超轻量、可调节多电极探针的设计与制备用于小鼠电生理记录

摘要

理解行为的神经基础需要对脑回路集合进行记录。由于小鼠具有良好的遗传可操作性，因此可作为研究脑回路解析和模拟疾病的模型。本文介绍一种设计和制备微型探针的方法，适用于小鼠深部脑结构的靶向研究。

摘要

近年来，对小鼠（mus musculus）开展的生理学研究数量迅速增长，这与用于微环路解析和疾病建模的基因靶向技术的发展同步。例如，光遗传学的引入使得以空前的时间分辨率双向操控特定基因标记的神经元成为可能。为了充分利用这些工具并深入了解小鼠脑内微环路之间的动态相互作用，研究者必须能够在该小型啮齿动物的大脑深部区域，同时在固定头部和自由活动状态下，记录神经元群体的活动。要记录深部结构和不同细胞层的信号，需要一种能够将电极精确推进至目标脑区的装置；而要实现对神经元群体的记录，则要求每个电极均可独立移动，以便实验者在不干扰邻近电极的情况下分辨单个细胞。在自由活动的小鼠中同时实现上述功能，需要一种重量轻、耐用且高度可定制的电极驱动装置，以精准靶向特定脑区。

本文介绍了一种设计和制造微型、超轻量级微驱动电极阵列的技术，该阵列可针对个体进行定制，并能使用市售部件轻松组装。这些装置易于扩展，可根据目标脑区结构进行个性化调整；已成功用于在自由活动动物自然行为过程中记录丘脑和皮层区域的神经信号。

引言

Mus musculus 由于其遗传可操作性，已迅速成为生理学家研究基因特异性神经元的微环路解析以及人类疾病小鼠模型的首选动物模型。例如，近年来引入的因果遗传学工具，如光遗传学和化学遗传学效应子，使研究者能够验证特定神经环路在行为中的必要性和充分性^1-4。大量可获得的重组转基因小鼠驱动品系（Cre品系）进一步提高了靶向特定神经元亚型的实验便利性，从而增强了小鼠在这些研究中的应用价值⁵。

同样，针对常见神经及精神疾病开展的基因筛选和全基因组关联研究，已促进了脑部疾病遗传风险因素的识别^6,7。这些进展，结合小鼠遗传操作和基因组编辑工具的不断丰富，使小鼠成为模拟人类疾病的首选生物模型。疾病模型与因果性遗传工具的结合，为理解脑部疾病机制以及发现可用于干预的神经环路层面靶点提供了前所未有的机遇。

为了充分利用这些分子工具并深入了解健康与疾病状态下神经微环路的功能，必须将其与大脑活动的生理读出方法相结合。理想情况下，实验者应能够在保持单细胞分辨率的同时，监测大量神经元的活动。在自由活动动物中进行的细胞外多电极记录为此提供了可能；然而，该技术在小鼠中的应用一直受限。要记录较小的脑区靶点（例如，海马体中的CA1层），必须使用可调节电极，因为在手术植入后记录电极的微小移动都会导致无法维持稳定的记录^8,9。传统上用于在脑内移动电极的方法在小鼠中使用时会带来重量限制，使得在此类生物体中将大量神经元的记录与行为学研究相结合变得极具挑战性。

本文介绍了一种用于制备微型、超轻量级、可针对特定脑区进行个性化定制的微电极阵列的方法，该阵列兼容光遗传学实验，且可使用市售组件便捷组装。多电极“高密度驱动器”（hyperdrive）中的每个“微驱动器”均采用弹簧-螺钉机制推动电极，并通过集成于高密度驱动器主体内的塑料导轨来抵消螺钉旋转时产生的扭矩。首先，本文描述了在计算机辅助设计（CAD）软件中设计适用于3D打印的高密度驱动器主体及微驱动器的过程。通过为特定脑结构定制化设计高密度驱动器主体，可提高靶向精度，并进一步提升实验的成功率。其次，本文详细阐述了 fabrication 过程，即通过手工将市售部件组装成多电极阵列。该技术已成功应用于自由活动动物在自然觅食和操作性任务过程中对海马、丘脑和皮层神经元群体的记录。

方案

1. 设计意图

1. 通过浏览电子小鼠脑图谱的矢状面切片，确定目标脑区（外侧膝状体核（LGN，视觉丘脑））。
2. 在前后坐标（-2.3 – -2.7 mm）处，LGN 最宽。使用该区域设计驱动器底部（底片）。
   注意：总共可使用 8 根独立可移动电极来靶向 LGN（其中 4–6 根电极可到达 LGN，额外增加 2–4 根电极以补偿植入误差，图 1A）。
3. 在 Solidworks 中，在前视基准面上绘制设计主体的草图（图 1B）。点击“草图”，然后使用直线和曲线的组合绘制包含驱动器底座、手柄以及聚酰亚胺半槽轮廓的草图，如图所示。确保轮廓中无任何开口间隙。然后点击“退出草图”。
4. 接下来，选择前视基准面和右视基准面，点击“创建轴”。然后通过将高亮的蓝色草图轮廓（图 1B）旋转 360° 来创建三维设计主体模型。在“特征”菜单中，点击“旋转凸台/基体”。选择中线作为旋转轴。在参数部分，方向 1 选择“盲孔”，角度选择 360.00°。在“所选轮廓”部分，确保选中的是高亮的蓝色轮廓。
5. 通过将红色高亮轮廓旋转 13° 创建一个聚酰亚胺半槽（图 1C，左上）。操作步骤与上述第 1.4 步相同，仅角度设置不同。
6. 通过将绿色轮廓旋转 15° 创建一个驱动手柄（图 1C，右上）。
7. 使用圆周阵列功能创建第二个驱动手柄（图 1C，左下）。在“特征”菜单中，点击“圆周阵列”。在参数中，选择中线作为旋转轴。角度设为 180.00°，实例数设为 2。确保在“要阵列的特征”中选中第一个手柄。
8. 使用圆周阵列功能创建十六个聚酰亚胺半槽（图 1C，左下）。操作与第 1.7 步类似，但选择第一个聚酰亚胺半槽作为“要阵列的特征”。角度为 22.5°，实例数为 16（注意：此值等于 360° 除以所需阵列次数）。
9. 创建一个用于绘制聚酰亚胺接收槽的新基准面。方法为：在主菜单中点击“插入”，选择“参考几何体”，选中聚酰亚胺半槽的两侧，然后点击“创建新基准面”（图 1D，上）。
10. 创建微驱动器接收槽（包括螺钉孔、聚酰亚胺孔和抗扭轨）（图 1D，下）。方法为：在第 1.9 步创建的新基准面上绘制包含所有这些特征的草图。对于抗扭轨，需在聚酰亚胺顶部槽的两侧之间定义一条中心线。然后，通过绘制两个垂直于中心线的圆（两圆心间距为一个半径），再修剪中间轮廓，来绘制抗扭轨。
11. 在“特征”菜单中，点击“拉伸凸台/基体”以创建抗扭轨，选择向上拉伸 10 mm，向下拉伸 2 mm 的盲孔方式。对于螺钉孔和聚酰亚胺孔，点击“拉伸切除”，选择 6 mm 盲孔深度，并向上延伸数毫米（图 1E，左）。
12. 以中心为旋转轴，使用圆周阵列功能将微驱动器接收槽阵列 16 次（22.5°，16 个实例，等间距）（图 1E，右）。
13. 在手柄顶部，从驱动手柄中心尖端开始，朝向中心轴方向绘制一个 3 mm × 3 mm 的方框。使用“拉伸凸台”功能将其向上拉伸 2 mm。在 EIB 螺钉将要安装的位置绘制直径为 1 mm 的圆。随后，进行 1.5 mm 的“拉伸切除”以形成孔。然后，使用“圆周阵列”功能将该方框和孔阵列两次（文本标注：180°，2 个实例，等间距，绕中心轴）。
14. 根据 图 1F 中的尺寸（单位：毫米）绘制顶片草图。使用“拉伸凸台/基体”功能创建其三维模型。
    注意：完成这些步骤后，驱动器设计即已完成。实际驱动器本体通过立体光刻工艺制造。有多家公司可根据 STL 文件提供立体光刻打印服务。我们建议选择能够使用硬质塑料（如 Accura® 55）打印、且最小分辨率达到至少 0.1 mm 的服务。

2. 超驱动组件的制备

1. 在平坦表面上铺一小块双面胶带，并剪下所需数量的31 G针头 聚酰亚胺管，长度约8厘米（内径/外径：0.0071英寸/0.0116英寸；壁厚：0.00225英寸）图2A - 2B).
2. 将第一层导管紧密地排列在双面胶带上，注意使导管尽可能彼此紧邻地放置在胶带上。在聚酰亚胺层上滴加少量稀薄的氰基丙烯酸酯胶水。图 2C)
3. 快速铺设第二层聚酰亚胺 (图 2D).
4. 使用26 G规格的光纤占位器 套管。在将其组装之前，务必使用基于聚四氟乙烯的润滑剂进行润滑（图 2E).
5. 在聚酰亚胺束上垂直涂抹一条长度为4-5 mm的环氧树脂图2F）待环氧树脂硬化后（2-3 小时），从底层移除胶带，并对另一侧重新进行环氧处理。待环氧树脂再次硬化后，26 G 套管可被移除，并使用剃刀片从中间将构建物切开（图2G），从而得到两个聚酰亚胺基质，每个均可用于一个高通量驱动装置（hyperdrive）图 2H).
6. 在一张透明胶片纸上打印出锥形模板，并裁剪一张相应尺寸的耐用铝箔 (图3A - 3C).
7. 在铝箔上涂抹一层环氧树脂，然后迅速贴上透明纸。使用重物或木棒将环氧树脂抹平，使其均匀分布。 (图3D).
8. 剪下圆锥形模板，并用鳄鱼夹夹住固定。最后，使用另一滴环氧树脂将各部件永久粘合。 (图3E).

3. 微驱动装置的最终组装

1. 将EIB连接至驱动体，并重新将26 G 套管穿过聚酰亚胺导管阵列。利用EIB上的光纤孔对准聚酰亚胺阵列与驱动体，确保导管垂直于EIB，然后将阵列用环氧树脂固定在驱动体上，注意避免环氧树脂流入导管或驱动体内 （图4A - 4C）。
2. 将聚酰亚胺阵列中的每一根导管与驱动体内壁上对应的卡槽一一对应。在每根导管上套入一小段33 G 聚酰亚胺管，并插入卡槽中，然后滴加少量氰基丙烯酸酯胶水以固定每根导管。（图4D - 4E）最后，用环氧树脂将整个装置固定在驱动体内壁，并将聚酰亚胺管剪裁至略高于内缘的位置 （图4F - 4G）。
3. 通过将定制螺钉穿过顶片的中心孔，再套上一个5 mm弹簧，组装微型驱动器。将顶片的外孔滑入导轨，轻轻旋紧螺钉，直至弹簧压缩至最小长度。（图4H - 4I）对每个导轨/微型驱动器重复此过程 （图4J）。
4. 将驱动阵列倒置，在驱动底座底部拍摄导管阵列的照片。该图像将用于确定每个微型驱动器所对应的导管位置 （图4K）。
5. 从驱动底座底部将一根聚酰亚胺管（0.005英寸）插入每根导管中，使载体管在微型驱动器完全降下时从顶部伸出1-2 mm，并在照片上记录对应微型驱动器的编号。（图4L - 4M）
6. 将聚酰亚胺管用环氧树脂固定在微型驱动器支撑结构上，注意避免环氧树脂流入微型驱动器内部，污染弹簧或螺钉 （图4N、4P - 4Q）。
7. 将所有微型驱动器完全降下，在聚酰亚胺阵列底部将所有聚酰亚胺管齐平剪断 （图4O）。
8. 使用两颗#00-90 x 3/16英寸螺丝将电极接口板固定在驱动底座上（图4R）。
   注：此时驱动阵列已准备好装载立体电极或四极电极。有关四极电极的制作与装载细节，请参见¹⁰。打印的驱动底座和微型驱动器使用SolidWorks 2011 3D CAD软件设计：请点击此处下载SolidWorks文件。
9. 装载完成后，将驱动器翻转，小心地将屏蔽锥套在驱动器外部，仅使底片部分露出。使用环氧树脂将屏蔽锥固定在驱动体上。
10. 屏蔽锥安装后，剥去一小段不锈钢丝（.008英寸裸线，.011英寸涂层线）的绝缘层，并将其焊接到EIB上。用针头刮擦屏蔽锥内部的铝质部分，然后使用银漆将钢丝接地至屏蔽锥。待银漆干燥后，再用少量环氧树脂加固。或者，也可直接使用导电环氧树脂（MG Chemicals，Surrey，加拿大）将钢丝固定在屏蔽锥上。

结果

植入体的构建过程始于3D打印超驱动装置的设计（图1），随后构建底部组件（图2）、屏蔽锥（图3），并通过分别组装微型驱动器完成超驱动装置的最终装配（图4）。接下来是将电极装入微型驱动器（详见¹⁰）。完成此步骤后，即可使用这些装置对多个脑区进行记录。图5展示了外侧膝状体核（LGN）和海马体（HPC）同步记录的示例轨迹。图5B中所示单个神经元信号的稳定性极为显著，在数天内均表现出一致的波形。通过发光二极管刺激诱发的反应确认这些神经元为LGN神经元，这一结果由图5C中的刺激后时间直方图（PSTH）显示。在同一实验准备中，记录了HPC局部场电位以作为行为状态的指标。这些轨迹在行为静息期间显示出尖波涟漪（图5D），符合其海马来源的特征。

图1. 在Solidworks中设计微型驱动装置。A. 小鼠脑冠状切面示意图，位于前囟后-2.3至-2.7 mm的A/P坐标处。皮层上方绘制了四条独立的聚酰亚胺带（300 µm），用以说明电极对LG区域（红色）的靶向定位。B. 设计主体的草图。将蓝色轮廓旋转180°，得到三维设计主体模型（插图）。C. 在设计主体上添加聚酰亚胺槽和驱动手柄。将B图中红色高亮的轮廓旋转13°，形成聚酰亚胺半槽（左上）。通过将B图中的绿色轮廓旋转15°添加一个驱动手柄（右上）。使用圆形阵列功能添加第二个手柄（左下）。相同功能可用于生成16个聚酰亚胺半槽（右下）。D. 在设计中添加一个新的平面（上图），用于创建微驱动接收器的新草图，包括螺钉孔、聚酰亚胺孔和防扭轨（下图）。E. 使用切割和拉伸功能将这些特征引入设计，并旋转360°以形成16个接收器。F. 顶部部件草图的尺寸（左）和三维模型的尺寸（右）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 超驱动装置底部组件的制备。 A. 将第一根聚酰亚胺管放置在双面胶带上。B. 随后逐个放置其他聚酰亚胺管，注意尽量减少管之间的间隙。C. 第一层排列完成后，迅速涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水。D. 在胶水未干之前，快速添加第二层聚酰亚胺管。E. 在聚酰亚胺束的顶部，插入一根26 G套管，作为光学纤维的占位孔。F. 整个结构用一滴环氧树脂牢固固定。G. 移除套管后，可用刀片从中间将结构切开，得到两个相同的底部组件。H. 展示完成后的底部组件切割面视图，可见两排各四个聚酰亚胺管以及用于光学纤维的孔道。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3. 组装高密度驱动装置（hyperdrive）。 A. 将聚酰亚胺基质插入驱动主体中，并使用 26 G 套管与电子接口板（EIB）对齐。B. 使用少量环氧树脂将聚酰亚胺基质固定在驱动主体上。C. 可能需要进行第二次环氧树脂涂覆，之后应使用打磨工具去除多余的环氧树脂。D. 驱动主体顶部视图，显示已插入的基质。E. 使用一小段 33 G 聚酰亚胺管，将外层导管安装到驱动主体对应的槽位中。F. 所有外层导管均应分配至相应轨道，注意尽量减少导管上的张力。G. 在所有外层导管定位完成后，应用环氧树脂固定，并在其内唇上方剪断。H. 组装一个微驱动组件，包括定制螺钉、5 mm 弹簧和顶部部件，并将其安装到与某一导管对应的轨道上。I. 每个微驱动组件应小心地旋入驱动主体中。J. 组装完成后，每个导管应对应一个微驱动装置。K. 聚酰亚胺基质的底部视图。L–M. 将聚酰亚胺管（0.005 英寸）插入每个外层导管中。N. 每个内层导管应紧密地嵌入其对应微驱动装置的叉形结构中。O. 使用环氧树脂将内层聚酰亚胺管固定到对应的微驱动装置上，并尽可能剪短。在所有内层导管粘接后，从聚酰亚胺基质中伸出的内层导管应与基质边缘齐平剪切。P. 内层导管装载过程中驱动装置的倒置宏观视图。Q. 内层导管装载过程中驱动装置的顶部宏观视图。R. 完全组装好的高密度驱动装置，已连接电子接口板（EIB），准备装载电极。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 制备屏蔽锥。 A. 打印在透明胶片上的锥形模板。B - D。将一张铝箔用一层薄环氧树脂粘贴到模板上。E. 剪下模板后，将锥体成型并用环氧树脂粘合固定。

图 5. 使用超轻型多通道记录装置进行多部位记录。 A. 植入多通道记录装置后自由活动小鼠的图像。 B. 该小鼠记录到的两个单细胞单位波形示例。 C. 左图：小鼠脑冠状切面，标示外侧膝状体核（LGN），部分电极由此处插入；右图：两个LGN神经元在视觉刺激（黄色条表示刺激时段）下的刺激相关时间直方图（PSTH）示例。 D. 左图：冠状切面标示海马（HPC），另一组电极由此处插入；右图：海马区尖波涟漪（红色高亮部分）的局部场电位记录示例。

图 6. 驱动装置组件概览。（左）Hyperdrive 各组件的完整示意图。（右）单个微驱动装置组件的示意图。

讨论

本方案概述了构建一种超轻量级微型驱动阵列的流程，用于靶向小鼠单个或多个脑区。完成最终组装步骤后，该高密度驱动装置即可通过标准外科手术植入技术进行植入，并使用牙科水泥固定在小鼠颅骨上。植入后，在用手固定小鼠的情况下，可使用小型螺丝刀独立调节每个电极的位置。每个电极每旋转一圈所推进的距离由螺丝的螺距决定。使用此处所引用的螺丝时，每个电极每旋转一圈约推进 150 mm，但也可采用半圈或四分之一圈的调节方式以实现更高的精度。

草图的尺寸 图1B 确定植入物的整体尺寸，因此，双向调整植入物尺寸的一个直接方法是修改该关键草图的尺寸。此外，可延长螺钉长度以靶向更深的脑区结构。我们推荐使用定制的钛合金螺钉，因为其重量轻且比钢制螺钉更不易脆断。请注意，防扭转导轨需随螺钉长度线性缩放，目前我们尚未确定这些结构可打印的最大长度。为靶向多个脑区，可修改底部部件的形状。添加已知尺寸的垫片（厚度200 µm）可为靶向不同脑区结构（例如海马体和前额叶皮层）的聚酰亚胺材料之间提供所需的间隔。这些垫片可在底部部件组装步骤中加入，待环氧树脂固化后再将其切除。

该设计的一个主要局限性在于其依赖专有软件（本例中为 Solidworks）。未来若能开发出开源程序，提供用户友好的界面，使神经科学领域研究人员在工程背景有限的情况下也能便捷地设计此类设备，将对神经科学界带来巨大裨益。

该方法相较于现有方法具有多项优势。首先，其设计简洁，仅依赖极少的示意图（图1）。其次，该装置超轻便，无需使用牙科水泥或任何沉重材料进行组装，整体重量约为1.7 g，仅为功能类似的商用植入体重量的三分之一左右。第三，其制备无需特殊设备：植入体主体可通过多种来源进行3D打印（例如approto.com，但还有其他选择）；螺钉可定制（例如antrinonline.com）；弹簧为市售产品（例如leesprings.com）；因此整个组装过程可在一天内完成。最后，这些植入体已被成功用于在自然觅食、结构化行为任务以及睡眠过程中记录多个脑区的神经活动（图5）。

该方法的未来应用包括实现其可扩展性。通过简单地改变两个因素，该植入装置很可能实现双向扩展：1）图1B中示意图的尺寸；以及 2）所设计的微驱动接口数量（图1D）。例如，可将其向下扩展，用于记录早期发育阶段自由活动小鼠的神经信号；也可向上扩展，用于记录大鼠、兔子、雪貂，甚至非人灵长类动物的神经活动。

最后需要提醒读者的是，成功实施本文所述方法的关键在于，对所附 .stl 设计文件进行任何修改时，都必须先进行原型验证。例如，读者会注意到，所附设计中包含一个“8”字形防扭轨。鉴于3D打印的局限性，这是可实现的最佳设计，因为我们通常需要钻孔。若设计为圆形，会降低稳定性；而若为方形或带角度的形状，则会限制通过钻孔修正3D打印缺陷的能力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微型驱动螺钉	Antrin		半圆形 0.6 UNM 钛合金螺钉，螺纹长度 8 mm，从螺钉头下起总长度为 9 mm。
攻丝润滑剂	AGS CO.	#TA2	攻丝用润滑脂
微型驱动器			参见 .STL 文件
驱动体			参见 .STL 文件
外层聚酰亚胺导管	Minvasive Components	IWG Item # 72113300022-012	长度：12’’，内径：0.0071’’，外径：0.0116’’，壁厚：0.00225’’
内层聚酰亚胺导管	Minvasive Components	IWG Item # 72113900001-012	长度：12’’，内径：0.0035’’，外径：0.0055’’，壁厚：0.001’’
接地导线	A-M Systems, Inc.	Catalog # 791900	裸线直径：0.008''，涂层后直径：0.011''
三重润滑剂			基于聚四氟乙烯的润滑剂——气雾剂
微型驱动弹簧	Lee Spring	部件编号 # CB0050B 07 E	外径：1.016 mm，孔径：1.193 mm，线径：0.127 mm，自由长度：10.160 mm，压并长度：3.581 mm
Z-poxy 5 Minute	Pacer Technology (Zap)	PT37
银漆	GC Electronics	部件编号：22-023	银导电漆 II
	Tri-Flow	20009
26 号皮下注射针管——不锈钢	Small Parts	HTXX-26T-12-10	长度：12’’，内径：0.012’’，外径：0.018’’
EIB 螺钉	Component Supply Co.	MX-0090-03SP	#00-90 × 3/16’’
精细剪刀——Toughcut	Fine Science Tools	14058-09	22 mm
透明纸	3M	PP2500
铝箔	Reynold's Wrap Heavy Duty		加厚型