在变态过程中，海七鳃鳗会失去胆囊和胆管，这一过程类似于人类的胆道闭锁。本研究改进了一种新的固定与透明化方法（CLARITY），以利用激光扫描共聚焦显微镜对整个胆管系统进行可视化观察。该方法为研究胆管退行性变化提供了强有力的工具。
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摘要
摘要
胆道闭锁是一种罕见的婴儿期疾病，在美国东南部的发病率约为1/15,000，但在东亚国家更为常见，中国台湾地区的报告发病率为1/5,000。尽管目前对胆道闭锁的治疗已有较多了解，但其发病机制仍不明确。海七鳃鳗（Petromyzon marinus）为研究胆道退化的机制与进展提供了独特的机遇。海七鳃鳗的发育经历三个不同的生命阶段：幼体期、寄生期和成体期。在从幼体向寄生性幼鱼转变的过程中，海七鳃鳗经历变态发育，其外部形态和内部器官发生显著的重组与重塑。在肝脏中，整个胆道系统均会消失，包括胆囊和胆管树。研究人员改进了一种名为“CLARITY”的新方法，用于透明化处理变态期海七鳃鳗的整个肝脏及其与肠道的连接部位。通过激光扫描共聚焦显微镜，可在海七鳃鳗变态过程中直观观察并分辨胆道退化的过程。该方法为在这一独特动物模型中研究胆道闭锁提供了强有力的工具。
引言
七鳃鳗的发育经历三个截然不同的生命阶段1,2。幼体七鳃鳗（L）大部分时间栖息于洞穴中，作为底栖滤食性动物生活。经过七个阶段的变态过程，其外部形态发生显著变化，内部器官也重新组织3，最终形成的幼年个体（JV）进入寄生阶段，在此期间以宿主鱼类的血液和组织液为食，体重可增加100多倍。在海洋或大型湖泊中寄生摄食1.0至1.5年后，成体于早春停止摄食，洄游至河流中产卵，随后死亡1,2。
在变态过程中，海七鳃鳗的肝脏会失去胆囊和整个胆管系统，这一进化突变表型模拟了人类婴儿期疾病胆道闭锁。婴儿胆道闭锁是一种罕见的小儿肝病，可导致严重的医学并发症4,5,6,7,8,9,10，但胆道闭锁的发病机制和病因在很大程度上仍不清楚4。未经外科干预（Kasai手术）治疗，胆道闭锁患儿通常在出生后两年内死亡5。此后，这些患者需要长期的临床管理，并常常需要进行肝移植 6。关于胆道闭锁的病因和发病机制已提出多种理论，如病毒感染、先天性畸形、自身免疫性疾病以及毒性损伤等。然而，每种因素在胆道闭锁发生发展中的具体作用仍无定论7,8,9,10。
与患有病理性胆道闭锁的婴儿不同，海七鳃鳗在发育过程中会发生程序性胆道闭锁，但不会出现广泛的坏死性炎症、纤维化或肝硬化10。在此过程中，这些动物可能会经历短暂的胆汁淤积10，但可通过发育后胆道闭锁后在肠道中重新合成并分泌胆汁酸来适应这一发育状态，此外还存在其他已知机制，例如肝脏中胆汁酸合成的减少11。海七鳃鳗的这一发育过程为研究胆道闭锁的进展提供了目前已知的唯一机会。
一种新开发的方法称为“CLARITY”，可通过将完整组织转化为光学透明的纳米多孔水凝胶，实现复杂哺乳动物神经系统的高分辨率成像12。利用七鳃鳗肝脏及改良的CLARITY方案，可在肝脏变态过程中全程记录胆道退化的完整组织成像。
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方案
1. 溶液配制
- 配制 1 L 10 倍浓度 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）：称取 26.2 g 磷酸二氢钠、115 g 磷酸氢二钠和 87.66 g NaCl。溶于约 800 ml 蒸馏水 H2O 中，调节 pH，再用蒸馏水 H2O 定容至 1 L。
- 配制 1 L 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）：取 100 ml 10 倍浓度 PBS，加入 900 ml 蒸馏水 H2O。
- 配制含 0.1% Triton X-100 的 1 L 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）：取 100 ml 10 倍浓度 PBS，加入 1 ml Triton X-100，再用蒸馏水 H2O 定容至 1 L。
- 配制 1 L 10 倍浓度 0.1 M 磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）：称取 26.2 g 磷酸二氢钠和 115 g 磷酸氢二钠。溶于约 800 ml 蒸馏水 H2O 中，调节 pH，再用蒸馏水 H2O 定容至 1 L。
- 配制 1 L 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）：取 100 ml 10 倍浓度 PB，加入 900 ml 蒸馏水 H2O。
- 配制含 0.1% Triton X-100 的 1 L 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）：取 100 ml 10 倍浓度 PB，加入 1 ml Triton X-100，再用蒸馏水 H2O 定容至 1 L。
- 配制 400 ml 水凝胶单体溶液（含 4% 丙烯酰胺、0.25% 二丙烯酰胺、4% 多聚甲醛、0.0075% 过硫酸铵、0.0005% 皂苷的 0.1 M PBS 溶液）：称取 0.3 g 过硫酸铵和 0.2 g 皂苷。加入 210 ml 蒸馏水 H2O、40 ml 40% 丙烯酰胺、10 ml 2% 二丙烯酰胺、40 ml 10 倍浓度 PBS（pH 7.4）、100 ml 16% 多聚甲醛，充分混匀。
- 配制 4 L 透明化溶液（含 4% SDS 的 0.2 M 硼酸溶液）：称取 49.464 g 硼酸和 160 g SDS。溶于约 3.5 L 蒸馏水 H2O 中，用 NaOH 调节 pH 至 8.5，再定容至 4 L。
- 配制 1 L 80% 甘油溶液：量取 800 ml 甘油，加入 200 ml 蒸馏水 H2O，充分混匀。
2. 组织制备
- 制备水凝胶单体溶液，并将10 ml分装至每个15 ml离心管中。
- 解剖完整组织，并在4 °C下用水凝胶固定2天。确保水凝胶溶液的体积至少为组织体积的10倍。
- 将水凝胶固定的组织（置于15 ml离心管中）转移至通风橱内。
- 加入5 µl TEMED以引发聚合反应，充分混匀后，在室温通风橱中静置2–3小时，使水凝胶固定组织完成聚合。
- 彻底去除多余的凝胶。注意：残留的额外凝胶会阻碍后续透明化过程以及染色过程中抗体的渗透。
- 将固定后的组织置于10 ml透明化溶液中，在摇床培养箱中以70 rpm、50 °C孵育数天，直至组织变得透明。每天至少更换一次透明化溶液，并在更换溶液时清除组织表面多余的凝胶。
- 用含0.1% Triton X-100的10 ml 0.1 M PB缓冲液，在70 rpm、37 °C条件下过夜清洗组织。重复此步骤3次，并在更换缓冲液时清除组织表面多余的凝胶。
- 将透明化后的组织置于含0.1% Triton X-100的PB缓冲液中的初级抗体溶液中，在70 rpm、37 °C条件下孵育2天。注意：需配制足够的初级抗体溶液以完全浸没整个组织。
- 用含0.1% Triton X-100的10 ml PB缓冲液，在70 rpm、37 °C条件下过夜清洗组织。重复此步骤3次，并在更换缓冲液时清除组织表面多余的凝胶。
- 以下步骤需在暗室或弱光条件下进行。用铝箔包裹样品，防止发生光漂白。
- 将透明化后的组织置于含0.1% Triton X-100和封闭血清的PB缓冲液中的荧光标记二抗溶液中，在70 rpm、37 °C条件下孵育1天。
- 用含0.1% Triton X-100的10 ml PB缓冲液，在70 rpm、37 °C条件下过夜清洗组织。重复此步骤3次，并在更换缓冲液时清除组织表面多余的凝胶。
- 用10 ml PBS缓冲液，在70 rpm、37 °C条件下过夜清洗组织。重复此步骤3次，并在更换缓冲液时清除组织表面多余的凝胶。
- 将透明化后的组织置于80%甘油溶液中，在70 rpm、37 °C条件下过夜孵育。
- 荧光染色完成后的组织在共聚焦显微镜检测前应于4 °C保存。
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结果
在七鳃鳗变态过程中，肝胆系统会发生多个重要的发育事件。胆管和胆囊经历凋亡并退化（图1）。结合改良的透明化方法与共聚焦显微镜技术，利用肝细胞标志物细胞角蛋白19（CK19，在变态前后胆管细胞和肝细胞中均存在13）以及抗凋亡标志物Bcl2进行染色，沿Z轴完整捕获了整个胆道系统（图2），并重建了其三维结构（图3）。由于大部分胆道系统嵌于肝脏内部，仅胆管进入肠道的连接部位除外，因此采用激光扫描共聚焦显微镜对完整肝脏进行光学切片。退化过程发生在变态第2至第4阶段，从外周的小胆管开始，逐渐向肝内中央的大胆管发展（图2），这与早期研究结果一致10。
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讨论
本方案改编自一种名为“CLARITY”的新方法12，该方法通过聚丙烯酰胺与完整组织交联形成纳米多孔水凝胶，随后去除组织的质膜，从而实现光学透明性和大分子通透性。“CLARITY”技术可实现对神经系统中长距离投射和局部环路连接的完整组织成像。该新方法可用于在七鳃鳗变态过程中对其肝脏内整个胆道系统进行可视化。在生物学研究中，利用传统的包埋和切片方法，从胆道系统或中枢神经系统等复杂系统中同时获得高分辨率信息并保持整体结构视角仍是一项挑战。经改进的CLARITY方法可在普通激光扫描共聚焦显微镜上，使用低倍荧光物镜（4x）使激光穿透完整的七鳃鳗幼体肝脏，穿透厚度可达1至2 mm。若使用更先进的多光子共聚焦显微镜，可实现更深的穿透。三维图像可通过三维重建软件进行重构。若采用传统方法获得类似结果，则需耗时费力地对大量切片进行分段重建，且仅限于小体积组织。该新方法可提供来自完整系统整体结构分析的宝贵信息12，具有更低的劳动强度、更高的效率和良好的可重复性。
该新方法的另一个优势在于，样...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国地质调查局五大湖科学中心哈蒙德湾生物站的贡献。我们还感谢密歇根州立大学先进显微镜中心的Melinda Frame博士在激光扫描共聚焦显微镜方面提供的技术支持。本研究得到了五大湖渔业委员会向YWCD和WML提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40% 丙烯酰胺 | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% 双丙烯酰胺 | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | A3678-25G | |
| 硼酸 | Sigma | B7901-1KG | |
| 皂苷 | Sigma | 47036 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma | L337-500G | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma | 04269-1KG | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma | S5136-1KG | |
| 吐温 X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| 甘油 | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| 氢氧化钠颗粒 | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml 离心管 | 任意品牌 | ||
| 解剖工具 | 任意品牌 |
参考文献
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重印与许可
