通过单分子FRET研究DNA成环

摘要

本研究介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（FRET）技术测量双链DNA成环动力学的详细实验方法。该方案还描述了如何提取称为J因子的成环概率密度。

摘要

双链DNA（dsDNA）的弯曲与许多重要的生物学过程相关，例如DNA-蛋白质识别以及DNA在核小体中的包装。双链DNA弯曲的热力学特性可通过一种称为环化的方法进行研究，该方法依赖DNA连接酶将双链DNA的短黏性末端共价连接。然而，连接效率可能受到多种与双链DNA成环无关因素的影响，例如连接黏性末端周围的DNA结构，而连接酶本身也可能通过非特异性结合等机制影响表观成环速率。在此，我们展示了一种无需使用连接酶、通过荧光共振能量转移（FRET）检测瞬时DNA环形成来测量双链DNA成环动力学的方法。双链DNA分子通过一种简单的基于PCR的方案构建，包含FRET荧光对和生物素连接臂。通过成环速率以及两个未连接黏性末端之间的退火速率，可提取出被称为J因子的成环概率密度。通过测试两种具有不同内在曲率的双链DNA，我们证明J因子对双链DNA的内在形状具有敏感性。

引言

理解双链DNA的力学性质在基础科学和工程应用中具有重要意义。双链DNA的结构比简单的螺旋梯形更为复杂，因为相邻碱基对之间的滚动角、倾斜角和扭转角会随序列而变化。热涨落可导致双链DNA发生多种构象波动模式，如弯曲、扭转和拉伸。在极端条件下，还可能发生熔解和弯曲等转变过程。

在这些运动中，双链DNA（dsDNA）弯曲具有最显著的生物学影响¹。双链DNA的弯曲可通过将两个远距离位点拉近，参与基因的抑制或激活过程。它还在细胞核内或病毒衣壳中的DNA包装过程中发挥重要作用。双链DNA的弯曲形变可通过高分辨率显微镜技术（如原子力显微镜AFM²和透射电子显微镜TEM³）在实验上进行观察，其热力学和动力学特性则可通过环化实验进行研究，该方法通过化学连接双链DNA上相邻的位点来实现。

其中一种检测方法是依赖连接酶的环化反应⁴。在该实验中，具有“黏性”（互补）末端的双链DNA分子通过DNA连接酶作用发生环化或二聚化。通过比较环状化与二聚体形成的速率，可以获得DNA一端在另一端附近的有效摩尔浓度，这一参数称为J因子。J因子在量纲上等同于在短距离内找到DNA一端相对于另一端的概率密度，因此能够反映DNA的柔韧性。通过测量J因子随DNA长度的变化，可以揭示DNA力学特性的诸多特征，包括持续长度^4,5。

蠕虫状链（WLC）模型因其成功解释了DNA拉伸实验中获得的力-伸长曲线⁶，并准确预测了长度超过200 bp的双链DNA（dsDNA）的J因子⁷，而被广泛视为描述dsDNA力学性质的标准聚合物模型。然而，Cloutier和Widom在短至100 bp的dsDNA分子上使用环化实验测得的J因子，比WLC模型的预测值高出数个数量级⁸。一年后，Du et al. 通过使用较低浓度的连接酶进行环化实验，获得了与WLC模型一致的J因子，并将Widom课题组的异常结果归因于其所用连接酶浓度过高⁹。这一争议凸显了在使用传统环化实验时，DNA连接酶对环化动力学不可避免的影响⁹。此外，DNA连接酶还可能通过非特异性结合影响DNA的结构和刚性^10,11。

为了消除依赖蛋白质的成环实验中的技术难题，我们近期开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的无蛋白成环检测方法¹²。该方法通过在DNA分子黏性末端附近标记的供体和受体之间的FRET信号来检测DNA成环构象。采用物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM），可长时间记录固定于表面的单个DNA分子所发生的可逆成环与解环事件的动态轨迹。本方法采用基于PCR的DNA分子组装策略，生成无错配的DNA分子，相较于Vafabakhsh和Ha所建立的类似方法，是一项关键性改进¹³。该实验方案的单分子特性不仅可测量整体平均值，还可获得数据分布信息；而FRET检测的优势则允许对同一个DNA分子在不同条件下（甚至在可能抑制连接酶活性的条件下）重复测量DNA成环动力学过程。

TIRFM 装置如图1所示。一个定制设计的样品台放置在奥林巴斯IX61显微镜主体上方。532 nm和640 nm的激光从侧面引入，并通过微小的椭圆镜¹⁴反射进入高数值孔径（NA）物镜，以在盖玻片-水界面处实现临界入射角。需要注意的是，对于此FRET应用，也可采用更为常见的基于二向色镜或棱镜的透镜式TIR装置。显微镜形成的荧光图像通过一个二向色镜被分为供体和受体两部分图像，随后分别重成像到一个EMCCD的两个半区上。额外使用长通发射滤光片以降低背景信号。

温度控制对于获得可重复的动力学数据至关重要。为了实现温度控制，物镜与显微镜主体的镜筒分离，以尽量减少热量传递，同时来自温控循环水浴（制冷/加热装置）的水在黄铜环中循环流动，该黄铜环紧密贴合在物镜外壳内部的金属结构周围。该装置可在盖玻片表面实现15至50 °C之间的稳定温度控制（图2）。本研究中，样品温度维持在24 °C。

以下方案介绍了DNA构建、DNA构型估算、单分子实验以及J因子测定的逐步操作流程。

方案

1. 双链DNA样品制备

1. 通过重复一个10碱基序列设计全局弯曲的DNA。例如，5’-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCCX)₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3’ 是一条186 bp的弯曲DNA，其中X为随机插入的额外碱基，重复的10碱基序列两侧为接头序列。
   注意：在此示例中，选择了两个基于Kaplan 等¹⁵ 的大规模核小体占位研究中对核小体形成具有相反倾向性的10碱基序列。由于双链DNA的螺旋重复接近10 bp，该10碱基序列对螺旋轴的任何净偏转都将累积，形成类似圆弧的形状（图3A）。由于螺旋周期更接近10.5 bp，因此每两个重复后插入一个额外碱基，以尽可能保持弯曲结构的平面性。这些长度短于200 bp的序列可由提供基因合成服务的公司合成。在这些序列两端添加常用的接头序列，便于后续操作。该流程示意图见图3B。
2. 使用引物1（GTGCCAGCAACAGATAGC）和引物2（/5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注意：引物2在5'端标记有FRET供体Cy3。典型的PCR反应体系和循环程序见表1和表2。
3. 使用引物3（/5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC）和引物4（CAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注意：引物3在5'端通过骨架标记有FRET受体Cy5，并连接生物素-linker。PCR反应体系和循环程序同上。
4. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
5. 在链交换缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.0，1 mM EDTA）中混合Cy3标记产物和Cy5标记产物，终浓度分别为0.4 µM和0.1 µM。注意：过量的Cy3-DNA可提高通过链交换形成的、同时携带Cy3和Cy5的双链DNA的浓度。
6. 在98.5 °C孵育2分钟以实现链交换，随后以0.1 °C/秒的降温速率逐渐冷却至5 °C，并在5 °C孵育2小时。

2. 检测双链DNA弯曲的凝胶电泳

1. 通过将丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液以29.2:0.8的比例混合，配制成在pH 8.0的1X Tris/Borate/EDTA（TBE）缓冲液中浓度为5%（w/v）的聚丙烯酰胺凝胶^16,17。注意：10 ml凝胶溶液包含：1.217 ml 40%丙烯酰胺溶液、0.667 ml 2%双丙烯酰胺溶液、1 ml 10X TBE缓冲液、100 µL 10%过硫酸铵（APS）溶液、10 µL TEMED，其余用dH₂O补足。凝胶完全凝固约需30分钟。
2. 将DNA样品和DNA分子量标记物与1X上样缓冲液（含5%甘油、0.03%（w/v）溴酚蓝）混合后上样至聚丙烯酰胺凝胶中，在4 °C条件下以5–8 V/cm的电压电泳45分钟，或直至染料前沿接近凝胶末端。
3. 使用含有0.5 µg/ml溴化乙锭的1X TBE缓冲液对凝胶染色30分钟。在紫外光照射下观察DNA条带。通过与大小标记物（100 bp DNA ladder）比较条带位置，计算DNA分子的表观大小。注意：弯曲的DNA通常比直链DNA迁移更慢。

3. 流通池制备

1. 使用台式钻床和金刚石钻头在载玻片（3英寸 × 1英寸）相对的两条边缘上钻6-7对孔。钻孔后，在流动水中冲洗载玻片以去除可见的玻璃粉末。注意：这些孔用作灌流入口和出口。钻孔过程中需用水冷却载玻片，以防止破裂。
2. 将载玻片垂直放入玻璃瓶中，并加水浸没。超声处理15分钟，然后转移至另一个专用于丙酮清洗的玻璃瓶中。加入丙酮并超声处理15分钟。使用喷瓶依次用乙醇和水冲洗载玻片。将载玻片放入聚丙烯瓶中，加入5 M氢氧化钾溶液，并超声处理15分钟。最后，将载玻片在水中超声处理15分钟。使用相同方案清洗盖玻片（1号，24 × 40 mm）。注意：清洗后的载玻片和盖玻片可长期保存于dH₂O中备用。
3. 将1 mg生物素-聚乙二醇-硅烷（分子量3400）与80 mg甲氧基聚乙二醇-硅烷（分子量2000）溶于340 µL的0.1 M碳酸氢钠溶液中。充分混合后短暂离心，以去除气泡。注意：通过聚乙二醇（PEG）对表面进行功能化修饰有助于减少DNA在表面的非特异性结合。
4. 在每张载玻片上加入80 µL PEG溶液，并在其上方轻轻覆盖一张盖玻片。静置45分钟。用镊子将盖玻片与载玻片分离，用大量dH₂O冲洗，并在空气中自然干燥。
5. 在载玻片上横向粘贴双面胶条以形成通道。将盖玻片对齐覆盖其上，并用力按压使其与载玻片紧密结合，形成液体密封的通道。使用5分钟环氧树脂密封通道边缘。

4. Trolox 溶液的配制

1. 将约 30 mg Trolox 和 10 ml dH₂O 加入烧瓶中，使用磁力搅拌子在敞口条件下搅拌溶液 18 小时。
2. 使用 0.2 µm 滤膜过滤溶液，并通过加入约 6 µl 1 M Tris 碱液（pH 11）将 pH 调至 7。注意：Trolox 是一种抗荧光闪烁试剂，常用于单分子研究¹⁸。Trolox 的抗荧光衰减作用来源于其氧化产物，该产物存在于部分降解的 Trolox 溶液中¹⁹。应避免将 Trolox 快速溶解于甲醇或高 pH 的 Tris 溶液中，因为这会导致氧化效率低下。

5. 单分子成像

1. 向通道中注入 15 µl NeutrAvidin 溶液（0.5 mg/ml），孵育 2 分钟后用 100 µl T50 缓冲液（10 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，pH 7.0）冲洗。
2. 向通道中注入 50 µl DNA 样品（50–100 pM），孵育 5 分钟后用 100 µl T50 缓冲液冲洗未结合的 DNA。注意：DNA 分子将通过 NeutrAvidin-生物素相互作用特异性结合于表面。
3. 用含有氧清除系统的成像缓冲液²⁰（100 mM PCD，5 mM PCA，1 mM Trolox 和 500 mM NaCl）充满通道。
4. 将 EMCCD 设置为帧转移模式，以每秒 25 帧的速度将 2 × 2 二乘二分之二的图像（256 × 256）流式传输至计算机。
5. 在显微镜物镜上滴加浸油，使用样品夹将流动池固定在显微镜载物台上。通过观察墙上激光反射图案进行粗调焦，再利用显示器上的荧光图像实时视图进行精细调焦。
6. 开启 532 nm 激光开始数据采集。检查实时图像，必要时调整焦距。当大多数分子发生光漂白后停止数据采集。
   注意：本实验平台使用实验室自行编写的 C 程序来控制显微镜，并在数据保存至硬盘的同时于显示器上实时显示图像。

6. 图像处理与数据分析

注意：使用 MATLAB 代码处理 256 × 256 的图像时间序列，以生成 Cy3 和 Cy5 强度的单分子时间轨迹。为了在分视图图像的供体通道和受体通道之间配对像素，需手动选取 6 至 7 对 Cy3 和 Cy5 斑点，每对斑点来自同一分子且均匀分布在视场中，并利用这些斑点的坐标作为锚定点计算仿射变换。

1. 使用 MATLAB 脚本，检查所有在低 FRET 信号与高 FRET 信号之间发生多次转换的单分子时间轨迹。识别出成环状态和未成环状态。
   注意：FRET 信号定义为 Cy5 荧光强度（ I_a）除以 Cy3 与 Cy5 荧光强度之和（I_a + I_d）。成环状态具有较高的 FRET 值，而未成环状态具有较低的 FRET 值。由于可逆的成环与解环过程，单个分子的 FRET 信号直方图呈双峰分布。
2. 通过确定两个拟合高斯曲线之间的交点，找到区分这两种分布的阈值。
3. 根据公式 计算 FRET 效率，并将高 FRET 值分配给成环状态，低 FRET 值分配给未成环状态。
4. 使用 MATLAB 脚本，分析自数据采集开始后不同时间点已成环（或达到高 FRET 状态）的分子累积数量（N(t)）。注意：由于 dsDNA 分子在数据采集开始时可能处于未成环状态的任意构象，因此成环分子群体的增长速率反映了对初始构象平均后的平均成环速率。通过将 N(t) 拟合为指数函数来提取成环速率 k_loop： 若其增长呈双相特征，则可使用双指数函数拟合： 在此情况下，k_loop 由下式获得： 注意：理论上，聚合物在时间 t 时尚未成环的存活概率并非单一或双指数函数¹²。指数拟合仅作为一种实用手段，用于提取平均成环时间。

7. 确定J因子

注意：J 因子表示双链 DNA 的一端在另一端周围的局部浓度。可通过插值法确定产生与实测成环速率相同反应速率时，DNA 一端片段相对于另一端片段的浓度，从而得到 J 因子。实验中，将 DNA 的一端片段固定在表面，另一端片段以特定浓度 c 引入。如果测得两端之间的退火速率为 k_anneal，则 J 因子²¹ 由以下公式给出：。退火速率常数（k_anneal = k_anneal / C）与探针浓度无关。

1. 将 20 µl 的 30–50 pM 生物素-Cy5 寡核苷酸（引物 3）注入链霉亲和素（NeutrAvidin）包被的通道中。用 100 µl T50 缓冲液冲洗通道，以洗去未结合的寡核苷酸。
2. 按照第 5 部分所述配制成像缓冲液，并加入终浓度为 50 nM 的 Cy3 寡核苷酸（引物 2）。将该成像缓冲液注入通道中。
3. 保持 532 nm 激光开启，短暂开启 640 nm 激光以识别表面结合的 Cy5 寡核苷酸的位置。关闭 640 nm 激光，并开始监测 FRET 信号。
   注意：当 Cy3 寡核苷酸与表面结合的 Cy5 寡核苷酸发生杂交时，Cy5 荧光将通过 FRET 产生。
4. 使用 MATLAB 脚本，根据 Cy5 荧光强度随时间变化的曲线，分析从非结合状态（Cy5 荧光强度低）转变为退火状态（Cy5 荧光强度高）的分子数量随时间的变化。
5. 绘制退火分子数量随时间变化的曲线。用单指数函数（）拟合该曲线，以获得退火速率（k_anneal ）。
6. 在不同 Cy3 寡核苷酸浓度（60、100 和 180 nM）下重复该实验，以验证退火速率与反应物浓度之间的线性关系。从拟合曲线的斜率中提取二级退火速率常数（k_anneal ）。
7. 根据公式 计算 J 因子，其中 k_loop 是在相同缓冲条件下测得的成环速率。

结果

用于环化研究的DNA分子包含一段序列和长度可变的双链区域，以及彼此互补的单链突出端。这些突出端长度为7个碱基，能够相互退火以捕获环化状态。每个突出端均含有通过亚磷酰胺化学连接在DNA骨架上的Cy3或Cy5荧光染料。其中，含Cy5的突出端还连接有生物素-TEG（15个原子的四乙二醇间隔臂），用于表面固定（见图4A）。所有这些修饰均可通过基于PCR的实验方案引入双链DNA中（方案1及图3B）。所选用的突出端长度和序列在常规实验条件下可产生可检测且可逆的FRET信号。DNA环的形成与解离动力学对周围温度敏感，因此温度控制器对于实验的可重复性至关重要。此类控制器可方便地集成到显微镜系统中（图2）。

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），观察到表面固定的双链DNA分子上Cy3（供体）和Cy5（受体）信号呈现反相关波动（图4B）。在成环状态下，两个染料之间的距离小于5 nm，由于FRET效率较高，导致Cy5信号强而Cy3信号弱（图4A

讨论

基于FRET的一种简单单分子检测方法被用于研究不同内在构型DNA的成环动力学。通过将一个10个碱基的序列以与DNA螺旋周期（10.5 bp）同相的方式重复，可制备具有弯曲结构的DNA，并可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）估算其弯曲程度。这些双链DNA设计有黏性末端，以实现瞬时成环的稳定。我们通过随时间呈指数增长的成环分子数量提取出成环速率。通过未连接黏性末端片段之间的退火速率常数，可确定成环概率密度的浓度当量，即所谓的J因子。

在基于连接酶的DNA环化实验中，DNA闭合概率的测量对连接酶浓度敏感，若连接酶过量，则可能导致J因子被高估⁹。DNA连接酶与DNA的非特异性结合也可能影响成环过程¹⁰。此外，连接酶活性依赖于盐浓度且会随时间衰减。因此，在不利于连接酶活性的条件下研究DNA成环具有较大困难。相比之下，基于FRET的成环实验则不受上述任何因素的干扰。

我们的实验方案与Vafabakhsh和Ha¹³的方案相似，但在两个重要方面存在差异，值得讨论。Vafabak...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小型DNA片段提取试剂盒-100次	VWR	97060-558
丙烯酰胺 40% 溶液 500 ml	VWR	97064-522
2% (w/v) 双丙烯酰胺溶液 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder，100-1,000 bp	Fermentas	SM0241
微型垂直PAGE系统	VWR	89032-300
0.2 微米注射器滤器 μm CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	三重态猝灭剂
原儿茶酸（PCA）	Sigma-Aldrich	08992-50MG	氧清除系统
原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD）	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	氧清除系统
mPEG-硅烷，分子量 2,000，1 g	莱桑生物	MPEG-SIL-2000-1g
生物素-聚乙二醇-硅烷，分子量 3,400	莱桑生物	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
亲和素，中性亲和素生物素结合蛋白	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	F-540L
凝胶/PCR DNA片段提取试剂盒	IBI Scientific	IB47020
优质普通玻璃显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-1
VWR 微型矩形盖玻片，1 号	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S 循环式制冷加热器	Fisher Scientific		温度控制
目标冷却颈圈	Bioptechs	150303	温度控制
KMI53 生物显微测微尺载物台	Semprex	KMI53
高功率二极管泵浦固体激光器 532 nm 50 mW	Edmund optics	NT66-968	Cy3激发
CUBE 光纤尾纤式 640 nm，30 mW，光纤，FC/APC 接头	相干的	1139604	Cy5 激发
650 nm BrightLine 二向色分光镜	Semrock	FF650-Di01-25x36	分束二向色镜
LaserMUX 光束合束器，反射 514.5、532 &和543.5 nm激光器，25 mm	Semrock	LM01-552-25	组合二向色镜
Brightline 荧光滤光片 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3发射滤光片
635 nm EdgeBasic LWP 长通滤光片，25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 发射滤光片
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 倒置显微镜机身	Olympus
100倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49	Olympus
荧光显微镜用F型浸油	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm 直径 45° 铝镀膜棒状透镜	Edmund optics	54-092	微型镜
1/4" 单轴平移台（便携式）	Thorlabs	MS-1	微型镜面的翻译
Ø1" 消色差双合透镜，增透膜：400-700 nm，焦距=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	聚焦透镜
可调机械狭缝	Thorlabs	VA100
介质镜	Thorlabs	BB1-E02
Ø1" 消色差双合透镜，f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	中继透镜
镜头安装座 Ø1" 光学	Thorlabs	LMR1
二向色滤光片支架	Thorlabs	FFM1
固定笼立方体平台	Thorlabs	B3C
用于运动学安装的装置 Ø1" 光学	Thorlabs	KM100
N-BK7 平凸透镜 Ø1"，f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	准直透镜
N-BK7 平凸透镜 Ø6.0 mm，f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	望远镜镜头
N-BK7 平凸透镜 Ø6.0 mm，f = 150 mm	Thorlabs	LA1433-A	望远镜镜头