本研究介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（FRET）技术测量双链DNA成环动力学的详细实验方法。该方案还描述了如何提取称为J因子的成环概率密度。
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本文内容
摘要
摘要
双链DNA（dsDNA）的弯曲与许多重要的生物学过程相关，例如DNA-蛋白质识别以及DNA在核小体中的包装。双链DNA弯曲的热力学特性可通过一种称为环化的方法进行研究，该方法依赖DNA连接酶将双链DNA的短黏性末端共价连接。然而，连接效率可能受到多种与双链DNA成环无关因素的影响，例如连接黏性末端周围的DNA结构，而连接酶本身也可能通过非特异性结合等机制影响表观成环速率。在此，我们展示了一种无需使用连接酶、通过荧光共振能量转移（FRET）检测瞬时DNA环形成来测量双链DNA成环动力学的方法。双链DNA分子通过一种简单的基于PCR的方案构建，包含FRET荧光对和生物素连接臂。通过成环速率以及两个未连接黏性末端之间的退火速率，可提取出被称为J因子的成环概率密度。通过测试两种具有不同内在曲率的双链DNA，我们证明J因子对双链DNA的内在形状具有敏感性。
引言
理解双链DNA的力学性质在基础科学和工程应用中具有重要意义。双链DNA的结构比简单的螺旋梯形更为复杂，因为相邻碱基对之间的滚动角、倾斜角和扭转角会随序列而变化。热涨落可导致双链DNA发生多种构象波动模式，如弯曲、扭转和拉伸。在极端条件下，还可能发生熔解和弯曲等转变过程。
在这些运动中，双链DNA（dsDNA）弯曲具有最显著的生物学影响1。双链DNA的弯曲可通过将两个远距离位点拉近，参与基因的抑制或激活过程。它还在细胞核内或病毒衣壳中的DNA包装过程中发挥重要作用。双链DNA的弯曲形变可通过高分辨率显微镜技术（如原子力显微镜AFM2和透射电子显微镜TEM3）在实验上进行观察，其热力学和动力学特性则可通过环化实验进行研究，该方法通过化学连接双链DNA上相邻的位点来实现。
其中一种检测方法是依赖连接酶的环化反应4。在该实验中，具有“黏性”（互补）末端的双链DNA分子通过DNA连接酶作用发生环化或二聚化。通过比较环状化与二聚体形成的速率，可以获得DNA一端在另一端附近的有效摩尔浓度，这一参数称为J因子。J因子在量纲上等同于在短距离内找到DNA一端相对于另一端的概率密度，因此能够反映DNA的柔韧性。通过测量J因子随DNA长度的变化，可以揭示DNA力学特性的诸多特征，包括持续长度4,5。
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方案
1. 双链DNA样品制备
- 通过重复一个10碱基序列设计全局弯曲的DNA。例如，5’-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCCX)7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3’ 是一条186 bp的弯曲DNA，其中X为随机插入的额外碱基，重复的10碱基序列两侧为接头序列。
注意：在此示例中，选择了两个基于Kaplan 等15 的大规模核小体占位研究中对核小体形成具有相反倾向性的10碱基序列。由于双链DNA的螺旋重复接近10 bp，该10碱基序列对螺旋轴的任何净偏转都将累积，形成类似圆弧的形状（图3A）。由于螺旋周期更接近10.5 bp，因此每两个重复后插入一个额外碱基，以尽可能保持弯曲结构的平面性。这些长度短于200 bp的序列可由提供基因合成服务的公司合成。在这些序列两端添加常用的接头序列，便于后续操作。该流程示意图见图3B。 - 使用引物1（GTGCCAGCAACAGATAGC）和引物2（/5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）进行PCR。注意：引物2在5'端标记有FRET供体Cy3。典型的PCR反应体系和循环程序见表1和表2。
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结果
用于环化研究的DNA分子包含一段序列和长度可变的双链区域，以及彼此互补的单链突出端。这些突出端长度为7个碱基，能够相互退火以捕获环化状态。每个突出端均含有通过亚磷酰胺化学连接在DNA骨架上的Cy3或Cy5荧光染料。其中，含Cy5的突出端还连接有生物素-TEG（15个原子的四乙二醇间隔臂），用于表面固定（见图4A）。所有这些修饰均可通过基于PCR的实验方案引入双链DNA中（方案1及图3B）。所选用的突出端长度和序列在常规实验条件下可产生可检测且可逆的FRET信号。DNA环的形成与解离动力学对周围温度敏感，因此温度控制器对于实验的可重复性至关重要。此类控制器可方便地集成到显微镜系统中（图2）。
利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），观察到表面固定的双链DNA分子上Cy3（供体）和Cy5（受体）信号呈现反相关波动（图4B）。在成环状态下，两个染料之间的距离小于5 nm，由于FRET效率较高，导致Cy5信号强而Cy3信号弱（图4A
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讨论
基于FRET的一种简单单分子检测方法被用于研究不同内在构型DNA的成环动力学。通过将一个10个碱基的序列以与DNA螺旋周期（10.5 bp）同相的方式重复，可制备具有弯曲结构的DNA，并可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）估算其弯曲程度。这些双链DNA设计有黏性末端，以实现瞬时成环的稳定。我们通过随时间呈指数增长的成环分子数量提取出成环速率。通过未连接黏性末端片段之间的退火速率常数，可确定成环概率密度的浓度当量，即所谓的J因子。
在基于连接酶的DNA环化实验中，DNA闭合概率的测量对连接酶浓度敏感，若连接酶过量，则可能导致J因子被高估9。DNA连接酶与DNA的非特异性结合也可能影响成环过程10。此外，连接酶活性依赖于盐浓度且会随时间衰减。因此，在不利于连接酶活性的条件下研究DNA成环具有较大困难。相比之下，基于FRET的成环实验则不受上述任何因素的干扰。
我们的实验方案与Vafabakhsh和Ha13的方案相似，但在两个重要方面存在差异，值得讨论。Vafabak.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 James Waters、Gable Wadsworth 和 Bo Broadwater 对稿件的审阅。我们还要感谢四位匿名审稿人提供的有益意见。本研究得到了佐治亚理工学院、伯克利韦尔科姆基金会科学交叉领域职业奖以及美国国家科学基金会生命系统物理学学生研究网络项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小型DNA片段提取试剂盒-100次 | VWR | 97060-558 | |
| 丙烯酰胺 40% 溶液 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| 2% (w/v) 双丙烯酰胺溶液 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder，100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| 微型垂直PAGE系统 | VWR | 89032-300 | |
| 0.2 微米注射器滤器 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | 三重态猝灭剂 |
| 原儿茶酸（PCA） | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | 氧清除系统 |
| 原儿茶酸3,4-双加氧酶（PCD） | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | 氧清除系统 |
| mPEG-硅烷，分子量 2,000，1 g | 莱桑生物 | MPEG-SIL-2000-1g | |
| 生物素-聚乙二醇-硅烷，分子量 3,400 | 莱桑生物 | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| 亲和素，中性亲和素生物素结合蛋白 | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | F-540L | |
| 凝胶/PCR DNA片段提取试剂盒 | IBI Scientific | IB47020 | |
| 优质普通玻璃显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR 微型矩形盖玻片，1 号 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S 循环式制冷加热器 | Fisher Scientific | 温度控制 | |
| 目标冷却颈圈 | Bioptechs | 150303 | 温度控制 |
| KMI53 生物显微测微尺载物台 | Semprex | KMI53 | |
| 高功率二极管泵浦固体激光器 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3激发 |
| CUBE 光纤尾纤式 640 nm，30 mW，光纤，FC/APC 接头 | 相干的 | 1139604 | Cy5 激发 |
| 650 nm BrightLine 二向色分光镜 | Semrock | FF650-Di01-25x36 | 分束二向色镜 |
| LaserMUX 光束合束器，反射 514.5、532 &和543.5 nm激光器，25 mm | Semrock | LM01-552-25 | 组合二向色镜 |
| Brightline 荧光滤光片 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3发射滤光片 |
| 635 nm EdgeBasic LWP 长通滤光片，25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 发射滤光片 |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 倒置显微镜机身 | Olympus | ||
| 100倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49 | Olympus | ||
| 荧光显微镜用F型浸油 | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm 直径 45° 铝镀膜棒状透镜 | Edmund optics | 54-092 | 微型镜 |
| 1/4" 单轴平移台（便携式） | Thorlabs | MS-1 | 微型镜面的翻译 |
| Ø1" 消色差双合透镜，增透膜：400-700 nm，焦距=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | 聚焦透镜 |
| 可调机械狭缝 | Thorlabs | VA100 | |
| 介质镜 | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" 消色差双合透镜，f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | 中继透镜 |
| 镜头安装座 Ø1" 光学 | Thorlabs | LMR1 | |
| 二向色滤光片支架 | Thorlabs | FFM1 | |
| 固定笼立方体平台 | Thorlabs | B3C | |
| 用于运动学安装的装置 Ø1" 光学 | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 平凸透镜 Ø1"，f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | 准直透镜 |
| N-BK7 平凸透镜 Ø6.0 mm，f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | 望远镜镜头 |
| N-BK7 平凸透镜 Ø6.0 mm，f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | 望远镜镜头 |
参考文献
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales prob....
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重印与许可
