使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

摘要

SILAC 免疫共沉淀实验是发现新蛋白质-蛋白质相互作用的有力手段。通过在对照样本和测试样本中准确相对定量蛋白质丰度，可轻松区分真实的相互作用与实验污染物，并且通过使用较温和的缓冲条件，能够保留低亲和力的相互作用。

摘要

定量蛋白质组学结合免疫亲和纯化与SILAC免疫沉淀，是发现新型蛋白质-蛋白质相互作用的有力手段。通过实现对对照样本和测试样本中蛋白质丰度进行精确的相对定量，可轻松区分真实的相互作用与实验污染物。利用较宽松的缓冲液条件，可保留低亲和力的相互作用，并仍能便捷地加以鉴定。本方案介绍了用稳定同位素标记的氨基酸对组织培养细胞进行标记、转染并免疫沉淀带有亲和标签的目标蛋白，随后进行质谱分析前的样品制备。本方案进一步阐述了如何分析和解读质谱仪返回的数据，以鉴定与目标蛋白相互作用的细胞伴侣蛋白。作为示例，该技术被应用于鉴定与真核翻译起始因子eIF4AI和eIF4AII结合的蛋白质。

引言

理解蛋白质功能的关键步骤之一是鉴定与其相互作用的相关蛋白质。当这些相互作用蛋白未知时，可采用多种技术，每种技术各有其优势与局限性。这些技术包括酵母双杂交系统、使用重组蛋白的下拉实验，以及串联亲和纯化（TAP标记）^1,2。

近年来，一种新的技术组合被引入该领域：从相关的哺乳动物细胞系中对目标蛋白进行亲和纯化，随后利用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）进行定量质谱分析³。与酵母双杂交方法相比，该技术的优势在于不会干扰蛋白的细胞定位和翻译后修饰；与传统的TAP标签技术相比，其优势在于这是一种定量而非定性的方法，使研究者能够轻松区分非特异性相互作用的蛋白和污染物，以及特异性结合的宿主因子。此外，由于样品通常作为整体进行分析，而非作为单独的蛋白条带，目标蛋白不会因在凝胶中迁移位置相近的其他蛋白而被掩盖，也通常无需达到染色后可见所需的丰度水平，从而显著提高了可被可靠鉴定的蛋白数量⁴。

为了演示该技术，通过SILAC-免疫沉淀定量蛋白质组学方法研究了序列高度相似的真核翻译起始因子eIF4AI和eIF4AII的GFP融合蛋白，二者氨基酸序列同一性超过90%。将人源eIF4AI和eIF4AII克隆至pEGFP-C1载体中，构建GFP与eIF4A蛋白N端融合的融合蛋白。为避免构建稳定细胞系，采用瞬时转染方法将这些质粒转染至稳定同位素标记的293T细胞中。

细胞首先在SILAC细胞培养基中标记两周，随后转染编码目的蛋白的质粒DNA。接着裂解细胞，标准化蛋白浓度，并使用抗GFP琼脂糖对等量裂解液进行亲和纯化。将等量的洗脱液混合后，进行LC-MS/MS分析。分析结果经处理后用于鉴定高置信度的蛋白质-蛋白质相互作用（图1）。

SILAC 免疫共沉淀技术不仅能够鉴定直接相互作用，还能鉴定与蛋白质复合物的低亲和力或间接相互作用⁴。利用该系统，对 eIF4AI 和 eIF4AII 进行免疫共沉淀可重复且可靠地鉴定出其主要结合伴侣 eIF4G（亚型 I/II 和 III）⁵，以及与 eIF4E 的间接相互作用和 eIF3 复合物的多个组分。

方案

1. SILAC标记细胞系的建立与传代

注意：在传代和实验样品制备的各个阶段，均应避免使用胰蛋白酶-EDTA（Trypsin-EDTA），因为胰蛋白酶中可能含有未标记的氨基酸，从而导致样品标记不完全。

1. 配制一瓶SILAC培养基时，向500 ml不含精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基（含L-谷氨酰胺）中加入0.5 ml适当同位素标记的精氨酸（84 mg/ml，溶于PBS）和赖氨酸（146 mg/ml，溶于PBS）。
2. 接着，向该500 ml培养基中加入50 ml透析胎牛血清（dialyzed FBS）和5 ml青霉素/链霉素溶液。
   注意：HEK 293T细胞（ATCC来源）应培养于缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基中，并补充轻链（R0K0）、中链（R6K4）或重链（R10K8）标记的氨基酸、透析胎牛血清（截留分子量10 kDa）以及青霉素/链霉素。细胞必须在该培养基中维持至少5次细胞分裂，以确保完全标记。大多数情况下，细胞在≥2周内即可完成充分标记。
3. 传代细胞时，可通过轻敲培养瓶使细胞从单层上脱落。也可选用细胞刮刀或无酶的、基于PBS的细胞解离缓冲液进行操作。
   注意：为节约培养基，细胞应在T25培养瓶中传代，仅在实验前立即扩增至所需数量。
4. 转染细胞前24小时，将3.5 × 10⁶个SILAC标记的细胞接种至每个实验条件下的一块10 cm²培养皿中。

2. 使用 pEGFP 融合构建体转染标记细胞

1. 吸去细胞中的培养基，加入 9 ml 无抗生素的 SILAC DMEM（轻、中或重型）培养基。
   注意：不应在培养基中添加抗生素，因为它们可能会干扰基于脂质体的转染试剂的转染效率。
2. 在 500 μl 无抗生素的 SILAC DMEM 中加入 10 μg 相应质粒（epEGFP-C1、pEGFP-eIF4A-I、pEGFP-eIF4A-II），混匀后与含有 10 μl 转染试剂（例如，lipofectamine 2000）的 500 μl 无抗生素 SILAC DMEM 混合。通过反复吹打数次充分混匀反应液。
3. 室温孵育反应混合物 20 分钟，然后逐滴加入细胞单层中。轻轻左右摇动培养板。
4. 将转染后的细胞在 37 °C、10% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
   注意：如果目标蛋白的表达导致明显的细胞毒性，则可能需要减少转染质粒的量和/或缩短后续表达时间。

3. 收集细胞裂解液

1. 使用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下，并收集到预冷的 PBS 中。在 220 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟收集细胞。再用 10 ml 预冷的 PBS 洗涤细胞 3 次。
2. 将细胞沉淀重悬于 200 μl 细胞裂解缓冲液（10 mM TrisCl/pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA，0.5% NP40）中，缓冲液中需新鲜添加 1× 浓度的蛋白酶抑制剂混合物 III 和（可选）RNase 混合物（每毫升加入 5 μl）。
   注意：对于已知具有核酸结合活性的蛋白质，在沉淀前可能需要向裂解物中添加核酸酶。若添加核酸酶，样品应在冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟吹打一次。可通过从少量样品中提取总核酸，并进行琼脂糖凝胶电泳分析，以检测核酸酶的消化效果。
3. 在 13,000 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟，保留上清液作为可溶性细胞裂解物。
4. 应根据制造商说明书，通过 BCA 法测定细胞裂解物的蛋白浓度。
5. 使用含有蛋白酶抑制剂混合物 III 的裂解缓冲液，将蛋白浓度调整至最终体积为 500 μl。
6. 加入 500 μl 稀释缓冲液（10 mM TrisCl/pH 7.5，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA），其中含 1× 浓度的蛋白酶抑制剂混合物 III，将体积调至 1 ml。应保留 50 μl 样品作为输入对照，其余裂解物置于冰上备用，同时准备抗 GFP 磁珠（e.g.，GFP-trap）。
   注意：通常最终 1 ml 样品中的蛋白产量在 1–3.5 mg 之间。尽管上述缓冲液适用于许多目标蛋白，但对于某些蛋白，可能需要调整缓冲液组分以确保诱饵蛋白的可溶性并维持蛋白质-蛋白质相互作用。可能的调整包括缓冲体系（磷酸盐、HEPES）、盐浓度（150–500 mM）、去垢剂种类或其他添加剂。

4. 与抗GFP磁珠结合

1. 轻轻涡旋磁珠悬液以重悬磁珠。使用剪去末端的200 μl吸头，将每份样品25 μl磁珠转移至新的离心管中。
   注意：为减少样品间差异，建议将单次SILAC实验所需的磁珠以预混液形式统一制备。
2. 每25 μl磁珠悬液中加入20倍体积（每75 μl悬液加1,500 μl）稀释缓冲液，在2,700 × g条件下离心5分钟。随后，再用20倍体积的稀释缓冲液洗涤磁珠2次。
3. 每25 μl磁珠悬液中加入100 μl稀释缓冲液。使用剪去末端的200 μl吸头，将85 μl重悬后的磁珠悬液分别加入第3.6步获得的SILAC标记样品中。
4. 将样品置于旋转器上，在4 °C孵育2小时。

5. 洗脱、洗脱液收集及质谱分析样品制备

1. 将样品在 2,700 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟。保留 50 μl 上清液作为未结合样品，其余上清液弃去。
2. 向每根试管中加入 1 ml 稀释缓冲液以重悬磁珠，并在 2,700 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。此步骤需重复两次。
3. 通过加入 50 μl 2x SDS 上样缓冲液并在 95 °C 加热 10 分钟，从磁珠中洗脱蛋白，然后在 4 °C 下以 2,700 x g 离心 2 分钟，使磁珠沉淀。
4. 将上清液收集至预先润滑的离心管中，并可在 -80 °C 保存至后续使用。如需提交至质谱平台，请将标记的样品按 1:1:1 混合（例如，每种样品取 10 μl），并提交混合后的样品。
   注意：此时可通过 Western 印迹、银染或其他方法检测样品是否与已知或未知的相互作用蛋白结合。如图 2所示，通过 Western 印迹可观察到已知相互作用蛋白 eIF4G 的特异性结合，且在目标蛋白的 pull-down 样品中可见银染条带，而对照样品中则无。
5. 提交样品进行 LC-MS/MS 分析。
   注意：在确认目标标签蛋白能够有效结合其相互作用蛋白后，将各标记样品（轻、中、重标记）取等体积混合后提交 LC-MS/MS 分析。通常提交 30 μl 总体积的免疫沉淀样品用于分析，即分别取 10 μl 轻标记、10 μl 中标记和 10 μl 重标记样品混合，总体积为 30 μl。

6. 数据分析 I：理解结果及去除低置信度鉴定

注：Proteome Discoverer 软件返回的列标题列表见表1。不同软件（例如，MSQuant、MaxQuant）会返回不同的标题，但分析仅需其中一部分，而这些标题在各种软件包中是共通的。数据应始终包含每种鉴定出的蛋白质的登录号、各样品间比值的比较（轻链 vs 中链、轻链 vs 重链、中链 vs 重链等）、鉴定出的唯一肽段数量，以及某种形式的假阳性率或置信度指标。

1. 在处理数据之前，首先将原始数据复制到一个新的电子表格中。从该电子表格中删除除以下列以外的所有列：登录号、唯一肽段数量、样本间比值、比值变异性以及蛋白质描述信息。如果进行了重复实验，应将它们合并到一个 Excel 文件中，每个实验分别放在不同的工作表标签页中。
   注意：低置信度数据包括仅由单个唯一肽段鉴定出的蛋白质，以及无法进行定量的蛋白质。
2. 使用 Excel 的“排序”功能，按肽段数量对数据进行排序，并删除仅含一个肽段的蛋白质条目。然后按比值排序，并删除缺乏 SILAC 比值的蛋白质（即未定量的蛋白质）。
3. 使用公式“=log(SILAC Ratio,2)”将 SILAC 比值转换为 log₂ 值，其中“SILAC Ratio”替换为对应单元格的标识符。
   注意：由于 SILAC 比值中丰度下降的蛋白质数据值范围被限制在 0 到 1 之间，通常会将 SILAC 比值转换为 log₂ SILAC 比值，这样在样本中丰度增加或减少的蛋白质均可在对数尺度上表示，其中 2 或 -2 分别代表丰度增加或减少 4 倍，3 或 -3 分别代表增加或减少 9 倍。经过此转换后，数据应符合以 log₂ SILAC 比值为 0 的中心的高斯分布。示例见图 3。
4. 在 Excel 文件中创建新列，并计算所有样本/对照列的 log₂ SILAC 比值。若需将对照/样本比值转换为样本/对照比值，请使用公式：“=1/比值”

7. 数据分析 II：选择高置信度相互作用进行深入研究

1. 打开 Graphpad Prism，选择新建>数据表与图表… 在窗口左侧列表中选择“列”，然后选择“输入/导入数据>将重复值输入为按列堆叠”的选项，点击“创建”。
2. 从 Excel 表格中复制指定的 log₂ 样本/对照 SILAC 比值列，并粘贴到新的 Prism 文件中。
3. 点击下拉菜单“插入”，选择“新分析”。在列分析中选择“频率分布”，保留默认设置后点击“确定”。
   注：此步骤生成一个直方图，显示在特定比值下鉴定到的蛋白质数量，应呈现为高斯分布。
4. 在“结果”文件夹中将生成一个新的“直方图”部分，选择该频率分布部分。
5. 点击下拉菜单“插入”，选择“新分析>XY>非线性回归（曲线拟合）”。选择“高斯分布”后点击“确定”。
   注：此步骤对第 7.3 步生成的频率分布数据进行曲线拟合，得到可用于后续计算显著性阈值的参数。
6. 在出现的结果窗口中，将显示均值和标准差。通过将 1.96 倍标准差加至均值来生成阈值。
   注：这些数值代表高斯分布的均值和标准差，而非整个数据集的统计值。1.96 倍标准差对应 95% 置信限（p≤0.05）；2.58 倍标准差对应 99%，3.3 倍标准差对应 99.9%。应针对每次重复实验单独确定阈值，因其可能有所不同。

8. 数据分析 III：合并重复数据集

注意：为了可靠地鉴定相互作用蛋白，理想的SILAC下拉实验应至少重复三次，其中一次重复需交换中等和重同位素标记的样本，以消除培养基对实验结果可能产生的影响。若某一蛋白在三次实验中的至少两次中被检测到存在相互作用，且理想情况下该相互作用也在“交换”培养基的样本中得到验证，则可认定为高置信度的相互作用。

1. 返回 Excel 文件，创建一个名为“合并”的新工作表。将 A 列标记为“登录号”，并将各个独立实验中的所有登录号复制到此单一列中。
2. 选择“数据”选项卡，然后选择“删除重复项”选项。
3. 为每个实验的 SILAC 比值、比值变异性以及蛋白名称/描述列创建相应的列。
4. 在描述工作表中，使用 VLOOKUP 公式收集每个登录号的描述信息。将该公式向下拖动以填充整个蛋白描述列。VLOOKUP 公式为：“=vlookup(AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)”，其中：AccessionNo 是 $aX，X 为行号；WheretoLook 是“实验工作表名称”!$a$2:$Y$Z，其中 Y 和 Z 是所引用电子表格中数据区域的右下角位置；ColumnsAccross 是从 A 列的登录号起，目标值所在列向右跨越的列数。
   注意：例如，若登录号位于 A 列，而感兴趣的数据位于 E 列，则此处数值为 5（A 列计为第 1 列）。由于在步骤 b 中已将登录号合并，因此 VLOOKUP 很可能无法从单个实验中获取所有所需的名称。当返回 N/A 时，需修改公式，依次从各实验中获取描述，直至获得全部描述信息。
5. 为在合并数据集中突出显示相互作用蛋白，依次选择每个比值列，点击“开始”选项卡，然后选择“条件格式”>“突出显示单元格规则”>“更多规则”。
6. 选择样式为“经典”。仅对包含“单元格值”且“大于或等于”的单元格进行格式设置。在输入框中键入 1.96 倍标准差的数值，然后点击“确定”。
7. 评估每个阳性相互作用的比值变异性。如果从比值中减去 % 变异性后导致“命中”低于阈值，则应谨慎对待该结果。
   注意：该值表示构成某一蛋白 SILAC 比值的各个肽段比值的一致性程度，以百分比形式给出。当考虑比值变异性后，若蛋白的 SILAC 比值仍高于阈值，则该蛋白视为有效命中；若比值变异性导致其范围低于阈值，则该“命中”可能代表污染物。
8. 对每个结果列重复上述操作，并在不同实验间进行比较。在两个或更多实验中均被突出显示的蛋白代表高置信度的相互作用。
   注意：根据用于分配蛋白登录号的数据库不同，同一蛋白在不同实验中可能被赋予不同的、甚至多个登录号。务必检查此情况，以确保不会意外遗漏蛋白。

结果

在典型的SILAC下拉实验中，所鉴定出的绝大多数蛋白质（>90%）均为污染物以及非特异性结合亲和基质的蛋白质，这一点在图2B中有所体现，即使洗涤步骤已去除了大部分细胞质污染物（如GAPDH，见图2A）。然而，非特异性结合蛋白的分布呈正态分布，因此能够将特异性结合目标蛋白的蛋白质区分开来，因为它们的样本/对照比值高于背景水平。理论上，污染物的log₂ SILAC比值应集中在0附近，但实际情况未必如此，图3给出了一个示例。可能的原因包括细胞SILAC标记不完全、上样时裂解物体积或浓度不均、纯化过程中磁珠意外丢失，或在纯化结束时样品混合不均³。然而，只要数据分析是基于与正态分布污染物均值之间的标准差阈值进行判断，数据分布中心的轻微偏移通常不会影响结果的质量。

在比较两种相关蛋白质之间蛋白质相互作用的差异时，可能会出现一种类似的情况，即其中一种目标蛋白质在细胞内的表达水平高于另一种（这可能是由于转染效率的差异，或蛋白质或mRNA本身的固有特性所致）。表达水平的一些差异（例如，见 图2A）可通过分析这两个样本的SILAC比率进行校正。在此示例中，这两个样本分别为GFP-eIF4AI和GFP-eIF4AII。通过如第7节所述分析4AI/4AII的SILAC比率，可鉴定出在不同亚型之间结合能力存在显著差异的蛋白质。

在图4中，展示了在一次重复实验中鉴定出的eIF4A结合蛋白的代表性结果，用以说明本方案对起始因子复合物的覆盖程度。通常，与eIF4A直接结合的eIF4G表现出最高比值，而eIF4E的比值较低，因其结合位点位于eIF4G上远离eIF4A结合位点的区域。eIF3复合物各组分的比值也较低。然而，该结果明确表明，本实验成功鉴定了eIF4AI和eIF4AII的直接及间接结合蛋白。由于两种亚型具有高度的序列一致性⁶，在此实验体系中，其蛋白-蛋白相互作用在很大程度上是保守的^7,8。部分相互作用蛋白的选择性结果列于表2，以展示数据的呈现格式。

列标题	描述
登录号	显示该序列的登录号
覆盖率	被鉴定出的肽段所覆盖的蛋白质序列比例
♯PSM	肽段谱图匹配数
♯肽段	为某一蛋白质鉴定出的独特肽段总数
♯氨基酸	蛋白质的氨基酸长度
分子量 (Da)	蛋白质的分子量（以道尔顿为单位），不包括修饰
计算等电点	蛋白质的理论等电点
得分	蛋白质的总得分（即各个肽段得分的总和）。达到显著性的具体得分阈值因实验而异。质谱平台通常采用5%的错误发现率作为截断值。
序列	构成该蛋白质的氨基酸序列
比值	在指定标记样本中，肽段相对于第二个标记样本的相对强度
比值数量	用于计算某一蛋白质比值的肽段比值的数量
比值变异性 (%)	用于计算某一蛋白质比值的各个肽段比值的变异性
描述	蛋白质的名称

表1. Proteome Discoverer 报告中的标准列标题。 尽管可以从所有这些列中获得有用的信息，但本分析中关键的列以粗体显示。

登录号	肽段数	4AI/Mock	4AII/Mock	名称	SILAC 分析
A8K7F6	21	100	1	eIF4AI	“诱饵”蛋白
Q14240	22	0.01	90.855	eIF4AII
G5E9S1	25	47.575	30.53	eIF4GI	相互作用蛋白
Q59GJ0	5	11.778	10.619	eIF4GII
P06730	3	7.22	7.57	eIF4E
Q5T6W5	4	0.685	0.646	hnRNPK	非特异性结合污染物
P62805	1	0.531	0.498	Histone H4
H6VRG2	18	-	-	Keratin-1	环境污染物
P35527	11	0.01	0.01	Keratin-1 cytoskeletal 9

表2. SILAC免疫沉淀实验的典型数据。 提供了目标蛋白/诱饵蛋白（高肽段数，高比值）、与目标蛋白相互作用的蛋白（高/低肽段数，高比值）、非特异性结合蛋白（高/低肽段数，比值低于截断值——本实验中为0.96）以及环境污染物（通常肽段数高，比值为负值/低于阈值）的示例数据。

图1. 实验设计。 首先将细胞培养在缺乏精氨酸（Arginine）和赖氨酸（Lysine）的培养基中，并用稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸替代培养两周（1）。（2）将细胞接种至10 cm² 培养皿中，并瞬时转染编码GFP（对照）或GFP融合蛋白（样品）的质粒。（3）裂解细胞，并从细胞裂解液中免疫沉淀GFP或GFP融合蛋白。（4）将样品按1:1比例混合后进行LC-MS/MS分析。随后对数据进行分析，去除低置信度的蛋白质鉴定结果，并筛选出对应于真实相互作用蛋白的蛋白质富集水平。

图2. 验证合适的免疫沉淀条件。A) 对细胞裂解液以及免疫沉淀后的未结合组分和结合组分进行Western blot分析，以确认目标蛋白的表达及免疫沉淀效果。针对GAPDH的Western blot证实非相互作用蛋白已被去除；另对eIF4A的已知相互作用蛋白进行的Western blot则证实了与目标蛋白结合的蛋白已成功被免疫沉淀。 B) 当目标蛋白的相互作用伙伴未知时，可通过银染凝胶确认相互作用蛋白的免疫沉淀。在此银染凝胶中，GFP及GFP-eIF4AI/II的条带清晰可见，且仅在GFP-eIF4AI/II结合组的泳道中出现一条迁移位置与eIF4G大小相符的条带，而在GFP对照组泳道中则无此条带。

图 3. 代表性结果。 直方图显示了一次重复实验中（A）GFP-eIF4AI 或（B）GFP-eIF4AII 拉下实验所得蛋白质比值的分布情况。1.96 倍标准差的截断值以虚线标出。在（A）中，偏离正常分布污染物范围的相互作用蛋白明显分布在约 0.25 至 1 的区间；在（B）中则分布在约 0.3 至 1.5 的区间。

图4. 通过单次SILAC免疫沉淀实验鉴定eIF复合物成员。 绿色标注的蛋白为用于免疫共沉淀的靶蛋白。相互作用蛋白根据SILAC免疫沉淀实验中的log₂ SILAC比率，以红色到白色渐变着色，其中红色表示分析中丰度最高的蛋白，白色表示达到1.96倍标准差（SD）的截断值。灰色着色的蛋白在本分析中未被鉴定出。

讨论

本文所述的SILAC下拉策略是一种极为灵敏且强大的方法，可用于检测新的蛋白质-蛋白质相互作用，并且能够快速、简便地区分密切相关的目标样品之间结合模式的变化。在本示例中，该技术被用于研究eIF4AI和eIF4AII蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用⁶。据作者所知，这是文献中首次利用SILAC蛋白质组学技术来探究这两种eIF4A异构体在细胞内的相互作用组。

上述方法使用了GFP标签和抗GFP磁珠^9,10，因此可能需要进行某些修改，以使该方法适用于特定的目标蛋白，例如需考虑标签是置于蛋白的N端还是C端。在可行的情况下，应通过Western印迹或功能检测实验来验证已知蛋白相互作用伙伴的结合情况。若目标蛋白无法耐受与GFP标签的融合，则可采用其他标签或下拉策略进行SILAC下拉实验，例如使用其他标签（FLAG¹¹、Biotin¹²、STREP（本研究数据，未发表）），或利用针对目标蛋白的一抗进行免疫下拉，并结合siRNA敲低目标蛋白以提供对照样本¹³。此类实验在已有文献中有相关描述，简而言之，第1步以及第5.4–8步可按上述操作进行，而第2–5.3步则应根据所选表达/下拉系统的具体情况作相应调整，同时按照第2.4–2.5步所述确保各组蛋白上样量相等。由于定量分析阶段可在数据处理中排除非特异性结合蛋白，因此建议省略与对照磁珠的预孵育步骤或高盐洗涤步骤，以保留目标蛋白与低亲和力相互作用蛋白之间的结合。根据具体实验需求，本方案中可选择性地加入或省略核酸酶。例如：由于本方法中使用的蛋白为RNA解旋酶，因此在实验中加入了RNase混合物以消除由RNA介导的间接相互作用（步骤3.2）。但在某些情况下，同时开展有无核酸酶处理的平行实验可能有助于识别依赖核酸的蛋白相互作用。

在本实验方案中，建议在重复实验中交换“中等”和“重”标记的样品，以控制由SILAC培养基或细胞生长差异引入的变异。另一种对照策略是在重复实验中依次轮换所有三种（“轻”、“中等”和“重”）培养基。尽管该方法在理论上可能更为严格，但它会增加数据分析的复杂性，因为在至少一个重复实验中，目标蛋白将在“轻”标记的细胞中表达，因此有必要区分在“轻”样品中始终被检测到的蛋白（如角蛋白等环境污染物）与仅在与目标蛋白结合时才在“轻”样品中富集的蛋白。

尽管使用定量数据可通过设定阈值来区分特异性与非特异性相互作用，但不可避免地可能会排除一些真实的相互作用。上述方法是一种简单且快速识别蛋白质：蛋白质相互作用的策略，即使没有质谱分析经验或大规模蛋白质：蛋白质相互作用数据分析经验的研究人员也可轻松尝试。在大多数应用中，该方法已足以用于鉴定新的目标蛋白质。文献中还描述了对该方法的进一步改进，以帮助减少数据丢失，例如使用蛋白质频率文库，排除特定实验条件下（细胞系、微珠基质、缓冲液条件）已知的污染蛋白^10,14。然而，根据具体的实验参数，可能需要运行多个对照实验以生成微珠蛋白质组，这将增加实验的成本和复杂性。有关该技术的更多信息可从 www.peptracker.co.uk 网站获取¹⁴。

还应注意，上述方案涉及在免疫沉淀过程的末期混合带有不同标记的样品（称为纯化后混合——MAP SILAC 实验）。这是因为蛋白质与蛋白质之间的相互作用处于特定的平衡状态¹⁵。需要注意的是，其他研究团队已将本方案中描述的 MAP SILAC 方法与沉淀前样品的预孵育（混合后纯化——PAM SILAC）相结合，并采用了不同的孵育时间（文献中使用的时间范围为 20 分钟至 2 小时）^15,16。根据蛋白质比例趋近于 1:1 的速度，可定性地分析结合亲和力，并将相互作用的蛋白质划分为稳定型或动态型相互作用蛋白¹⁵。

综上所述，SILAC 沉淀是一种在生理相关条件下鉴定与特定目标蛋白相互作用蛋白的强有力方法。该技术可轻松适配多种不同的纯化策略，因而可应用于任意目标蛋白。结果的定量分析极大地简化了真实相互作用的鉴定，并允许放宽用于去除非特异性结合蛋白的严格缓冲液条件，从而保留低亲和力的相互作用。由于上述策略可同时比较多达三个样品，该技术在比较不同蛋白亚型、突变蛋白之间或药物抑制剂作用下的蛋白结合差异方面具有明显优势。由于分析的是整条凝胶切片而非考马斯亮蓝染色的单一条带，因此通常能够鉴定出比标准 GST/TAP 沉淀更多的高置信度蛋白，同时避免了实验者在选择目标蛋白时的主观偏差。因此，该技术在鉴定新型蛋白相互作用方面，相较于其他常用技术（如酵母双杂交、GST/His 或 TAP 沉淀）具有显著优势。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基  (DMEM)	邓迪细胞产品公司	LM010	不含精氨酸和赖氨酸的DMEM（含L-谷氨酰胺）
透析胎牛血清（10 kDa截留分子量）500 ml	邓迪细胞产品公司	DS1003
精氨酸（R0）25 g	西格玛-奥德里奇	A8094	将0.5 g溶于6 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到84 mg/ml的储存液）
精氨酸（R6）0.5 g	剑桥同位素实验室	CLM-2265	将0.5 g溶于6 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到84 mg/ml的储存液）
精氨酸（R10）0.5 g	剑桥同位素实验室	CNLM-539	将0.5 g溶于6 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到84 mg/ml的储存液）
赖氨酸（K0）25 g	西格玛-奥德里奇	L8662	将0.5 g溶于3.5 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到146 mg/ml的储存液）
赖氨酸（K4）0.5 g	剑桥同位素实验室	DLM-2640	将0.5 g溶于3.5 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到146 mg/ml的储存液）
赖氨酸（K8）0.5 g	剑桥同位素实验室	CNLM-291	将0.5 g溶于3.5 ml PBS中，过滤除菌后分装为0.5 ml等份并冷冻（得到146 mg/ml的储存液）
青霉素/链霉素溶液，100 ml	吉布科	15140-122
Lipofectamine 2000 转染试剂	英根	11668-027
GFP-trap 琼脂糖（500 μl 树脂）	Chromotek	gta-20
5x SDS 上样缓冲液	费舍尔科技	PN39000	建议使用市售而非自制的上样缓冲液，以尽量减少角蛋白污染。
蛋白酶抑制剂混合物III	Calbiochem	539134
1.7 ml 预润滑离心管	科斯特	3207
BCA 蛋白定量检测试剂盒（1 L）	派尔斯	23225
Tris（Trizma）	西格玛-奥德里奇	T1503
乙二胺四乙酸（EDTA）	西格玛-奥德里奇	E6758
氯化钠	西格玛-奥德里奇	S3014
RNase 混合酶	安比昂	AM2286
NP-40 替代物	密里博尔	492016