多步制备技术以回收多种代谢物化合物类别用于深入且信息丰富的代谢组学分析

摘要

代谢组学实验结果的可靠性取决于样品制备的有效性和可重复性。本文描述了一种严格且深入的方法，能够从生物液体中提取代谢物，并可选择性地对多达数千种化合物或仅特定感兴趣的化合物类别进行后续分析。

摘要

代谢组学是一个新兴领域，能够对来自生物体的样本进行图谱分析，从而深入了解生物过程。代谢组学的一个关键环节是样本制备，不一致的制备技术会导致结果不可靠。本技术包括蛋白质沉淀、液-液萃取和固相萃取，可将代谢物分馏为四个不同类别。 该方法可提高低丰度分子的富集效果，从而增强检测灵敏度，最终实现对分子更可靠的鉴定。该技术已应用于血浆、支气管肺泡灌洗液和脑脊液样本，最低样本体积可低至50 µl。 样本可用于多种下游应用；例如，蛋白质沉淀所得的沉淀物可保存以供后续分析。该步骤的上清液通过水和强有机溶剂进行液-液萃取，以分离亲水性和疏水性化合物。分馏后，亲水层可保留用于后续分析，或在不需要时弃去。疏水性组分随后在三个固相萃取步骤中依次用一系列溶剂处理，进一步分离为脂肪酸、中性脂质和磷脂。这使得实验人员可根据分析需求灵活选择目标化合物类别。此外，由于已知化合物的化学类别信息，该方法也有助于实现更可靠的代谢物鉴定。

引言

生物反应会产生代谢物，作为细胞过程的终产物。代谢组学是指这些过程所产生的所有化合物在生物体内的集合。它能够反映细胞的生理状态，并体现生物体对外部或内部刺激的响应^1,2。这些刺激可能来自环境、毒理、药理、饮食、激素，或与疾病相关。目前研究人员正在开展并已开展了大量代谢组学应用研究，包括生物标志物发现³、营养学研究⁴、食品科学⁵以及药物测试⁶。无论何种应用，数据的变异性、污染以及假阳性的存在都应被降低，最好完全消除。在生物标志物发现中，或在确定对照组与疾病组之间的差异时，或在研究药物对受试对象的影响时，应根据所提出的问题及待研究的代谢物类型选择合适的生物液体⁷。例如，若研究吸入性药物对哮喘患者肺部的即时效应，则优先选择在给药前后分析支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中的代谢物。为确保所观察到的 差异源于真实的生物学变异，而非不恰当的样品制备技术，标准化且一致的实验操作流程至关重要⁸。必须仔细记录样品信息，以确保诸如生物液体类型、动物品系、采样时间、受试对象年龄、性别等因素均被充分考虑并纳入研究设计中⁹。此外，为降低污染或假阳性的可能性，建议对溶剂空白和仪器空白进行分析¹⁰。

在本方案中，“代谢物”一词用于指代实际鉴定出的化合物。首先使用厂商提供的软件，通过初始峰检测算法识别质谱峰。这些峰根据质荷比（m/z）和保留时间进行对齐。随后采用第二种算法将多个特征合并为单一化合物，其中包括正离子模式下的钠、钾或铵加合物，以及负离子模式下的氯加合物。软件中的其他可选功能还包括二聚体及其他加合物的识别。以葡萄糖为例，在第一种算法下会检测到三个对应于同一化合物的峰，其m/z值分别为181.0707（M+H）、198.0972（M+NH₄）和203.05261（M+Na）。然而，当应用基于分子式的第二种算法时，这三个加合物将被归为一组，最终合并为一个化合物。

由于样品中存在大量化合物，代谢物可能在样品中引起干扰。单个样品中数千种代谢物的存在会导致信号抑制，尤其是对低丰度代谢物的抑制。通过样品净化去除干扰性蛋白质，并进一步将样品分离为多个组分，可降低样品复杂性，从而改善峰分离效果，提高分辨率，并减少代谢物共洗脱现象。因此，必须进行样品净化并改进化合物的分离效果。已有研究表明，仅采用蛋白质沉淀方法，即使使用不同极性的溶剂，也无法有效解决这一问题^11,12。然而，通过结合强有机溶剂（如甲基叔丁基醚，MTBE）与后续的分级分离步骤，可提高代谢物的覆盖范围。Yang et al.¹² 报道，单独使用甲醇或甲醇-乙醇沉淀时分别检测到1,851或2,073种代谢物，而采用MTBE溶剂萃取联合固相萃取（SPE）步骤后，检测到的代谢物数量增加至3,806种。该方法可显著减少代谢物重叠，改善峰分离，并提高代谢物丰度。

来自非代谢物（如聚合物）的污染可能源于样品采集过程、溶剂或仪器噪声，并可能导致潜在重要代谢物的信号抑制。建议技术人员以及在样品制备前负责采集样品的人员，在样品采集和制备过程中始终使用相同品牌、类型和规格的样品收集管、移液器吸头及其他所用管材。这可使数据分析人员充分确信所观察到的变化是真实存在的，而非来自其他来源的背景差异。随后，对治疗效果、疾病组与对照组之间的差异，或其他任何代谢分析的研究均可在更高置信度下进行。

本文讨论的方法侧重于联合样品制备技术^13-15，可用于血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）或脑脊液（CSF）样品的非靶向代谢组学分析，适用于基于液相色谱-质谱法（LCMS）的检测。在本操作之后，可将液相色谱（LC）和超高效液相色谱（UPLC）分离技术与质谱（MS）联用。许多开展代谢组学研究的研究人员通常采用蛋白质沉淀法和/或液-液萃取法^16,17。在我们的研究中，这些方法导致检测到的代谢物数量较少。而本文所述方法¹²能够检测并鉴定出更多的代谢物，覆盖更广泛的代谢物谱。这种提升源于样品纯度更高，以及因预先分离代谢物类别而减少的基质效应。

首先使用冷甲醇（MeOH）进行初始蛋白质沉淀步骤，以去除样品中的蛋白质。采用甲基叔丁基醚（MTBE）和水进行液-液萃取（LLE），分离亲水性和疏水性化合物。随后对疏水层进行固相萃取（SPE），将疏水性化合物进一步分为三类——脂肪酸、中性脂质和磷脂。疏水性组分重新溶解于100%甲醇中，而亲水性组分则重新溶解于含5%乙腈的水溶液中。固相萃取（SPE）步骤通过减少共洗脱化合物的数量，提高了分析结果的可靠性，若不进行该分离步骤，这些共洗脱化合物将会存在。

方案

1. 初始注意事项， 仪器与标准品的准备

1. 储存或转移脂质和有机溶剂时，务必使用玻璃器皿（如玻璃培养管、玻璃自动进样瓶）或玻璃移液管。
2. 尽量减少所有脂质样品和标准品与空气的接触。使用聚四氟乙烯（PFTE）盖子时应紧密密封，以避免暴露于空气和溶剂挥发。脂质干燥后应立即用下一溶剂重新溶解，或置于持续的氮气流中保存。
3. 使用 100 µl 样品。若样品量多于或少于该体积，可相应调整体积；但在NH₂固相萃取柱进行脂质分馏时，所规定的体积必须保持不变。
4. 在开始样品制备前，提前开启离心机并预冷至 0 °C。
5. 本技术涉及多种易挥发溶剂，因此在样品制备过程中应始终保持所有溶剂瓶加盖。
6. 根据建议，每类需准备两种标准品。
7. 准备一种阴性对照，其中包含浓度恒定的多种添加标准品。该阴性对照需加入所有样品中，同时加入一个混合样品中，该混合样品作为批次质量控制（即添加标准品的混合样品，用于监测不同日期间样品制备的重复性）以及仪器质量控制（即先前制备、分装保存的添加标准品混合样品，用于监测分析过程中及不同日期间的仪器状态和波动情况）。
   1. 制备浓度分别为1倍、2倍和4倍标准添加量的阳性对照。阳性对照需加入所有样品及一个混合血浆样品中，作为样品制备和仪器分析步骤的质量控制化合物，用于在数据分析中评估和识别倍数变化差异，以确保样品制备和仪器分析各环节均正确执行。
8. 标准品应储存于 -20 °C，样品应储存于 -80 °C。某些易因长期储存而降解的内标物应保存于 -80 °C。
9. 本实验需使用具有危险性、易燃或易挥发的溶剂（如MTBE），所有操作均应在通风橱中进行。

2. 内标物

1. 根据具体项目和实验设计选择内标物（ISTD）。对于血浆、支气管肺泡灌洗液（BALF）或尿液等生物流体，应优先选用与样品中天然存在的物质性质相似的同位素标记内标物，例如氨基酸、激素或脂质，但不限于这些类别。对于植物代谢组学样品，可使用黄酮类化合物或类胡萝卜素等标记标准品。其他代谢组学研究同样适用此原则，研究者应选择能够代表待分析样品类型的内标物。
2. 确保所选内标物覆盖色谱图的较宽范围；例如，若采集时间为 20 分钟，则每 5 分钟洗脱一次的标准品 可被使用。
3. 制备2 mg/ml的亲水性储备溶液 使用多种同位素标记的标准品和/或其他对被分析样品而言为外源性的极性化合物。从每种储备液中，用甲醇:水（1:1）配制包含所有标准品的混合溶液，终浓度为 25 µg/ml 肌酐-D₃，100 µg/ml 赖氨酸-D₄，以及 200 µg/ml 缬氨酸-D₈.
4. 使用多种同位素标记的标准品和/或对被分析样品而言为外源性的其他非极性化合物制备疏水性储备溶液；17:0 脂肪酸（4 mg/ml）、19:1 脂肪酸（4 mg/ml）、17:0 神经酰胺（2 mg/ml）、17:0 磷脂酰乙醇胺（1.75 mg/ml）、15:0 磷脂酰胆碱（2 mg/ml）和睾酮-D₂ （1 mg/ml）。从每种储备液中，用氯仿:甲醇（1:1）配制一种包含所有标准品的溶液，终浓度为 50 µg/ml 17:0 神经酰胺，100 µg/ml 15:0 PC，100 µg/ml 睾酮-D₂，200 µg/ml 17:0 脂肪酸，200 µg/ml 19:1 脂肪酸和 200 µg/ml 标准混合物中的17:0 PE。
5. 提前使用每种标准品的至少五种不同浓度测试其电离程度，以确定仪器对这些化合物的检出限和线性范围。各标准品储备液的浓度将根据实验设计而有所不同，混合加标标准品中每种标准品的浓度范围可为 20 μg/ml 至 2 mg/ml 取决于它们的电离程度。
6. 加入阳性对照的混合内标物，将其以1倍、2倍或4倍浓度水平添加至样品中，以定量监测样品前处理的效率及仪器数据的准确性。阳性对照的终浓度可为：2 mg/ml D-葡萄糖，100 µg/ml 丙氨酸-D₃，200 µg/ml 甲基丙二酸-D₃，20 µg/ml 甘油三酯-D₅，和/或其它疏水性和亲水性标准品。根据所用质谱和高效液相色谱分析仪器的灵敏度调整标准品浓度。

3. 蛋白质沉淀

1. 将样品在室温下解冻 ，并按以下所述向每个样品中加入 10 µl 内标溶液（ISTD）。
2. 向每个样品中加入 10 µl 亲水性和疏水性标准溶液（由步骤 2.3 和 2.4 中配制的储备液制备）。根据所用质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）仪器的灵敏度，必要时调整标准品浓度。
   1. 向每个样品中加入 10 µl 1×、2× 或 4× 的阳性对照溶液（由步骤 2.6 中的储备液制备）。根据所用质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）仪器的灵敏度，必要时调整标准品浓度。
   2. 在进行蛋白沉淀步骤前，将每个样品涡旋振荡 10 秒 。
3. 向每个样品中加入 400 µl 冰甲醇（储存于 -20 °C）。
4. 每管涡旋振荡 10 秒 。
5. 在 0 °C 条件下，以 18,000 × g 离心 15 分钟。
6. 将全部上清液转移至新的玻璃培养管中，然后在氮气（N₂）下吹干。
7. 若需分析蛋白沉淀组分，请继续进行步骤 3.8–3.11；若不分析蛋白沉淀，则跳至第 4 节。
   注意：蛋白沉淀中可能含有高疏水性化合物，这在进行药物研究¹⁸、涉及疏水性黄酮类化合物的食品分析¹⁹，或与高度疏水性化合物蓄积相关的疾病代谢组学研究（如神经元蜡样脂褐质沉积症²⁰和溶酶体脂质贮积病²¹）中具有重要意义。
8. 向白色（或类白色）蛋白沉淀中加入 1 ml 甲基叔丁基醚（MTBE），每管涡旋振荡 30 秒 ，然后在 0 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟。将 MTBE 层倾入新的玻璃培养管中。
   此步骤至关重要，操作误差将显著影响实验结果（参见代表性结果中的图 5）。
   1. 对所有样品应始终吸取相同体积的 MTBE，因为不同样品的沉淀量存在差异。因此，若某一样品上清液体积最少，仅能倾出 900 µl ，则所有样品均应仅倾出 900 µl 。
9. 重复步骤 3.9，并将有机层合并至步骤 3.7 中准备的同一玻璃培养管中。
10. 用氮气（N₂）吹干样品，然后重悬于 200 µl 氯仿:甲醇（1:1）溶液中，短暂涡旋混匀。
11. 转移至离心管中，在 0 °C 条件下以 18,000 × g 离心 15 分钟，随后使用玻璃移液管将上清液转移至自动进样器螺口小瓶中。

4. 液-液萃取

1. 使用玻璃移液管加入 3 ml 将MTBE加入第3节第6步所得的干燥甲醇残留物中，涡旋30秒， 加入 750 µl 加水，然后涡旋震荡10秒 每管
2. 在室温下，以约200 × g离心10分钟。
3. 吸出 2.5 ml 将MTBE层（避免混入水）转移至洁净的玻璃培养管中。
   注意：此步骤至关重要，此处的差异将影响实验结果。2.5 ml 应小心地从上层倾倒出MTBE，以便在不吸取下方水层的情况下倾倒出固定体积的MTBE。如果实验开始时样品体积少于指定的100 μl 对于该方法，应按比例调整甲基叔丁基醚（MTBE）的体积，以反映起始样品体积的变化。
4. 加入 3 ml 向样品的剩余水相中加入MTBE，涡旋10秒 每管
5. 在室温下以约200 × g离心10分钟。
6. 吸出 3 ml 加入MTBE（避免混入水），并与MTBE管混合。
7. 将剩余的水相通过氮气下干燥浓缩₂.
8. 将残留物重悬于 100 µl 中 水。
9. 加入 400 µl 加入冰甲醇至玻璃培养管中，短暂涡旋，然后转移至微量离心管。
10. 在 -80 °C 下放置 20-30 分钟。在 0 °C 下以 18,000 x g 离心 15 分钟。
    注意：建议将整个样品架放入 -80 °C 冰箱中，以便甲醇中残留的蛋白质充分沉淀。若无 -80 °C 冰箱，也可选择在 -20 °C 保存、置于干冰上或放置于冰桶中。重要的是，样品必须始终保存在低温环境中，并保持温度一致，以促进沉淀的形成。
11. 吸出 450 µl 取上清液并转移至洁净的微量离心管中。在真空离心浓缩仪中彻底干燥，温度不超过45 °C（约需1–2小时）。
12. 将干燥的上清液重悬于 200 µl 中 含5%乙腈/水。短暂涡旋。在-80 °C下冷冻。

5. 固相萃取

1. 在35 °C下用大量氮气流吹干MTBE相（约需10–15分钟）。
2. 当完全干燥后，停止氮气流，并迅速用1 ml溶剂重悬 氯仿（CHCl₃用玻璃移液管吹打混匀。短暂涡旋。
   注意：CHCl₃ 等溶剂₃ 粘度较低。移液时，低表面张力会导致溶剂从移液器中损失。建议至少预润洗移液器吸头两次，以使被移取的溶剂与移液器内部空间达到平衡。如有条件，也可使用气密性注射器。
3. 设置 搭建SPE真空装置并连接NH₂ 用于组分分离的固相萃取柱
4. 将样品升温至室温，并始终在持续的氮气流下保持悬浮状态₂升温至室温可使脂质重新悬浮，氮气可防止脂质氧化和聚合。
5. 洗涤并活化固相萃取柱2次 400 µl 正己烷。弃去废液，并更换为新的玻璃收集管。
6. 将样品加入固相萃取柱中，用玻璃试管收集流出液。
7. 用玻璃移液管加入 1 ml 2:1 的 CHCl₃：IPA，收集流穿液至同一玻璃管中（此为中性组分）。
8. 在氮气下干燥中性组分₂ 以尽量减少氧化（约需10-15分钟）。
9. 用玻璃移液管加入1 ml 用5%乙酸的乙醚溶液处理，收集流出液至新的玻璃管中（此为脂肪酸组分）。
10. 在氮气下干燥脂肪酸组分₂ 以尽量减少氧化（约需10-15分钟）。
11. 使用塑料吸头加入 800 µl 将甲醇加入固相萃取小柱，收集流出液于15 ml塑料锥形管中（此为磷脂组分）。
12. 将磷脂组分转移至1.5 ml 离心管。在45 °C下使用真空离心浓缩仪干燥样品（约需1-1.5小时）。
13. 将三个组分中的每个样品分别重悬于 200 µl 中 加入100%甲醇，涡旋混匀，转移至带螺口盖的自动进样瓶中储存。

6. 样品储存条件

1. 所有样品在准备进行仪器分析前均应保存在 -80 °C 条件下。
   注意：用有机溶剂重新溶解的提取样品可保存在 -20 °C，但不推荐此方法，因为目标代谢物在此温度下可能发生降解。液氮保存也不推荐，已有研究者报告存在污染问题，需要使用特殊储存小瓶，且储存腔内温度不均，导致温度波动较大。
2. 若样品体积较小（<100 µl），应在样品瓶中使用内插管，以防止储存过程中顶空内的溶剂挥发。
3. 避免样品反复冻融。样品仅在仪器分析前 thaw 一次即可。反复冻融会导致样品降解。

7. 液相色谱条件

1. 使用 C-18 2.1 mm × 50 mm（1.8 μm）分析柱和 C-18 2.1 mm × 12.5 mm（5 μm）保护柱分析疏水性组分。
2. 设置自动进样器温度为 4 °C，柱温为 60 °C，进样体积为 2 µl ，流速为 0.25 ml/min。
3. 流动相 A 使用含 0.1% 甲酸的水溶液，流动相 B 使用含 0.1% 甲酸的异丙醇:乙腈:水（60:36:4）溶液。
4. 运行以下梯度洗脱程序：从 0 到 1 分钟，B 相从 30% 升至 70%；从 1 到 15 分钟，升至 100% B 并保持 5 分钟；随后用 10% B 相冲洗 5 分钟，再运行 5 分钟后处理程序。
5. 使用 HILIC 2.1 mm × 50 mm（2.6 μm）分析柱配合保护柱分析亲水性组分。
6. 设置自动进样器温度为 4 °C，柱温为 20 °C，进样体积为 2 µl ，流速为 0.5 ml/min。
7. 流动相 A 使用含 50% 乙腈的 10 mM 乙酸铵溶液（pH 5.8），流动相 B 使用含 90% 乙腈的 10 mM 乙酸铵溶液（pH 5.8）。
8. 运行以下梯度洗脱程序：从 0 到 2 分钟，保持 100% B；从 2 到 15 分钟，B 相降至 50%；随后用 0% B 相冲洗 5 分钟，再运行 10 分钟后处理程序。

结果

整个样品制备技术均按上述方法进行，以下列出其中最重要和/或最相关的方面。将亲水性和疏水性内标物加入合并的血浆样品中，以利用不同提取方法对内标物与内源性代谢物丰度进行直接比较。采用定性和定量软件分析液相色谱-质谱（LC-MS）数据，结果表明内源性化合物和内标物均实现了良好的回收率和分离效果。图1展示了甲基叔丁基醚-固相萃取（MTBE-SPE）方法在提取脂质标准品（A）和内源性化合物（B）方面的有效性。

总体而言，在LC-MS分析后使用定性和定量软件比较特征数量时，与甲醇提取或仅使用MTBE提取等其他方法相比，该方法获得了更优的代谢物提取效率和覆盖度。例如，仅使用甲醇提取时，肌酐-D₃的变异系数为15.2%；而采用MTBE液液萃取（LLE）后，其变异系数降低至1.04%。使用MTBE时，脂质和水溶性化合物的重现性分别优于<8%和<5%，相比之下，简单的甲醇提取对脂质和水溶性化合物的变异分别高达29%和15%。用于监测脂质回收率的内标物——睾酮-D₂、C17神经酰胺、15:0磷脂酰胆碱（PC）和17:0磷脂酰乙醇胺（PE）——与单独使用甲醇相比，其信号强度分别提高了26%、200%、100%和400%。脂肪酸内标物以及内源性磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺代谢物也观察到类似的提升。其他内源性代谢物，如鞘氨醇、神经酰胺、二酰基甘油、三酰基甘油、胆固醇和鞘磷脂，在仅使用甲醇提取时未被检出，或仅在可忽略的水平上被检测到；而这些内源性脂质在使用MTBE提取时则可被轻松检出。

在比较标准方案的分析中，获得以下结果：仅使用甲醇沉淀可得到1,851种代谢物，甲醇-乙醇沉淀得到2,073种代谢物，使用MTBE进行液液萃取得到3,125种代谢物，而结合液液萃取与固相萃取的MTBE方法则回收了3,806种代谢物。因此，该方法能够提取出更多的代谢物，这很可能归因于LC-MS前样品更洁净，离子抑制效应降低所致。

图2展示了将疏水性代谢物按其相应的化学类别分离的高效性，从而提高了代谢物鉴定的可信度。经固相萃取（SPE）后，三个脂质组分中鉴定出的化合物重叠极少。此外，图3显示了内标物的回收情况，表明内标物（ISTD）被洗脱至与其化学类别相对应的组分中。

质控样本用于评估样本制备的质量，判断在对大量样本进行多日分析时是否存在批次效应，并监测仪器的重复性。通过检查色谱图，确保添加的标准品回收率高于90%，质荷比误差小于±3 ppm，保留时间波动范围小于±5%。若未达到上述标准，则舍弃结果并重新分析样本。当出现保留时间偏移的批次效应时，数据分析软件可对此进行校正。此前已制备的一批混合血浆样本经过了样本前处理，其组分被分装至自动进样瓶中，并于-80 °C保存，用于在每次样本分析过程中监控仪器状态。表1展示了这些添加标准品的检测结果。脂肪酸负离子化模式组分（表中未显示数据）未用于后续分析，因其质控样本中添加标准品的相对标准偏差（% CV）超过10%。因此，该组分的数据被舍弃，同时对仪器进行了检查与维护。表2展示了在三个不同日期进行样本制备并进行三针仪器进样后，样本中内源性代谢物的检测结果。样本制备质控样本中的内源性代谢物均表现出良好的重复性，表明样本制备方法稳定，且仪器进样具有良好的重复性。

然而，如果未正确遵循样品制备步骤，则会得到不可靠且不一致的结果。图4展示了未按所述步骤进行蛋白质沉淀时的结果。三名操作人员A、B和C对混合血浆样品进行了相同的样品制备操作。操作人员A未按照实验方案要求移取规定体积的上清液，而是在两次洗涤过程中均移取了>1 ml的液体，并混入了部分沉淀物。这不仅导致该组分的假阳性结果数量增加，还加大了数据的变异性。

数据的色谱重现性如图7所示。按照本方案所述，分别在不同三天内采用蛋白质沉淀法、液液萃取法和固相萃取法对混合血浆样本进行三份平行制备。每种组分均采用方案第7节所述的色谱分离条件进行分析。随后将样品在液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）上进行三针进样，以评估仪器和样品制备的重现性。一致的重叠峰表明，即使在三天内分别制备样品，样品前处理方法具有良好的重现性，同时色谱方法也能获得可重复的结果。在脂肪酸组分的负离子化模式中观察到化学噪声增加，这可能是由于液相色谱-质谱系统中溶剂存在污染物所致，可能导致代谢组学定量结果不一致。因此，仅对在9分钟前洗脱的代谢物进行了分析。

在运行较长的样本列表时，仪器灵敏度可能会随时间下降，缓冲液浓度也可能发生变化，从而导致信号强度降低和保留时间偏移。如果保留时间重叠变化小于5%，且信号强度变化小于10%，数据仍在标准实验室允许范围内。可使用分析软件对数据进行校正，以校准仪器漂移和保留时间漂移。然而，如果变化较大，则必须查明原因。在问题解决后，可对样品重新进行分析。

图1. 提取后经反相色谱（RPC）分离的脂质内标物（A）和内源性代谢物（B）的丰度¹²。提取后，样品采用反相色谱分离，并通过液相色谱-质谱法（LC-MS）在正离子和负离子模式下进行分析。本图经Yang et al，《色谱A杂志》1300卷，217–226页（2013年）修改而来。

图 2. MTBE-SPE 各组分的比较¹²。通过比较各组分中鉴定到的代谢物，以确定SPE步骤中各组分之间的重叠程度。维恩图中的数字表示在各组分中检测到的代谢物数量。此处观察到三个组分之间的重叠较少，表明在SPE步骤中实现了有效的化合物提取和代谢物类别分离。该图改编自 Yang et al，《色谱A杂志》Journal of Chromatography A 1300, 217-226 (2013)。

图 3. 采用 MTBE-SPE 方法在各组分中内标物（ISTD）的回收率¹²。按照文中所述方法进行提取，所得样品通过反相色谱（RPC）分离，并采用液相色谱-质谱联用技术（LCMS）在正负离子模式下进行分析。该图经修改自 Yang et al，《色谱学 A》（Journal of Chromatography A）1300, 217–226 (2013)。

图 4. 三位操作人员制备的沉淀组分结果。三位样本制备操作人员 A、B 和 C 对混合血浆样本执行了相同的蛋白质制备步骤。维恩图中的数字表示每位操作人员检测到的代谢物数量。操作人员 B 和 C 按照样本制备方案吸取了规定体积的液体，而操作人员 A 吸取了全部上清液及部分沉淀物，导致检测出多出 500 种以上的代谢物，其中大多数为该特定组分中的假阳性结果。

图5. 蛋白质沉淀步骤中蛋白沉淀的形成。(A) 样品处理前的100 µl人血浆；(B) 加入冰甲醇后的血浆；(C) 在0 °C、18,000 × g条件下离心15分钟后，管底形成的蛋白质沉淀。

图6. 液液萃取（LLE）步骤中亲水层与疏水层的分离. 有机溶剂甲基 叔丁基甲基叔丁基醚（MTBE）和水用于分离亲水性和疏水性代谢物。MTBE 层溶解非极性化合物，水层溶解极性化合物。 （A） 去蛋白后的血浆上清液； （B） 氮气干燥后的血浆； (C) 添加MTBE后的血浆； (D) 向血浆和甲基叔丁基醚中加水； (E) 离心后形成MTBE-水相层； (F) 去除上层MTBE层； (G) MTBE 去除后主要残留的亲水层

图7. 来自选定数据集的组分色谱图。样品制备在三个独立的混合血浆质控样本上进行，每个样本在液相色谱-质谱（LC-MS）仪器上重复进样三次。图中显示的是采用方法方案第7节所述LC-MS参数获得的血浆样本总离子色谱图。由于代谢物组成不同，其他生物流体的色谱图表现会有所差异。请点击此处查看该图的放大版本。

组分	电离模式	内标物	n	平均峰面积	峰面积 % CV
水相	正离子模式	Creatinine-D3	31	2217311	3.8%
中性脂质	正离子模式	Triglyceride-D5	31	4837032	9.9%
		C17 Ceramide	31	12736707	7.9%
磷脂	正离子模式	15:0 PC	32	1248929	9.3%
		17:0 PE	32	517234	7.9%

表1. 加标内标的质控结果。采用肺气肿小鼠模型数据集的混合血浆样本，用于在该多周研究中每日监测仪器状态。使用定量分析软件测定内标的峰面积（n = 仪器质控进样次数）。

组分	电离模式	内源性代谢物	平均峰面积	峰面积 % CV
水相	正离子模式	肌酐	2554574	2.3%
		缬氨酸	3712151	3.3%
		葡萄糖	2669190	6.9%
中性脂质	正离子模式	3-脱氢鞘氨醇	226644	3.9%
		DG(16:0/16:1/0:0)	11301	8.2%
		DG(P-14:0/18:1)	364119	1.9%
磷脂	正离子模式	PC(24:0/0:0)	27599	0.9%
		PC(16:0/22:6)	2873326	4.5%
		PI(16:0/18:1)	112998	4.4%
脂肪酸	正离子模式	10-氧代-5,8-癸二烯酸	1363284	2.3%
		16-氧代-十七烷酸	83700	2.9%
		2-甲基戊酸	285782	5.7%
脂肪酸	负离子模式	10-羟基-8-十八碳烯酸	10042	4.9%
		(R)-拉巴伦酸	173929	6.5%
		2-酮基戊酸	35488	6.0%

表2. 内源性代谢物的质量控制结果。 采用一个人类疾病数据集的混合血浆样本，以监测不同日期间样品制备的重复性。样本在三天内分别制备，每天三重复（n = 9 次制备质量控制进样）。

讨论

临床代谢组学研究的目标之一是鉴定与疾病或治疗相关的代谢组变化。因此，样品制备技术必须具有良好的稳健性、一致性和可转移性，能够在不同技术人员之间以及不同实验室之间重复应用²²。所得数据应能真实代表样品本身，所鉴定的变化应反映样品集的真实差异，而非样品制备过程中的误差。因此，准确的移液操作、正确的温度控制、有效分离不相溶的液层、氮气下干燥，以及使用相同品牌和规格的玻璃器皿与移液枪头均至关重要。

在蛋白质沉淀步骤中，从每个沉淀物中倒出的溶液体积必须保持一致，这对于减少样品体积差异、进而降低样品数据的变异至关重要。  该蛋白质沉淀步骤对于代谢组学研究是必需的，不可省略，因为它可在质谱分析前从小分子谱型分析样品中去除蛋白质。此步骤可消除病原体和大分子物质，并释放与蛋白质结合的代谢物⁷。样品中无蛋白质积累可延长高效液相色谱（HPLC）柱的使用寿命，并提高结果的准确性和质量。图5展示了对血浆样品进行该技术操作时形成的蛋白质沉淀物。该步骤有助于小分子的检测，增强离子丰度，并减少样品中蛋白质带来的基质效应。此外，由于假设在此步骤中所有蛋白质均已被去除，因此在液相色谱-质谱（LC-MS）分析中检测到的氨基酸应来源于代谢变化，而非蛋白质降解。

液-液萃取步骤至关重要，因为它将亲水性和疏水性代谢物分离到两个互不相溶的液层中。图6展示了液-液萃取（LLE）的操作流程及LLE分层示意图。若两相分离不当，会导致代谢物丢失或同时洗脱到两个组分中。仔细操作此步骤可减少出现在疏水性组分中的亲水性化合物数量。对于这些化合物，其检测结果将不可靠，因为无法确定哪个组分包含代表性结果。正确操作时，可减少代谢物在两相间的重叠。

为防止氧化降解，特别是脂质以及可能含有巯基的小分子，必须尽量减少与氧气的接触。因此，该操作始终在氮气环境下进行，以减少或防止含脂质或巯基化合物的氧化。此外，样品和/或溶液的转移需迅速（在1分钟内完成），以减少暴露于氧气的时间，随后立即将样品置于持续的氮气气流下干燥。干燥后，立即用100%甲醇重新悬浮，原因如上所述。

实验室可以从这一综合方法中以多种方式获益；希望分离某一类化合物的研究人员可以选择该方法中最适合其需求的部分。若研究人员仅需通过蛋白质沉淀获得代谢物混合物，则可仅执行该步骤。如果目标是获取亲水性代谢物（如多种药物、氨基酸和糖类），或仅需获取疏水性代谢物（例如甘油三酯、环氧化物、脂溶性维生素和磷脂），则研究人员可在蛋白质沉淀后进行液-液萃取步骤，并弃去不需要的组分。若研究人员需要对疏水性化合物进一步细分（如中性脂质、脂肪酸和磷脂），则可继续进行组分分离步骤。

样品储存条件对于保持样品在后续分析中的活性至关重要。如果样品储存不当，可能会发生降解或分解。 理想情况下，样品应保存在避光的螺口棕色小瓶中，以防止光敏物质降解。样品还应于 -80°C 冷冻保存，以防止代谢物降解^23-25。尽管本文未详细讨论，但在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析时，样品在自动进样器托盘中始终维持在 4°C，以确保所有样品处于恒定温度，避免环境温度变化影响样品的黏度、溶解度或稳定性。建议对本实验流程中的手动操作步骤（如液液萃取 LLE 和固相萃取 SPE）进行练习，以熟悉操作流程并提高操作熟练度。

该技术存在一些局限性。由于某些化合物的化学组成和电荷状态，它们会天然地分配到两个组分中，因此无法保证疏水性和亲水性代谢物的完全分离。此外，如图4所示，在蛋白沉淀提取步骤中操作不当可能导致样本和质量控制样品中代谢物的重现性较差。这会影响统计分析结果，尤其是在小样本数据集中，因为缺乏足够的统计效能。因此，每次对每个样品执行该步骤时，必须完全一致地操作。另一个限制因素是时间。尽管本方案中设有多个可暂停的节点，允许将样品冷冻并在次日继续制备，但仍应预留一整天时间以完成整个操作流程。第三，无法对生物样品中的每一种化合物都进行离子抑制效应的评估。由于无法确定基质对每个单独代谢物的影响方式，目前只能通过检测内标物来间接评估，而这些内标物理论上可模拟某些类别的内源性代谢物。最后，仅依靠该方法无法实现代谢物的绝对定性鉴定，必须结合串联质谱、数据库检索以及标准品对照才能完成代谢物的绝对鉴定。

代谢组学的一个重要部分是化合物的鉴定。尽管此处未详细讨论，但已使用液相色谱-质谱法（LC-MS）对质量控制样品进行了分析。制备了多个样品前处理空白样和仪器空白样，用于背景扣除，以降低来自污染物的假阳性率，从而获得更可靠的代谢物检出结果。在此步骤之后，根据质荷比（m/z）、保留时间、同位素比例和加合物信息，将多个“分子特征”归类合并，生成实际化合物列表。尽管化合物数量显著减少，但结果更为可靠，因为避免了同一化合物产生的多种加合物被误判为不同化合物。该完整方法具有良好的全面性，既可分离疏水性代谢物，如中性脂质、磷脂、脂肪酸、甘油三酯和类固醇，也可在水相组分中分离亲水性化合物类别，其中已鉴定出二十碳衍生物、糖类、黄酮类化合物和氨基酸^12,26。 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Fisher Scientific	A955-4
甲醇	Fisher Scientific	L-6815
氯仿	Fisher Scientific	C606-1
正己烷	Sigma Aldrich	34859
乙酸	Sigma Aldrich	49199-50ML-F
甲基 tert-丁基醚	J.T. Baker	9042-03
异丙醇	Sigma Aldrich	34965-2.5L
水	Honeywell Burdick Jackson	365-4
OA-SYS 加热系统	Organomation Associates, Inc		用于在 35 °C 下以恒定氮气流处理样品
12 位真空 manifold	Phenomenex
Strata NH2（55 µM，70Å）100 mg/ml 固相萃取小柱	Phenomenex	8B-S009-EAK
玻璃移液管尖端	Fisher Scientific	13-678-20C	用于将样品转移至固相萃取柱
塑料移液管尖端	USA Scientific	1182-1830	在无需使用玻璃尖端时使用
微量离心管	Fisher Scientific	02-681-320
带刻度玻璃移液管	Fisher Scientific	13-678-27B	用于样品前处理过程中转移有机溶剂
Pyrex 玻璃培养管	Corning Incorporated	99499-16X	用于在下一步操作前储存水相和脂质组分
自动进样瓶	Agilent Technologies	5182-0545
自动进样瓶密封盖瓶	Agilent Technologies	5182-0541
玻璃插管	Agilent Technologies	5183-2085	用于小体积样品
Mass Hunter 定性分析软件	Agilent Technologies	Version B.06.00	用于监测保留时间与压力曲线
Mass Hunter 定量分析软件	Agilent Technologies	Version B.05.02	用于分析质控与样品数据
Mass Profiler Professional 软件	Agilent Technologies	Version B.12.50	用于统计分析、倍数变化计算及代谢物鉴定