快速准确的呼出气氨浓度测定

摘要

氨是一种重要的生理代谢物，与多种疾病状态和健康状况相关。由于氨在呼出气体中的测定较为困难，因此需要采取特定的预防措施以获得准确的结果。目前并非所有影响氨的因素都已明确，但如果忽略这些因素，相关研究进展将举步维艰。

摘要

这种呼出气氨检测方法采用了一种快速且高灵敏度的光谱技术，称为石英增强型光声光谱法（QEPAS），该技术使用基于量子级联激光器的光源。监测仪与一个可测量口腔压力和二氧化碳的采样器相连接。整个系统采用温度控制，专门设计用于应对该化合物的反应特性。采样器可实时向受试者和技术人员反馈呼吸努力的质量。结合监测仪的快速响应时间，该系统能够准确测量代表深部肺脏系统水平的呼出气氨浓度。

由于该系统易于使用且能产生实时结果，因此能够开展实验以确定影响测量结果的因素。例如，漱口和口腔pH值会可重复且显著地影响结果，因此必须加以控制。温度和呼吸方式是另外两个例子。随着对这些因素的认识不断深入，误差得以减少，临床研究也变得更加有意义。该系统可靠性很高，且单次测量成本低廉。

该采样器相对便宜且便于携带，但监测仪却并非如此。这限制了一些临床研究的选择，也为未来的创新提供了依据。

引言

氨是蛋白质代谢普遍产生的副产物¹。因此，氨的检测有助于临床医生评估多种疾病状态和健康状况²。然而，由于氨具有高度反应性，通过血液或呼出气体准确测量氨浓度十分困难。尽管血液检测被广泛使用，但仍存在诸多缺陷，包括准确性方面的基本问题³。但血液检测最主要的问题在于其采样仅能间歇性进行。这一点至关重要，因为氨的生理变化与血糖及许多其他代谢过程一样，处于动态且持续变化之中⁴。相比之下，呼气检测完全无创且快速，能够轻松实现重复测量。因此，呼气氨检测具有重要吸引力，因其可能以独特的方式解决当前尚未满足的重大临床需求。

然而，呼气样本的采集存在一些独特的问题。静脉采血本身可能以多种不可预测的方式引入误差（例如，止血带使用时间、汗液污染、血细胞溶血、实验室检测延迟等⁵），而呼气检测研究人员则面临另一组全新的挑战：呼吸模式的变异性、口腔黏膜或细菌来源氨的污染、环境空气以及仪器湿度和温度的影响等⁶。事实上，在利用实验方法将实验设备与人体连接以探索未知生物学机制的过程中，低估这一任务的复杂性是不明智的。部分由于这些障碍的存在，呼气氨检测尚未充分发挥其应有的潜力。

本文介绍了我们用于快速、准确测量呼出气中氨气的实验方案。本方案在以下三个方面具有优势：监测设备、接口采样器以及对人为影响因素的关注。该监测设备由莱斯大学的同事此前所描述的方法构建而成⁷。其检测原理基于石英增强型光声光谱技术（QEPAS），该技术采用压电石英音叉作为声学换能器。当目标痕量气体分子吸收经过调制的激光辐射时，会产生光声效应并生成声波。通过一个在调制频率下具有声学共振特性的声学腔室来检测痕量气体。我们选择了一个氨气的吸收波长，该波长可避免呼出气体中其他干扰物质的光谱干扰。针对人体呼出气测量的应用，该监测设备的主要特点包括宽测量范围（从约50十亿分之一，ppb，到至少5,000 ppb）和高检测速度（1 秒 一次测量）。设备的高速性能使得在整个呼吸周期中均可实现良好的时间分辨率。

监测仪连接至一种专门设计的呼吸采样器。该采样器包含一个压力传感器和一个二氧化碳描记仪，能够实时显示并记录口腔压力、二氧化碳浓度以及传感器测定的氨浓度。因此，该采样器使技术人员能够在采集呼吸样本的同时评估呼吸努力的质量。这使得我们能够超越美国胸科学会/欧洲呼吸学会（ATS/ERS）任务组提出的关于呼出气一氧化氮（Fe_NO）分析的建议标准⁸。在所有呼吸采样过程中，呼吸采样器的口部接口均使用了一次性单向在线阀门。

由于监测仪的速度以及采样器提供的质量控制，我们能够仔细评估人为因素的影响⁹。例如，大多数受试者在被指示呼吸时最初会出现过度通气。随后，我们研究了其他重要影响因素，如口腔pH值、漱口情况、采样器、监测仪及所有相关管路的温度，以及呼吸方式，这些构成了下文示例实验的基础。

最后，或许也是最重要的一点，必须强调的是，多个经验丰富的研究团队正在使用完全不同的传感器和测量方法来检测呼出气中的氨。这些方法可能具有重要的优势和有效性。全面的比较超出了本研究的范围^10,11,12。

方案

1. 仪器准备

1. 打开氨气光学传感器平台、激光二极管控制器、自行搭建的控制电子单元（CEU）、呼气采样器、空气泵以及笔记本电脑的外部电源。
2. 检查氨气传感器的排气风扇和冷却风扇是否正常运行。注：一个风扇位于传感器后部，另一个位于传感器内部，易于接触。
3. 通过查看氨气传感器箱体侧面的数字显示屏，确认声学检测模块和针阀温度均达到 38.0 °C。从传感器通电开始，需等待约 35 分钟，使温度稳定。
4. 通过点击呼气采样器桌面上名为“ChangeT”的图标，将进样管路和咬嘴的温度设置为 55 °C。随后点击向上或向下箭头调整温度，再点击“Update Temp”确认更改。点击“Exit”返回桌面。系统至少需要 5 分钟使温度稳定。将采样器和管路温度维持在 55 °C 可最大程度减少氨气在表面的损失。
5. 在笔记本电脑上打开控制氨气传感器的软件。该程序位于桌面名为“NH₃ Breath Sensor Program”的文件夹内。进入该文件夹后，用户需选择图标“main labview software”。此文件夹包含多个应用程序，但必须选择“Mainsequence.vi”以进入所需界面。点击屏幕左上角的“run”按钮。注：这将启动波长锁定校准程序。QEPAS 监测仪的激光器在最佳电流下运行，该电流在自动波长锁定过程中被选定。此过程大约需要 25 分钟。
6. 在采样器上创建一个新会话，使每位受试者的会话数据保存为独立文件至连接的闪存盘中。注：此操作需打开采样器桌面上的“Breath Sampler”程序完成。程序中可输入适当的会话标识信息。会话期间生成的所有数据将根据该标识保存至闪存盘中。实验日期通常作为文件名的一部分。在进入呼气采样程序前，必须先调整进样管路和咬嘴的温度。
7. 将一个新的一次性咬嘴插入进样管中。操作时应佩戴一次性手套，避免手指上的氨污染咬嘴。

2. 呼吸样本采集

注意：任何涉及人类受试者的研究必须获得相关机构审查委员会（伦理委员会）的批准。多种因素可显著影响呼出气氨水平。这些因素可能通过直接影响全身氨水平，或影响呼出代谢物从肺部到检测仪器的传输过程，从而改变呼出气氨的测量结果。

1. 确保受试者在禁食状态下到达实验室，即到达前约 12 小时内未摄入任何食物，并且在测试前的早晨避免进行运动。
2. 确保受试者在数据采集前至少 1 小时内未向口腔内引入任何物质。要求受试者在测试前超过 1 小时刷牙。
3. 让受试者坐在氨传感器前方。指导受试者握住进气管，并确保其不要触碰吹嘴，以避免氨污染。
4. 在采样器界面上点击“开始”。让受试者尽可能长时间地向吹嘴中呼气，或直至操作者认为样本已足够为止。注：此为一次持续至少 10 秒的完整呼气。口内压力被实时测量，作为流速的替代指标。一个带颜色编码的压力计可帮助受试者产生并维持 10 cm 水柱的期望呼气压力，这对应于 50 ml/sec 的呼气流速。选择该流速是因为美国胸科学会（ATS）/欧洲呼吸学会（ERS）已将其用于 Fe_NO 测定的标准方案中。此呼气流速儿童和成人均可达到。同样，应获得三次可重复的呼气，其结果差异应小于 10%。
5. 当呼气样本采集完成后，在采样器界面上点击“停止”。

3. 呼吸样本测量

1. 完成呼气样本分析后，操作监测仪的实验室技术人员可对呼气曲线的任意区段进行分析。感兴趣的区段为III相，其特征是二氧化碳浓度呈现“平台期”，通常位于呼气过程的中后期。
2. 通过拖动采样界面的垂直线，选择III相区段：起始点为二氧化碳浓度达到平台时，终点为呼气压力下降前。具体示例见图1。
3. 点击采样器触摸屏界面上的“存储”按钮，将数据保存至闪存盘。
4. 呼气数据保存完成后，用户可点击“开始”以启动新的呼气样本采集。

4. 阐明漱口水和pH值对呼出氨气的影响

1. 采集 3 次呼气样本以建立基础氨水平。每次呼气之间应至少间隔 5 分钟。
2. 用 30 ml 水彻底漱口 60 秒。
3. 在漱口后 60 秒内采集一次呼气样本（第 2 节）。在接下来的一小时内持续采集呼气样本，以观察氨浓度随时间的变化。注意：样本采集频率可高达每分钟一次，但通常采用更长的时间间隔。
4. 用 30 ml 碱性溶液（碳酸氢钠水溶液）彻底漱口 60 秒，并重复步骤 4.2.1。
5. 用 30 ml 酸性溶液彻底漱口 60 秒，并重复步骤 4.2.1。

5. 说明进样管和传输管温度对呼出气氨浓度的影响

1. 在15分钟内采集三次呼吸样本，进样口温度设定为低于体温，约30 °C。
2. 通过呼吸采样器触摸屏界面上的桌面图标，将进样口和传输管路的温度分别升至55 °C。让系统至少稳定5分钟。
3. 在加热的进样口中，每隔5 分钟 采集一次呼吸样本，共采集3 次。

结果

受试者的呼出气氨水平基线值可能存在较大差异。健康个体每日晨起时的呼出气氨浓度可能为100–1,000 ppb。使用任何液体漱口会立即改变可检测到的呼出气氨含量。中性或酸性液体通常可使可观察到的氨浓度降低一半以上。随后，随着漱口效应逐渐消退，氨浓度会恢复至基线水平。水的效应通常在15分钟内消失，而酸性液体则可使可检测的呼出气氨维持在最低水平超过2小时。碱性漱口液（如碳酸氢钠）可使可检测的呼出气氨含量在20分钟内增加至原来的两到三倍，之后逐渐恢复至基线。值得注意的是，过氧化氢对呼出气氨的影响并不显著大于其他漱口液；因此，口腔细菌似乎对呼出气氨的检测结果贡献不大。

如上所述，与氨传感器相连的采样器可提供连续数据，技术人员可利用这些数据评估呼出气体样本的质量。口腔压力和二氧化碳是用于验证呼出气体样本有效性的两个关键特征。口腔压力可作为肺部进入采样器气流的替代指标。技术人员必须确保受试者向监测设备中提供了足够的肺泡气流，因为肺泡气中含有目标代谢物。技术人员应预期正常的口腔压力范围为9至10.5 cm H₂O。在10至20秒的呼气过程中，气流应保持相对稳定，这反映在口腔压力的标准差上。一次高质...

讨论

能够实时检测痕量代谢物的无创检测方法具有显而易见的优势。然而，呼气研究领域在实现这一潜力方面一直面临挑战。呼气测量是一种易受多种混杂因素影响的动态过程。我们的方法具有重要优势：具体而言，基于莱斯大学量子级联激光光声光谱（QEPAS）的氨气监测仪与呼气采样装置相结合，使我们能够评估并确定与准确测量密切相关的呼气采集影响因素。该方法非常可靠：例如，在一些初步实验之后，近期实验中收集的近500个独立呼气数据点均与预期结果一致⁹。

在尚未充分了解影响呼出气氨水平的各种因素之前，向受试者提供全面且统一的指导说明至关重要。目前，我们通常要求受试者在早晨样本采集前自午夜起禁食，在到达前超过1小时刷牙，并避免运动、吸烟或为汽车加注石油燃料。尽管我们已评估了数据采集前一晚的不同饮食方案（例如，高纤维与低纤维饮食），但尚未证实饮食会对测试当天早晨的基础值数据产生明确影响。早晨采集还有助于最大程度减少明显的昼夜节律变化所带来的影响，这种变化发生的原因目前尚不明确¹³。

对于呼出气中氨的采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水稻氨监测系统	N/A	N/A	无法商业购买
Loccioni 呼气采样器	Loccioni Humancare	N/A	单次呼气版本
一次性吹嘴	WestPrime Healthcare	G011-200	制造商为 AlcoQuant
笔记本电脑	Lenovo	N/A	旧型号，制造商已不再销售
酸性漱口液	N/A	N/A	家用酸性饮品（咖啡、软饮料、柑橘类果汁等）
碱性漱口液	N/A	N/A	水中加入不确定量的碳酸氢钠（Arm & Hammer 小苏打）
中性漱口液	N/A	N/A	水