0.05% Tween的1×PBS，孵育20分钟以复水冷冻切片。注意：每张载玻片上每个画圈区域约需200–300 μl液体覆盖。
  11. 用新鲜的1×PBS替换0.05% Tween溶液，孵育10分钟。
  12. 吸除 1× PBS，将冷冻切片置于封闭液中孵育 2 小时。注意：配制 10 ml 封闭液，需混合 8 ml 含 0.05% Tween 的 1× PBS、2 ml 胎牛血清和 150 μl DMSO。封闭步骤完成后如需进行免疫组织化学染色，将切片与用新鲜封闭液稀释的一抗于 4 ℃孵育过夜。 oC，用含0.05% Tween的1×PBS洗涤一次，室温下用含0.05% Tween的1×PBS稀释的二抗溶液孵育2小时，再用含0.05% Tween的1×PBS洗涤一次，最后用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。所需抗体稀释比例可能有所不同，应通过预实验确定最佳稀释度。抗原修复可促进免疫标记，应在封闭前进行。载玻片在50℃解冻后立即进行后续处理 oC（步骤6.8）将冷冻切片在95之间孵育 oC-100 o在预热的10 mM柠檬酸钠缓冲液中，于C条件下孵育40分钟。室温冷却30分钟后，用含0.05% Tween的1×PBS洗涤两次，随后进行步骤6.11。
  13. 除去封闭液，用1×PBS缓冲液将冷冻切片洗涤3次，每次5分钟。
  14. 用DBA染色液替换1×PBS，孵育1小时。注意：取1 μl DBA加入99 μl 1×PBS中，配制成100 μl染色液。
  15. 除去DBA染色液，用1X PBS洗涤冷冻切片3次 每次5分钟。
  16. 将碱性磷酸酶标记物加入冰冻切片，孵育10分钟。
  17. 用洗涤缓冲液对冷冻切片进行三次洗涤，每次10分钟，以去除碱性磷酸酶。注意：配制100 ml洗涤缓冲液，需将5 ml 0.5 M EDTA和120 mg左旋咪唑加入95 ml 1×PBS中。为标记细胞核，将切片与之前步骤中所述稀释比例的碘化丙啶或DAPI（分别为步骤4.4和5.4）在室温下孵育30分钟。选择与所用其他荧光染料组合相容的核染料。
  18. 移除冷冻切片上的所有液体，在载玻片上滴加两滴封片介质。
  19. 将微盖玻片小心地放置在显微镜载玻片上。冷冻切片现已准备好，可使用适当的滤光片进行成像。

7. 成年斑马鱼肾脏样本的WISH处理

  1. 选择所需斑马鱼样本，实施安乐死，固定并解剖肾脏（步骤 3.1–3.5）。注意：必须使用含 0.1% DMSO 的 4% 多聚甲醛（PFA）/ 1X PBS 固定液以实现肾脏通透。将肾脏置于玻璃小瓶中，以便在后续处理步骤中便于观察。
  2. 去除固定液，用 5 ml 1X PBST 洗涤肾脏两次。
  3. 去除 1X PBS，用 100% 甲醇洗涤肾脏两次，然后在 -20 oC 下孵育至少 20 分钟以实现通透。注意：解剖后的肾脏可在 -20 oC 长期保存。
  4. 通过一系列洗涤步骤对肾脏进行再水化：分别用 3–5 ml 50% 甲醇/1X PBST、30% 甲醇/1X PBST 各洗涤 5 分钟，再用 1X PBST 洗涤两次，每次 5 分钟 。
  5. 对肾脏进行漂白以去除色素（步骤 3.10–3.14）。
  6. 用含 0.1% DMSO 的 10 µg/ml 蛋白酶 K/1X PBST 处理肾脏 20 分钟，然后用 1X PBST 洗涤两次，再在 4% PFA/1X PBST 中后固定 20 分钟至过夜。注意：蛋白酶 K 工作液必须在样品消化前立即配制，方法为将 50 µl 新近解冻的蛋白酶 K 储存液（10 mg/ml）、50 ml 1X PBST 和 50 µl DMSO 混合均匀。
  7. 按照近期文献所述的核糖探针合成、预杂交、杂交、抗地高辛/抗荧光素抗体孵育及检测步骤49，对肾脏进行单重或双重原位杂交染色（WISH）。注意：肾脏染色后的整体成像应在染色反应完成后数日内进行。肾单位染色信号衰退较快，尤其是红色底物标记。进行肾单位显微摄影时，应如上文步骤 2.10 至 2.12 所述将肾脏样本制作为平铺装片，并使用体视显微镜或复式显微镜成像。可采用微分干涉差（DIC）滤光片以更清晰地显示肾单位的细胞轮廓，便于样本分析。

结果

每项实验方案均在野生型斑马鱼中进行。所获得的数据示例记录了健康成年斑马鱼肾脏中肾单位的正常结构组成及其特性。成年斑马鱼具有中肾，即位于体壁背侧的第二套肾脏结构（图1A）。成年肾脏相对扁平，包含所谓的头区、躯干区和尾区，这些区域散布有表浅的黑色素细胞（图1A）。肾组织包含分支状排列的肾单位，这些肾单位连接并汇入中央集合管（图1A）。每个肾单位沿其长轴具有极性，一端为血液滤过结构（即肾小体），随后是一系列小管节段，最终终止于收集待排泄液体的导管（图1A）。每个成年肾单位小管包含近端和远端细胞节段，这些节段可通过特异性溶质转运蛋白的表达加以区分30,31,36,37，该节段模式与胚胎期肾单位所表现出的节段模式保守一致31-35 （图1B）。例如，cubilin 转录本标记近端小管39（PCT 和 PST），而 clcnk 转录本标记远端小管32（DE 和 DL）（图1B）。此外，PCT 节段以 slc20a1a 的表达为特征，PST 节段以 slc13a1 的表达为特征，DE 节段以 slc12a1 的表达为特征，DL 节段以 slc12a3 的表达为特征32 （图1B）。成年肾单位小管与胚胎期肾单位小管的区别在于，成年期的远端节段呈现弯曲结构（DE、DL），且 DL 节段在成年期广泛分支，这与胚胎期这些区域线性、无分支的解剖结构明显不同30,31,36,37（图1A）。在成年30和胚胎38-41 肾单位小管中，PCT 上皮因其内吞特性而可被识别，并可通过摄取荧光标记葡聚糖偶联物的能力来可视化并评估其重吸收功能（图1B）。此外，如后续图示所示，成年近端小管（PCT 和 PST，或泛近端区域）可被碱性磷酸酶标记，而远端小管（DE 和 DL，或泛远端区域）可被DBA标记（图1B）。本文所述用于标记成年斑马鱼肾单位节段的方法，包括葡聚糖摄取、碱性磷酸酶染色、DBA染色、免疫组织化学或WISH，可在整体标本或肾脏组织切片中以多种组合方式实施（图2）。这为评估肾单位组成提供了极大的灵活性和多样性（图2）。

成年肾脏可平铺固定在载玻片上进行分析，使用少量塑形粘土（或替代用真空油脂）形成凹陷，以支撑盖玻片悬于组织上方（图3A）。由于典型的肾脏长度约为5–7 mm，其尺寸适合在体视显微镜或复式显微镜下成像（图3A）。在明场照明下，可见与肾脏组织相关的表层黑色素细胞群体呈现黑色色素沉着，同时由于循环红细胞呈红色，可观察到主动脉等血管结构（图3B）。经腹腔注射dextran-FITC后，3天后仍可在荧光显微镜下使用FITC滤光片观察到中肾内广泛分布的近曲小管（PCT）区域被标记（图3C）。尽管黑色素细胞部分遮挡了单个肾小管的观察（图3C’），但并不影响肾单位数量的定量分析，也不妨碍对小管直径和长度的评估。经腹腔注射dextran fluoro-ruby后，对固定样品进行漂白处理可消除黑色素细胞的色素沉着，仅在明场照明下即可清晰观察到PCT节段（图3D）。在完整肾脏器官制备样本中，有时可见来自腹腔的脂滴（图3A）。单个PCT节段呈现弯曲、盘绕形态（图3D’），但也存在相对线性的延伸段（图3D”）。

不同的葡聚糖偶联物在近端小管标记中提供了不同程度的整体清晰度。特别是，葡聚糖-FITC 或葡聚糖 fluoro-ruby 能产生清晰的肾单位标记，且背景信号极低图3C-D）。右旋糖酐级联蓝和萤光素黄偶联物均显示出在成年肾脏近端小管中的摄取图4A，4B）。有趣的是，经葡聚糖级联蓝处理的肾脏显示出相对较特异的近曲小管荧光，伴有部分背景信号图4A，4A’)，而暴露于葡聚糖-荧光素黄的肾脏显示出标记的近曲小管节段，但存在明显的背景信号，在肾间质或肾单位之间的区域出现非特异性荧光染色图4B，4B’）。最后，使用葡聚糖-荧光红可实现优异的近端小管标记，在不同放大倍数下观察时，背景染色极低甚至没有背景。图4C，4C’）。在所有情况下，葡聚糖偶联物摄取特有的管状模式均与编码WISH表达的转录本表达相一致 slc20a1a，一种已确立的PCT特异性标志物30-32 (图 4D）。用染色的肾单位近端小管节段 slc20a1a 反义核糖探针显示出S形的近端小管螺旋结构，以及螺旋程度较轻的近端小管节段（图 4D’），在标记的葡聚糖偶联物实验中观察到图3D’，3D”).

其他肾脏样本制备，例如近端小管碱性磷酸酶活性的检测（图5A、5B、5C），均在去除黑色素细胞色素沉着后以类似方法进行。这使得近端小管肾单位的成像与分析不再受到任何遮挡。肾单位中内源性碱性磷酸酶反应性是近端小管的一个主要特征标志1,47。与基因cubilin的泛近端原位杂交（WISH）表达模式相比，碱性磷酸酶染色对近端肾单位区域具有高度特异性39（图5D、5D’）。碱性磷酸酶反应性在近端小管的起始段最为强烈，该区域对应于近曲小管（PCT）（图5B），这与cubilin的表达模式相似（图5D、5D’），后者在PCT中也表现出最高的相对转录水平。PCT可通过其略宽的管径、转录因子mafba的特异性表达（图5E、5E’）以及溶质转运蛋白基因slc20a1a的特异性表达（图4D、4D’）加以区分。碱性磷酸酶反应性还标记了一段管径较细的近端小管区域，该区域对应于近直小管（PST）（图5B），这一判断依据是与溶质转运蛋白基因slc13a1的节段特异性转录表达进行比对的结果（图5F、5F’）。PCT标志基因slc20a1a与PST标志基因slc13a1的WISH表达区域互不重叠（图5G），对单个肾单位的仔细观察显示，这两个区域彼此相邻，中间几乎没有间隙，且二者共同重现了cubilin的表达范围（图5G’、5G”、5G”’中的黑色箭头所示）。

为进一步确认碱性磷酸酶反应性与近端小管特征之间的关系，对在3天前接受过腹腔注射葡聚糖荧光红的小斑马鱼肾脏进行了整体共标记碱性磷酸酶染色图6A-C）。葡聚糖荧光红在近端小管区段中仅较粗直径部分与碱性磷酸酶显示重叠，该部分对应于近曲小管（示例见 图6D-I）。葡聚糖阳性区域在近端小管管径变细处突然终止， 即， PCT 和 PST 相交处（白色箭头所示） 图6）且在随后的PST节段中仅观察到碱性磷酸酶反应性（见示例 图6D-I）。碱性磷酸酶反应产生的背景荧光也微弱地勾勒出成年肾脏中一对平行的主要集合管走行轨迹29,30—导管，其特征是肾相关管道中直径最宽（图中星号所示） 图6A、6D、6E、6G、6H）。接着，通过冷冻切片分析观察了肾单位小管中碱性磷酸酶与葡聚糖摄取的共标记情况（图6J， 用白点标出小管周长）。在横切面上，碱性磷酸酶反应性出现在小管上皮顶端表面的一个较厚条带区域，与刷状缘的超微结构一致，而相应的小管细胞胞质区域则显示葡聚糖荧光红反应性（图 6J）。值得注意的是，染色的肾小管要么同时对碱性磷酸酶和葡聚糖呈阳性，从而被鉴定为近端曲状小管（PCT）节段，要么仅对碱性磷酸酶呈阳性图6J， 黄色圆点标出的小管周长) 确认为近端小管直部（PST）节段（注：其他存在的小管对两种染色均呈阴性，数据未显示）图6J）。此外，碱性磷酸酶染色（图 6K) 成功结合了核染料碘化丙啶（propidium iodide,图6L），便于细胞计数（叠加图示在 图6M).

利用罗丹明标记的DBA对成年斑马鱼肾单位的远端小管进行标记（图7）。对野生型斑马鱼肾脏进行DBA与碱性磷酸酶的全组织双重标记（图7A-C）。DBA与碱性磷酸酶在肾单位小管中的反应信号无重叠（图7D-H）。DBA染色的小管直径明显比碱性磷酸酶阳性小管更细，且DBA阳性小管常呈现分支状（白色箭头，图7G, 7H, 7J），而碱性磷酸酶染色的小管节段从未观察到分支现象。从携带enpep启动子驱动eGFP表达的转基因野生型斑马鱼（Tg:enpep:eGFP）中获取肾脏冷冻切片，因GFP可标记近端及远端肾小管51（图7I）。通过免疫组织化学检测GFP以标记所有肾小管（绿色，图7I），随后使用碱性磷酸酶和DBA进行荧光标记（分别为青绿色和红色，图7I）。对小管切片的分析显示，小管仅对碱性磷酸酶或DBA其中之一呈阳性，未见双标阳性（图7I）。极少数小管对碱性磷酸酶和DBA均无反应，可能与小管切片的角度有关（白色箭头，图7I）。此外，DBA染色可成功与细胞核染料DAPI在全组织肾脏染色中联合使用（图7J），再次突显了远端小管节段特有的分支结构特征（白色箭头，图7J）。

接下来，为了进一步比较葡聚糖-FITC摄取、碱性磷酸酶和DBA的标记模式，通过腹腔注射成年斑马鱼葡聚糖-FITC，3天后分离肾脏，进行冷冻切片，并对碱性磷酸酶和DBA进行染色，从而开展三重标记分析（示例见图8A-E）。肾小管显示出三种标记组合类型：同时表达碱性磷酸酶和葡聚糖的肾小管代表近曲小管（PCT）节段（白色虚线），仅表达碱性磷酸酶的肾小管代表近直小管（PST）节段（黄色虚线），而远端小管仅被DBA标记（红色虚线轮廓，图8A-E）。此外，仅DBA阳性的肾小管表现出分支结构（图8E）。通过WISH分析，这种远端DBA阳性小管特有的分支模式与特异性表达于远端小管节段的溶质转运体转录本的基因表达模式相一致（图8F-I）。编码clcnk的转录本标记整个远端小管（DE和DL），其管径较细，在肾脏中数量丰富，并含有分支点（黑色箭头，图8F, 8F’）。相比之下，表达slc12a1或slc12a3的肾小管节段（分别为DE和DL的标志物）在肾脏样本中的总体数量少于clcnk的表达（比较图8G与图8F、8H）。此外，表达slc12a1的肾小管节段极少甚至从不出现分支（图8G, 8G’），而表达slc12a3的肾小管区域则频繁呈现特征性的风车样分支结构（图8H, 8H’, 8H”, 8H”’，黑色箭头）。最后，对PCT标志物slc20a1a和远端标志物clcnk进行双荧光原位杂交（WISH）显示，这两种染色信号不重叠（图8I）。值得注意的是，表达slc20a1a的PCT节段并未直接连接至表达clcnk的小管，这符合预期，因为PST位于这两个区域之间（图8I）。综上所述，结合葡聚糖摄取、碱性磷酸酶反应性、DBA染色以及特定基因转录本的WISH等多种标记方法，能够有效区分肾小管的近端与远端节段。

Zebrafish kidney anatomy; nephron structure; gene expression chart; proximal, distal tubule comparison.
图1. 成年斑马鱼肾脏中的肾单位解剖结构。 示意图 （A） 成年斑马鱼肾脏和 (B) 成年与胚胎斑马鱼肾单位各节段分子特征的对比图表 （A） （左上）成体肾脏是位于体腔背壁的扁平器官。（右上）从腹侧观察，肾脏具有独特的弯曲形态，分为头、躯干和尾三个区域，其表面分布有相关的黑色素细胞。放大示意图（左下）展示成年斑马鱼肾脏中典型肾单位树的结构，每个肾单位一端具有一个血液滤过结构（肾小体），随后依次为近端小管、远端小管和导管。彩色示意图（右下）以线性图展示一个成体肾单位树，以便将各节段特征与胚胎期肾单位进行比较 （B）斑马鱼胚胎的肾单位包含多个肾小管节段，包括近曲小管（PCT）、近直小管（PST）、远端早期（DE）和远端晚期（DL），其相应的基因表达区域如下所述。成年斑马鱼的肾单位具有相似的节段组成，并基于编码溶质转运蛋白的基因表达区域表现出类似的分子特征；与胚胎相比，一个显著区别在于多个肾单位可通过分支状的DL节段连接在一起。 请点击此处以查看此图的放大版本。

肾单位标记流程图、斑马鱼肾脏制备、免疫组织化学、DBA、WISH 流程。
图 2. 流程图展示了本方案中各方法之间的关系，说明这些方法可单独使用或以不同组合方式联合使用。在向成年斑马鱼腹腔注射标记的赖氨酸可固定葡聚糖后，可通过整体装片的方式观察肾脏，可单独使用，也可与碱性磷酸酶染色和/或DBA染色联合使用。或者，可对选定的斑马鱼肾脏进行冷冻切片组织学分析。切片可用多种组合方式对不同特征进行染色标记，包括免疫组织化学、核染色、DBA染色和/或碱性磷酸酶反应。此外，还可直接观察肾组织切片中近端曲小管（PCT）节段对赖氨酸可固定葡聚糖的摄取情况。最后，可对选定的肾脏采用WISH方法检测基因表达的时空分布。括号中的数字对应相应实验步骤部分。请点击此处查看该图的放大版本。

载玻片上的平铺肾脏；显微图像显示明场、葡聚糖-FITC、葡聚糖-荧光红。
图3. 成年斑马鱼肾脏平铺制备及其在可视化肾单位近端小管段摄取偶联葡聚糖中的应用。（A） 肾脏标本平铺制备的明场图像，其中器官被平整地放置在载玻片上，组织上方覆盖盖玻片，并由四小块雕塑粘土（亮粉色）支撑。此处肾脏制备样本与刻度尺一同成像，以提供比例参照。典型的成年斑马鱼肾脏从头到尾长约5–7毫米（mm）。（B） 未经漂白的肾脏明场图像。黑色色素沉着对应于与肾脏相关分布的黑色素细胞群，主动脉沿肾脏中线走行。（C） 成年斑马鱼腹腔注射40 kDa 葡聚糖-荧光素（FITC）后第3天，未经漂白处理的肾脏中肾单位近端小管（PCT）段的可视化结果。PCT段在整个肾脏中可见，但由于黑色素细胞的存在而部分被遮蔽。（C’） 单个肾单位的数字放大图像，显示黑色素细胞（白色箭头）。（D） 成年斑马鱼腹腔注射10 kDa 葡聚糖-荧光红后第3天，经肾脏固定和漂白处理后的图像。黑色素细胞的色素已被去除，在明场照明下可根据其对葡聚糖的内吞摄取清晰观察PCT区域。有时可在肾脏组织样本中观察到来源于腹部的脂滴（箭头）。（D’、D”） 代表性图像显示不同PCT段之间存在轻微的形态学差异。虽然许多肾单位的PCT段呈紧密盘绕状（D’），但其他肾单位的PCT段则盘绕较少（D”）。请点击此处查看该图的高清版本。

葡聚糖摄取实验；近端肾小管荧光显微镜观察；染料：级联蓝、荧光黄、荧光红。
图4. 成年斑马鱼肾脏肾单位近端曲小管（PCT）节段标记。 对野生型斑马鱼通过腹腔注射单次荧光标记的葡聚糖偶联物，注射后第3天观察其肾脏以实现PCT的可视化。（A, A’） 级联蓝标记的葡聚糖（10 kDa）、（B, B’） 荧光黄标记的葡聚糖（10 kDa）以及 （C, C’） 荧光红标记的葡聚糖（10 kDa）均优先标记肾单位中的PCT节段。级联蓝和荧光黄标记的葡聚糖在肾单位之间的间质细胞群中均显示出一定程度的非特异性标记，其中荧光黄处理的肾脏背景信号更高。相比之下，荧光红标记的葡聚糖背景信号显著降低，且对PCT的标记强度高。（D, D’） 通过WISH染色标记成年肾脏组织，检测编码slc20a1a的转录本位置，该基因是PCT转运细胞类型的特异性标志物。slc20a1a的表达区域与肾脏中观察到的葡聚糖摄取特征模式一致，表现为多个紧密盘绕/环状的PCT结构域，以及一些直径较宽且延伸较长的PCT区段。请点击此处查看本图的放大版本。

碱性磷酸酶在肾近曲小管中的表达；显微镜图像；PCT、PST分析。
图5. 成年斑马鱼肾脏中碱性磷酸酶（一种泛近端小管标志物）染色的代表性结果，与其他通过WISH检测的近端小管标志物比较。(A-C) 碱性磷酸酶染色（ turquoise 色）显示肾单位近端小管结构，清晰标记出PCT和PST两个区段。(D-F’) 各基因的单重WISH染色（每种均为紫色染色）。(D, D’) cubilin 的表达模式（一种泛近端小管标志物，涵盖PCT-PST）与碱性磷酸酶的染色分布一致 (D, D’)。相比之下，mafba 的WISH信号特异性地标记PCT (E, E’)，而 slc13a1 则标记PST (F, F’)。(G-G”’) 对PCT标志物 slc20a1a（红色）与PST标志物 slc13a1（紫色）进行双重WISH染色，结果显示这两个标志物所标记的小管区段无重叠；在对单个肾单位进行细致观察时，可见其表达区域呈相邻排列 (G’-G”’)。黑色箭头指示PCT与PST区段之间的连接处，该位置通常伴随小管直径由大变小的形态转变。请点击此处查看此图的高清版本。

整体碱性磷酸酶与葡聚糖染色示意图；显微镜图像，冷冻切片可视化数据。
图6. 碱性磷酸酶染色与葡聚糖摄取在成年斑马鱼肾单位近端小管曲部（PCT）中显示共定位，且碱性磷酸酶染色可与碘化丙啶的细胞核共标记兼容。（A-I） 对成年斑马鱼肾脏进行整体碱性磷酸酶染色，这些斑马鱼此前曾接受荧光红葡聚糖的腹腔注射。碱性磷酸酶（青绿色）与荧光红葡聚糖（红色）在PCT中存在共定位，但在近端小管直部（PST）中不共定位，后者仅显示碱性磷酸酶阳性。背景水平的碱性磷酸酶信号可标记每侧肾脏中的一对主要集合管（星号，*），其因管腔较宽而易于识别。（A-C） 单个肾脏鞍区的合并图像及各通道单独图像。（D-F） 与 （G-I） 两组典型肾单位的合并图像及各通道单独图像。（I） 冷冻切片分析证实，碱性磷酸酶与荧光红葡聚糖在PCT节段中共标记（白色虚线圈出），而PST节段仅由碱性磷酸酶单独标记（黄色虚线圈出）。（K-M） 一例肾脏分别用 （K） 碱性磷酸酶（青绿色）与 （L） 碘化丙啶（紫色）标记，从而实现 （M） 近端小管细胞及其细胞核的合并可视化。 请点击此处查看该图的高清版本。

碱性磷酸酶与DBA染色的荧光显微镜示意图；整体装片，冰冻切片
图 7. 碱性磷酸酶与DBA为互不重叠的节段标记物，分别标记成年斑马鱼肾单位中的全近端区与全远端区。（A-H） 对斑马鱼肾脏整体装片进行碱性磷酸酶与罗丹明-DBA染色。在肾脏中，碱性磷酸酶（青绿色）与DBA（红色）无重叠表达。背景水平的碱性磷酸酶信号可标记每侧肾脏中的一对主要集合管（星号，*），因其管径较宽而易于识别。DBA阳性小管管径较细，常可见分支点（白色箭头）。（A-C） 单个肾脏鞍区的融合图像及分通道图像。（D-F） 一组代表性肾单位的融合图像及分通道图像。（G, H） 其他示例，显示DBA阳性分支小管与碱性磷酸酶阳性小管并列分布的融合图像。（I） 冰冻切片分析证实，碱性磷酸酶与DBA分别标记不同的小管节段，仅有极少数小管未显示任一标记（白色箭头），可能由于该小管的切面角度所致。本分析使用野生型转基因鱼 Tg:enpep:eGFP，并对该肾脏中所有肾小管使用抗GFP一抗进行免疫标记。（J） 肾脏整体装片染色显示DBA（红色）与DAPI（蓝色）的融合图像，再次展示成年肾单位中具有分支结构的远端小管节段（白色箭头）。请点击此处查看该图的高清版本。

肾小管中FITC葡聚糖摄取、碱性磷酸酶和DBA的冰冻切片示意图。
图8. 成年肾脏冰冻切片中葡聚糖摄取、碱性磷酸酶和DBA的三重标记与远端小管WISH分析的比较。（A-E） 成年小鼠经腹腔注射葡聚糖-FITC（绿色），3天后取肾脏进行包埋和冰冻切片。通过碱性磷酸酶（青绿色）和DBA（红色）染色可识别出三种小管群体：近端曲小管（PCT）节段对碱性磷酸酶活性和葡聚糖均呈阳性（以白色虚线圈出）；前节段（PST）仅对碱性磷酸酶活性呈阳性（以黄色虚线圈出）；远端小管节段仅对DBA呈阳性（以红色虚线圈出），并表现出特征性的远端分支点。（A-D） 一个代表性切片的合并图像及其各单独通道图像。（E） 另一个代表性切片的合并图像。（F-I） 通过单重（F-H’”）和双重（I）原位杂交（WISH）比较远端小管基因表达模式。（F-H’） 所列基因的单重WISH（每种均为紫色染色）。（F, F’） clcnk（一种泛远端小管（DE-DL）标记基因）的表达模式出现在具有分支点的细小管中（黑色箭头）。（G, G’） 相比之下，slc12a1的WISH信号定位于DE节段，未检测到分支点；而（H-H’”）slc12a3标记DL节段，该节段在整个肾脏器官中具有大量分支点（黑色箭头）。（I） 对PCT标记基因slc20a1a（红色）和泛远端标记基因clcnk（紫色）进行双重WISH。这两种标记所标记的节段无重叠，其表达区域呈非相邻分布，即单个PCT盘绕结构（右下角）不与远端小管直接相邻，而后者位于独立位置并具有典型的分支点（黑色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文描述了可在成年斑马鱼中实现肾单位节段组分可视化的多种方法。由于近端小管细胞具有内吞特性，注射荧光标记的葡聚糖偶联物可优先标记近曲小管（PCT）30,38。由于存在多种不同荧光标记的葡聚糖试剂，该方法具有很高的灵活性。此外，使用可与赖氨酸交联固定的葡聚糖是标记PCT节段的一种特别便捷的方法，因为无需进行二次标记步骤。这种方法可实现相对简便的信号检测，并可与多种其他荧光标记、免疫标记以及转基因报告基因品系联合使用。碱性磷酸酶标记也可显示近端小管，其中近曲小管（PCT）反应强烈，而近直小管（PST）反应稍弱。最后，DBA染色可用于标记远端小管节段，其呈现特征性的分支形态。多种外源凝集素分子（即非免疫来源的糖结合蛋白）已被广泛用于区分哺乳动物的肾单位节段47。值得注意的是，在斑马鱼中DBA标记对应于远端小管节段，而在哺乳动物肾脏中DBA则用于标记集合管47。

综上所述，这些方法可组合应用于肾脏组成与功能的记录。由于所有这些方法均可用于完整肾脏标本，因此能够提供评估整个器官肾单位结构与功能的工具，而无需完全依赖更为耗时且繁琐的技术。 例如， 冷冻切片与免疫标记。然而，本文所述的染色方法在冷冻切片中同样适用。与整体染色相比，冷冻切片分析所获得的样本更适用于免疫组织化学检测特定肽段，但此类分析显然需要有合适的一抗可供使用。遗憾的是，斑马鱼动物模型研究中的一个主要局限性仍是可用抗体的匮乏。因此，WISH 仍是目前最广泛使用的方法， 即， “常用”的基因表达分析方法。使用BCIP、NBT和/或INT底物反应产生紫色或红色沉淀的WISH技术，无法与冷冻切片上的荧光染色兼容。一种替代方案是采用荧光WISH检测法，该方法已针对斑马鱼胚胎样本优化，亦可调整用于成年斑马鱼肾脏。本视频文章所述方法可为进一步实验提供基础，例如将荧光WISH与转基因斑马鱼品系结合使用，其中特定肾小管节段由eGFP或mCherry等报告基因标记。此外，本文所述方法也可尝试与其他活体染料联合使用， 例如， 其他凝集素。因此，可根据研究者对完整肾脏标本制备与分析的需求，进一步调整和扩展本文所述方法。

因此，这些方法在斑马鱼模型中具有广泛的应用潜力，可用于持续进行的再生研究以及遗传性疾病建模。目前迫切需要针对肾脏疾病的创新性研究和治疗方法。每年有数百万人因先天性、急性或慢性病因而罹患某种形式的肾病。此外，全球范围内肾病的发病率持续上升，使其成为一项全球性的公共卫生问题14,15。已有诸如血液透析等治疗方法，通过外部透析机清除患者血液中的代谢废物，以替代肾脏无法完成的功能。然而，这种干预措施存在局限性，患者必须持续接受治疗才能维持生命。此外，患者最终仍需进行肾移植，而一旦进入等待名单，可能需要数年时间才能获得供体肾脏。即使成功接受肾移植，许多患者仍会因手术而出现不良反应，并需终身应对这些并发症。这些困难凸显了开发新型治疗方法的迫切需求，以预防肾病的发生或促进组织再生8,16,52,53。鉴于在生物医学实验室中使用人类受试者存在明显的伦理限制，动物模型对于研究人类疾病发病机制及测试新疗法至关重要。由于小鼠在解剖结构上与人类相似且进化关系较近，已成为研究人类疾病最广泛使用的模型45。然而，该动物模型也存在某些局限性，例如无法在活体（in vivo）条件下观察器官发育过程，以及难以大规模开展遗传筛选。斑马鱼是研究器官发育和人类疾病建模相关且有效的模式生物45,46。就人类疾病而言，几乎所有70%的人类基因在斑马鱼中均存在功能同源基因54,55。

近期研究凸显了斑马鱼在肾脏研究多个领域中的应用价值31,37,56。在急性肾损伤（AKI）后对斑马鱼进行的再生与修复研究表明，肾小管上皮细胞的再生与新生肾单位形成是两个在再生过程中相继发生并相互重叠的过程30,37。研究人员已采用一种名为庆大霉素的氨基糖苷类抗生素作为损伤模型，用于研究成年斑马鱼在急性肾损伤后的病理结果29,30,37。在庆大霉素造成损伤后的约两周时间内，近端小管得以再生，同时在整个肾脏器官中不断形成新的肾单位29,30,37。总体而言，调控上皮细胞再生的机制仍存在极大争议。在一种被提出的修复机制中，首先发生急性损伤事件，随后死亡细胞脱落进入管腔；接着发生一系列去分化、增殖和迁移过程，最终新生细胞重新分化，重建受损的基底膜并恢复损伤部位的功能。另一种观点则认为，替代细胞来源于存在于肾单位小管内的干细胞/祖细胞。关于斑马鱼中新肾单位形成的过程，已有研究在庆大霉素注射诱导的急性肾损伤后观察到细胞聚集体的出现29,30。这些聚集体随后逐渐成熟为新的肾单位，并与已存在的小管相连29,30。肾单位上皮再生与新肾单位形成之间的共同点在于其高度的未知性：目前关于这些再生现象如何发生的科学问题，远远多于已有的明确解释。

然而迄今为止，已有若干令人振奋的研究证据支持这一观点：利用斑马鱼开展的肾脏再生研究确实能够为人类急性肾损伤（AKI）提供有价值的比较性见解，并可能具备直接的转化潜力56-58。通过化学筛选鉴定出可促进斑马鱼胚胎中肾祖细胞增殖的小分子，近期发现了组蛋白去乙酰化酶抑制剂甲基-4-(苯硫基)丁酸酯（m4PTB）56,57。将该化合物施用于庆大霉素诱导急性肾损伤的斑马鱼幼鱼后发现，幼鱼存活率提高，且肾小管细胞增殖增强56,58。当对中度缺血诱导急性肾损伤的小鼠给予m4PTB治疗时，其恢复速度加快，同时伴随肾小管萎缩减轻以及增殖性肾小管细胞的细胞周期阻滞减少58。这些发现提示，调控斑马鱼正常肾脏发育和/或对急性肾损伤再生反应的分子通路在哺乳动物中是保守的56。

因此，尽管仍需进一步研究来解析再生的机制——特别是识别所涉及的信号通路并理解它们之间的相互作用——斑马鱼为实现肾脏病学领域这一重要目标提供了一条有前景的研究途径。本实验方案中描述的肾单位细胞标记工具即为一类可用于评估急性肾损伤（AKI）模型中肾脏组成与功能的检测方法。此外，这些工具还可用于表征肾脏疾病的转基因模型，并可能为发现能够促进肾损伤后肾单位结构修复的化学治疗药物提供途径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究获得了以下资助：美国国立卫生研究院基金项目 K01 DK083512、DP2 OD008470 和 R01 DK100237；美国出生缺陷基金会 Basil O’Connor 启动学者奖 #5-FY12-75；圣母大学理学院和生物科学系提供的启动资金；以及 Elizabeth 和 Michael Gallagher 代表 Gallagher 家族向圣母大学提供的慷慨捐赠，以促进干细胞 研究。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们感谢生物科学系工作人员给予的支持，以及圣母大学斑马鱼研究中心在斑马鱼种群护理与福利方面所展现出的卓越奉献。最后，我们感谢本研究实验室成员对本工作的评论、讨论和深刻见解。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1X PBS用蒸馏水稀释10 X PBS制备。
1X PBST含0.1% Tween-20去污剂的1 X PBS溶液。
含0.05% Tween的1X PBS含0.05% Tween-20去污剂的1 X PBS溶液。
Tween 20American BioanalyticalAB02038
4% PFA/1X PBS将4% PFA（w/v）（Electron Microscopy Sciences，货号#19210）溶解于1 X PBS中，在通风橱内的加热板上煮沸。冷却后分装并冻存于-20°C冰箱中。使用前解冻，切勿重复冻融。 
精细镊子RobozRS-1050Dumont镊子，型号#55 
载玻片Thermo-Fisher4445White Frost 
盖玻片Thermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
模型黏土HasbroPlaydoh可使用其他型号的模型黏土替代，效果相似
玻片架Thermo-Fisher12-587可选：用于平放储存玻片的纸板托盘
漂白液漂白液配方（配制20 ml溶液）：
1.6 ml 10%氢氧化钾溶液
0.6 ml 30%过氧化氢溶液
100 μl 20% Tween
用蒸馏水定容至20 ml
氢氧化钾Sigma221473
过氧化氢SigmaH1009
封闭液封闭液配方（配制10 ml溶液）：
8 ml 含0.05% Tween的1X PBS
2 ml 胎牛血清
150 μl DMSO
碱性磷酸酶活性检测InvitrogenE6601我们使用ELF 97内源性磷酸酶检测试剂盒。  按照生产商说明书，将底物在检测缓冲液中稀释20倍，以制备工作用底物溶液。 
碱性磷酸酶洗涤液洗涤缓冲液配方（配制100 ml溶液）：
5 ml 0.5 M EDTA
120 mg 左旋咪唑
95 ml 1X PBS
荧光素葡聚糖，40,000 MWInvitrogenD1844用蒸馏水稀释配制成50 mg/ml的储存液，分装后于-20°C冰箱中冻存。
级联蓝葡聚糖，10,000 MWInvitrogenD1976用蒸馏水稀释配制成50 mg/ml的储存液，分装后于-20°C冰箱中冻存。
荧光黄葡聚糖，10,000 MWInvitrogenD1825用蒸馏水稀释配制成50 mg/ml的储存液，分装后于-20°C冰箱中冻存。
四甲基罗丹明葡聚糖（fluoro-ruby），10,000 MWInvitrogenD1817用蒸馏水稀释配制成50 mg/ml的储存液，分装后于-20°C冰箱中冻存。
双花扁豆凝集素（DBA）-罗丹明Vector laboratoriesRL-10-32DBA染色液配方（配制100 μl溶液）：
1 μl DBA
99 μl 1X PBS
碘化丙啶InvitrogenE6601
DAPIInvitrogenP1304MP
Vectashield硬封片剂Vector laboratoriesH-1400
微型盖玻片VWR48393081
二甲基亚砜，DMSOAmerican Bioanalytical67-68-5
蔗糖SigmaS0289
EDTA，0.5 M溶液，pH 8.0American BioanalyticalAB00502
左旋咪唑SigmaL-9756
组织冷冻介质Triangle Biomedical Sciences, Inc.TFM-C
Tissue-Tek Cryomold活检模具，10 x 10 x 5 mmSakura Finetek4565
TruBond 380黏附载玻片Tru Scientific0380W
液体阻断剂 – Super PAP笔Electron Microscopy Sciences71312
免疫染色湿盒Evergreen Scientific240-9020-Z10
冷冻切片机ThermMicrom™ HM 525 Cryostat
体视显微镜NikonSMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC所用滤光片组合如下：Hoechst/DAPI滤光片用于DAPI、碘化丙啶、葡聚糖-级联蓝及碱性磷酸酶检测；GFP/FITC滤光片用于葡聚糖-FITC、葡聚糖-荧光黄及抗GFP检测；TRITC滤光片用于葡聚糖-fluoro-ruby、PI及DBA检测。 
复合显微镜Nikon96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red所用滤光片组合如下：Hoechst/DAPI滤光片用于DAPI、碘化丙啶、葡聚糖-级联蓝及碱性磷酸酶检测；GFP/FITC滤光片用于葡聚糖-FITC、葡聚糖-荧光黄及抗GFP检测；Texas Red滤光片用于葡聚糖-fluoro-ruby、PI及DBA检测。  

参考文献

  1. Reilly, R. F., Bulger, R. E., Kriz, W. Structural-functional relationships in the kidney. Diseases of the Kidney and Urinary Tract. RW, S. chrier , Lippincott Williams Wilkins. Philadelphia, PA. 2-53 (2007).
  2. Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 509-529 (2006).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232, 194-201 (1992).
  4. Cebrian, C., Borodo, K., Charles, N., Herzlinger, D. A. Morphometric index of the developing murine kidney. Dev Dyn. 231, 601-608 (2004).
  5. Schedl, A. Renal abnormalities and their developmental origin. Nat Rev Genet. 8, 791-802 (2007).
  6. Ricci, Z., Cruz, D. N., Ronco, C. Classification and staging of acute kidney injury: beyond the RIFLE and AKIN criteria. Nat Rev Nephrol. 7, 201-208 (2011).
  7. Faubel, S., et al. Ongoing clinical trials in AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 7, 861-873 (2012).
  8. Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin Transl Med. 2, 11(2013).
  9. Liu, Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 7, 684-696 (2011).
  10. Murugan, R., Kellum, J. A. Acute kidney injury: what’s the prognosis. Nat Rev Nephrol. 7, 209-217 (2011).
  11. Palevsky, P. M. Chronic-on-acute kidney injury. Kidney Int. 81, 430-431 (2012).
  12. Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
  13. Bucaloiu, I. D., Kirchner, H. L., Norfolk, E. R., Hartle, J. E., Perkins, R. M. Increased risk of death and de novo chronic kidney disease following reversible acute kidney injury. Kidney Int. 81, 477-485 (2012).
  14. Collins, A. J., et al. USRDS 2012 Annual Data Report: Atlas of Chronic Kidney Disease and End-Stage Renal Disease in the United States (2012). Lancet. 365, 331-340 (2012).
  15. El Nahas, M. eguid, Bello, A., K, A. Chronic kidney disease: the global challenge. Lancet. 365, 331-340 (2005).
  16. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction. Biochem J. 444, 153-168 (2012).
  17. Toback, F. G. Regeneration after acute tubular necrosis. Kidney Int. 41, 226-246 (1992).
  18. Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 1448-1460 (1996).
  19. Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 14, S55-S61 (2003).
  20. Romagnani, P., Kalluri, R. Possible mechanisms of kidney repair. Fibrogenesis Tissue Repair. 2, 3(2009).
  21. Bonventre, J. V., Yang, L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121, 4210-4221 (2011).
  22. Grgic, I., et al. Targeted proximal tubule injury triggers interstitial fibrosis and glomerulosclerosis. Kidney Int. 82, 172-183 (2012).
  23. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  24. Reimschuessel, R., Williams, D. Development of new nephrons in adult kidneys following gentamicin-induced nephrotoxicity. Ren Fail. 17, 101-106 (1995).
  25. Salice, C. J., Rokous, J. S., Kane, A. S., Reimschuessel, R. New nephron development in goldfish (Carassius auratus) kidneys following repeated gentamicin-induced nephrotoxicosis. Comp Med. 51, 56-59 (2001).
  26. Augusto, J., Smith, B., Smith, S., Robertson, J., Reimschuessel, R. Gentamicin-induced nephrotoxicity and nephroneogenesis in Oreochromis nilotica, a tilapian fish. Dis Aquatic Org. 26, 49-58 (1996).
  27. Elger, M., et al. Nephrogenesis is induced by partial nephrectomy in the elasmobranch Leucoraja erinacea. J Am Soc Nephrol. 14, 1506-1518 (2003).
  28. Watanabe, N., et al. Kidney regeneration through nephron neogenesis in medaka. Develop Growth Differ. 51, 135-143 (2009).
  29. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  30. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
  31. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  32. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, e189(2007).
  33. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
  34. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  35. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  36. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, (2011).
  37. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  38. Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4667 (1998).
  39. Anzenberger, U., et al. Elucidation of megalin/LRP2-dependent endocytic transport processes in the zebrafish pronephros. J Cell Sci. 15, 2127-2137 (2006).
  40. Majumdar, A., Drummond, I. A. The zebrafish floating head mutant demonstrates podocytes play an important role in directing glomerular differentiation. Dev Biol. 222, 147-157 (2000).
  41. Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin, and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285, 316-329 (2005).
  42. Brien, L. L., Grimaldi, M., Kostun, Z., Wingert, R. A., Selleck, R., Davidson, A. J. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358, 318-330 (2011).
  43. Ebarasi, L., Oddsson, A., Hultenby, K., Betsholtz, C., Tryggvason, K. Zebrafish: a model system for the study of vertebrate renal development, function, and pathophysiology. Curr Opin Nephrol Hypertens. 20, 416-424 (2011).
  44. Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Diep, C. Q., Davidson, A. J., de Caestecker, M., Hukriede, N. A. Zebrafish kidney development: basic science to translational research. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, 141-156 (2011).
  45. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  46. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  47. Cox, W. G., Singer, V. L. A high-resolution, fluorescence-based method for localization of endogenous alkaline phosphatase activity. J Histochem Cytochem. 47, 1443-1456 (1999).
  48. Drummond, I. A., Davidson, A. J. Zebrafish kidney development. Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).
  49. Watson, L., Vassallo, J., Cantor, G., Lehman-McKeeman, L. Lectin histochemistry: an alternative to immunohistochemistry for identify specific structures in rat papillary necrosis. HistoLogic. 41, 28-31 (2008).
  50. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604(2014).
  51. Seiler, C., Pack, M. Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene. Gene Expr Patterns. 11, 118-121 (2011).
  52. Little, M. H. Regrow or repair: potential regenerative therapies for the kidney. J Am Soc Nephrol. 17, 2390-2401 (2006).
  53. Romagnani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat Rev Nephrol. 9, 137-146 (2013).
  54. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  55. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  56. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. General Med. 1 (3), (2013).
  57. Groh, E. D., et al. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor population. J Am Soc Nephrol. 21, 794-802 (2010).
  58. Cosentino, C. C., et al. Histone deacetylase inhibitor enhances recovery after AKI. J Am Soc Nephrol. 24, 943-953 (2013).

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成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析
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