利用荧光蛋白监测非洲锥虫中糖酵体的动态变化

摘要

利用电子显微镜和荧光显微镜等传统细胞生物学技术研究非洲锥虫中糖酵体的动态变化较为困难。为了观察细胞器的动态行为，已有研究结合使用荧光细胞器报告系统与流式细胞术，对活体寄生虫中糖酵体的实时动态进行监测。

摘要

Trypanosoma brucei 是一种动质体科寄生虫，可引起人类非洲锥虫病（HAT），即昏睡病，以及牛的消耗性疾病——那加那病¹。该寄生虫在哺乳动物宿主的血液和采采蝇传播媒介之间交替存在。许多细胞器的组成会随着这些不同的胞外环境条件而发生变化^2-5。

糖酵体是一种高度特化的过氧化物酶体，其中区室化了参与糖酵解的多种酶。糖酵体的组成以发育依赖性和受环境调控的方式发生变化^4-11。目前，研究糖酵体动态的最常用技术是电子显微镜和荧光显微镜；这些技术成本高、耗时且劳动强度大，难以适应高通量分析。

为了克服这些局限性，已建立一种荧光糖酵解体报告系统，该系统将增强型黄色荧光蛋白（eYFP）与过氧化物酶体靶向序列（PTS2）融合，从而引导融合蛋白进入糖酵解体¹²。当PTS2-eYFP融合蛋白被导入后，糖酵解体即呈现荧光。细胞器的降解与再循环会导致荧光信号减弱，该变化可通过流式细胞术进行定量检测。该方法可在无需固定、封片等复杂样品处理的前提下，实时分析大量细胞（每秒5,000个细胞）。此技术为快速检测细胞器组成在动态环境条件下的变化提供了有效手段。

引言

Trypanosoma brucei 会导致人类的非洲昏睡病以及牛的消耗性疾病——那加那病。目前用于治疗这些疾病的药物陈旧且毒性极高，尚无可用疫苗，且存在产生耐药性的风险，因此亟需寻找新的药物靶点¹。

在生命周期中，T. brucei 在昆虫媒介和哺乳动物宿主之间交替；这两种宿主为寄生虫的生存提供了截然不同的环境。当寄生虫暴露于不同环境条件时，会发生一系列代谢和形态上的变化。其中最显著的变化之一发生在一种单层膜包被的、寄生虫特有的微体——糖酵解体中¹³。

血液中的葡萄糖水平相对较高（约 5 mM），而血液阶段的寄生虫（BSF）完全通过糖酵解生成 ATP，同时其线粒体代谢受到抑制¹⁴。与其他真核生物中糖酵解发生在细胞质中的情况不同，T. brucei 将大部分糖酵解酶区室化于糖酵解体中^14,15。当采采蝇吸食血液时，这些寄生虫被摄入体内，并经历葡萄糖浓度的下降，在被采采蝇摄入后 15 分钟内葡萄糖水平即降至无法检测的程度。昆虫阶段（前循环型，PCF）寄生虫的代谢更具灵活性，可利用葡萄糖以及脯氨酸等氨基酸合成 ATP^16-18。比较蛋白质组学研究表明，糖酵解体和线粒体蛋白在生活周期不同阶段发生依赖性变化，其中血液阶段寄生虫的糖酵解相关蛋白增加，而线粒体中参与三羧酸....

方案

1. 锥虫的一般培养

1. 称取SDM79培养基配制所需的固体成分（表1）。
2. 将固体成分储存于50 ml锥形瓶或Ziploc 袋中，4 °C保存。注意：试剂在至少6个月内保持稳定。
3. 将胎牛血清（FBS）在37 °C水浴中解冻，并定期颠倒混匀。注意：FBS由供应商提供时为无菌溶液。对FBS进行过滤除菌会降低其支持寄生虫生长的能力。
4. 待整瓶血清完全解冻后，在56 °C水浴中加热灭活30分钟，期间定期混匀，以尽量减少血清成分的沉淀。
5. 在室温下解冻青霉素/链霉素溶液（pen/strep）、血红素（2 mg/ml溶于50 mM NaOH）以及基础Eagle培养基维生素溶液。
6. 向1,000 ml量筒中加入20.2 g SDM79固体成分（表1）和液体组分（表2），并在搅拌器上充分混匀。
7. 调节pH至7.35，并加水定容至850 ml。
8. 通过将真空管连接至滤瓶底部进行过滤除菌。施加真空直至溶液完全过滤。
9. 在生物安全柜中取下滤器上部，加入150 ml加热灭活的FBS。取下无菌瓶盖的塑料保护膜，密封培养基瓶。
10. SDM80培养基的配制方法与SDM79相同，但有以下例外：不添加葡萄糖和氨基葡萄糖，使用不含谷氨酰胺的MEM培养基。以135 ml透析并加....

结果

在该系统中，观察到糖体组成随葡萄糖浓度变化而改变。当细胞在含葡萄糖的培养基中生长时，可观察到两种细胞群体：一种荧光强，一种荧光弱（图2A）。荧光弱的细胞含有未成熟的糖体，尚未导入PTS2eYFP；而荧光强的细胞则含有成熟与未成熟糖体的混合物¹²。当培养基中存在葡萄糖时，糖体蛋白的错误定位具有致死性^15,28，且糖体蛋白的表达很可能与导入过程紧密偶联。这种严格的调控机制导致在细胞缺乏足够导入能力时，糖体蛋白的表达受到抑制，从而出现荧光弱的细胞。一旦糖体导入机制完全组装并具备功能，细胞便开始表达糖体蛋白，这些蛋白随后被导入糖体中，从而产生荧光细胞。在缺乏葡萄糖的培养基中，糖体蛋白的错误定位可被耐受¹⁵，双峰分布被单一的、荧光强度范围更广的峰所取代（图2B）。

该系统已被用于鉴定触发糖酵解体组成变化的条件。当含有约10%暗细胞的高密度培养物（图3A）转入新鲜培养基后，暗细胞比例会出现短暂上升（图3B

讨论

糖酵体是必需的、动态的、寄生虫特有的细胞器。调控这些细胞器的生物发生、维持、增殖和重塑过程的机制可能包含可作为药物靶点的分子，有望被用于治疗目的。尽管此类药物靶点可能非常丰富，但糖酵体生物发生领域的研究进展却落后于其他生物中类似过程的研究，主要原因是缺乏一种可操作的高通量系统，用于在活细胞中监测快速而动态的细胞器响应。

荧光细胞器报告系统已被用于研究酵母、植物、真菌和哺乳动物等高等真核生物中的细胞器动态^23-25。我们构建了一种表达PTS2eYFP的PCF寄生虫转基因株系，该蛋白靶向成熟的糖酵解体，从而使细胞器产生荧光。通过检测细胞荧光，可监测糖酵解体组分的变化。利用该系统，我们发现环境条件（尤其是葡萄糖）可调控糖酵解体的组成¹²。

与常用于研究动质体寄生虫细胞器动态的显微镜方法不同，该报告系统提供了一种快速筛选影响整体乙醛酸循环体动态的化合物和条件的方法。然而，荧光的变化反映的是整个细胞器组分的变化，要明确表现出不同荧光强度的细胞群体之间特定的分子差异，还需进一步开展生物化学和显微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 成分
L-丙氨酸	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 成分
L-精氨酸	CalBiochem	1820	SDM79 成分
对氨基苯甲酸	ICN Biomedicals	102569	SDM79 成分
基础伊格尔培养基维生素溶液（100倍浓缩）	Sigma	B6891	SDM79 成分
生物素	Fisher	BP232-1	SDM79 成分
氯化钙	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix 成分
EZNA 凝胶回收试剂盒	Omega Biotek	D2500-01	DNA 纯化
研究级血清	Fisher	03-600-511	SDM79 成分
叶酸	ICN Biomedicals	101725	SDM79 成分
盐酸氨基葡萄糖	ICN Biomedicals	194671	SDM79 成分
葡萄糖	GIBCO	15023-021	SDM79 成分
L-谷氨酰胺	CalBiochem	3520	SDM79 成分
甘油	Acros Organics	Ac15892-0010	冻存液
Graces 昆虫细胞培养基粉末	GIBCO	11300-043	SDM79 成分
血红素	MP Biomedicals	194025	SDM79 成分
鸟苷	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 成分
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 成分
氯化镁	Fisher	BP214-500	Cytomix 成分
L-甲硫氨酸	Fisher	BP388-100	SDM79 成分
MEM 氨基酸溶液（50倍浓缩）	Cellgro	25-030-CI	SDM79 成分
非必需氨基酸混合液（100倍浓缩）	Lonza	13-114E	SDM79 成分
最低必需培养基（1倍）含 L-谷氨酰胺	Cellgro	10-0010-CM	SDM79 成分
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 成分
碳酸氢钠	Fisher	S233-500	SDM79 成分
青霉素-链霉素溶液	Cellgro	30-002-CI	SDM79 成分
L-苯丙氨酸	ICN Biomedicals	102623	SDM79 成分
氯化钾	Fisher	P217-500	Cytomix 成分
无水磷酸氢二钾	Fisheer	P290-212	Cytomix 成分
L-脯氨酸	Fisher	BP392-100	SDM79 成分
L-丝氨酸	Acros Organics	56-45-1	SDM79 成分
丙酮酸钠	Acros Organics	113-24-6	SDM79 成分
L-牛磺酸	TCI America	A0295	SDM79 成分
L-苏氨酸	Acros Organics	72-19-5	SDM79 成分
L-酪氨酸	ICN Biomedicals	103183	SDM79 成分
E.Z.N.A. Cycle Pure 试剂盒	Omega Biotek	D6492-02	DNA 纯化
结合缓冲液	Omega Biotek	PDR041	DNA 纯化
SPW 洗涤缓冲液	Omega Biotek	PDR045	DNA 纯化
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	锥虫转化
4 mm 电穿孔比色皿	VWR		锥虫转化