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方法文章

原位检测脑和心脏中使用主要组织相容性复合物II类右旋糖酐微球的自身反应性CD4 T细胞

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DOI：

10.3791/51679

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2014年8月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

本文内容

摘要

通过主要组织相容性复合体II类右旋糖酐微球直接染色检测脑和心脏中自身反应性CD4 T细胞的方案已在本报告中描述。为实现全面分析，需采用一种可靠的方法来定量抗原特异性CD4+ T细胞 原位 也设计了该方法。

摘要

本报告展示了利用主要组织相容性复合体（MHC）II类右旋糖酐微球（dextramers）检测自身反应性CD4 T细胞的方法 原位 在SJL小鼠的髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）139-151诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）以及A/J小鼠的心肌肌球蛋白重链-α（Myhc）334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）中。使用了两组不同的右旋糖酐微球（dextramer）试剂组合，其中dextramers+ 细胞通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行分析：EAE，IAs/PLP 139-151 右旋糖酐微球（特异性）/抗 CD4 和 IAs/Theiler小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）70-86 dextramers（对照）/抗-CD4；以及EAM，IAk/Myhc 334-352 右旋糖酐聚合物/抗 CD4 和 IAk/牛核糖核酸酶（RNase）43-56 右旋糖酐微球（对照）/抗 CD4。对EAE小鼠脑组织切片进行激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）分析，结果显示存在CD4阳性和PLP 139-151右旋糖酐微球阳性细胞，但未检测到TMEV 70-86右旋糖酐微球阳性细胞，表明PLP 139-151右旋糖酐微球的染色具有特异性。同样，对EAM小鼠心脏组织切片的分析也显示存在Myhc 334-352右旋糖酐微球阳性细胞，但未检测到RNase 43-56右旋糖酐微球阳性细胞。+ 细胞与预期一致。此外，还设计了一种全面的方法，用于定量分析“Z”系列图像中抗原特异性CD4 T细胞的频率。

引言

使用主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体来检测抗原特异性CD4 T细胞一直是一项挑战1-7。为了提高MHC II类四聚体的检测灵敏度，研究团队开发了新一代四聚体，称为“dextramer”（右旋糖酐四聚体）8。Dextramer含有右旋糖酐骨架，其上偶联了多个链霉亲和素-荧光素分子，从而使多个带有肽段、生物素化的MHC单体能够结合到一个右旋糖酐分子上9。因此，这种包含多个MHC-肽复合物的大型MHC dextramer聚集体可与多个T细胞受体（TCR）相互作用。

该研究团队近期为多种自身抗原制备了dextramer，并证实dextramer的检测灵敏度较四聚体（tetramer）提高了约五倍。 8实验系统包括：在SJL小鼠中通过蛋白脂质蛋白（proteolipid protein, PLP）139-151诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）；在C57Bl/6小鼠中通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG）35-55诱导的EAE；以及在A/J小鼠中通过心肌肌球蛋白重链-α（cardiac myosin heavy chain-α, Myhc）334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）。本研究展示了利用PLP 139-151和Myhc 334-352葡聚糖微球（dextramers）检测抗原特异性CD4 T细胞的方法 原位 通过开发一种直接染色方案，特异性地检测抗原特异性CD4 T细胞，从而无需使用荧光标记抗体进行信号放大——这一策略在四聚体（tetramers）应用中较为常见。此外，还建立了一套全面的组织评估方法，以可靠地统计抗原特异性CD4 T细胞的频率。 原位 10抗原特异性T细胞的检测 原位 可区分由特异性抗原刺激引起的事 件与由旁观者活化引起的事 件。同样，该方法 原位 该技术还为追踪抗原特异性T细胞在靶器官中的浸润动力学提供了机会。

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方案

伦理声明：

所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并经美国内布拉斯加州林肯市内布拉斯加大学林肯分校批准。

1. EAE 的诱导

  1. 为诱导EAE，按照文献11所述方法制备肽/完全弗氏佐剂（CFA）乳剂，并作如下修改：步骤1.1：将PLP 139-151溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成浓度为1 mg/ml的溶液。步骤1.4：每只动物使用含100 µg PLP 139-151的200 µl CFA乳剂。步骤1.4.1：为免疫十只动物，取1 ml PLP 139-151（1 mg/ml溶于1×PBS）与等体积CFA混合，共制备2 ml乳剂。步骤1.5：将200 μl乳剂分次皮下注射至5至6周龄雌性SJL/J小鼠的两个腹股沟区（每处约75 μl）和胸区（约50 μl）。步骤1.7和1.8不适用于EAE的诱导。

2. EAE 小鼠的临床评分及大脑组织的采集

  1. 从免疫后第9天开始，每日监测动物临床症状的出现情况，并对疾病严重程度进行评分：0 - 健康；1 - 尾巴无力或后肢无力，但不同时出现；2 - 尾巴无力且后肢无力；3 - 后肢部分瘫痪；4 - 后肢完全瘫痪；5 - 濒死或死亡12。
  2. 当小鼠神经功能评分达到3或4时，使用CO2实施安乐死。进行安乐死时，首先通过调节CO2气罐的减压阀（压力不超过6 psi），将安乐死舱预先充满CO2，使动物在舱内停留约5分钟，以实现完全窒息。将已安乐死的动物浸入70%酒精中消毒。立即把动物置于吸水垫上，用无菌镊子和剪刀剪开胸腔，暴露心脏。穿刺右心耳，并向左心室注入10 ml冷的1×PBS进行灌注。
  3. 使用弯头剪刀沿颅骨环形剪切，打开颅腔，并用镊子小心翻起颅骨。通过钝性分离取出脑组织，用干净的手术刀将大脑与小脑分离。将大脑放入含有冷的1×PBS的离心管中，置于冰上保存，直至后续处理。

3. 原位 脑组织切片的MHC II类分子（IA）染色s)/PLP 139-151 右旋糖酐微球

  1. 配制4% PBS缓冲的低熔点琼脂糖，于50 °C加热溶解后，置于40 °C水浴中备用。
  2. 将大脑置于冰上放置的一次性深底组织学包埋盒中，倒入熔融状态（40 °C）的琼脂糖。立即用镊子轻轻按压大脑，使组织完全浸没。将包埋盒置于冰上15–20分钟，直至琼脂糖完全凝固。
  3. 用预冷的1× PBS填充振动切片机浴槽，并在浴槽周围加入冰块，以维持PBS温度在0至2 °C之间。将洁净的剃刀刀片安装至振动切片机上，并将刀片角度设置为15°。
  4. 将组织置于振动切片机中。修去包埋组织四周多余的琼脂糖，并略微暴露大脑的腹侧表面。
    1. 在振动切片机组织块表面涂抹超级胶水，将包埋在琼脂糖中的组织转移至涂胶表面，使大脑腹侧面向下，以便进行横切。一旦组织固定在块上，切勿再移动。
    2. 将装有琼脂糖包埋组织的振动切片机块置于冰上，静置15分钟使胶水完全干燥。
  5. 同时，将组织培养室逐个放入24孔板的各孔中。向含有组织培养室的孔中加入1 ml冷的1× PBS，并将板置于冰上。
    1. 通过使用超级胶水将一层薄尼龙网固定在25 ml聚丙烯移液管的切口端来制备组织培养室；修剪移液管周围多余的网膜后，将移液管从网膜处截断至1 cm长度。
  6. 将振动切片机刀片降至组织上表面水平；设置切片速度为0.22 mm/sec，开始向前推进切片，制备厚度为200 µm的切片。使用水彩软毛刷将每一片脑组织切片转移至24孔板各孔内的组织培养室中。切片过程中始终保持板置于冰上，以防止组织降解。注意：按照这些步骤，总共从大脑腹侧上方三个不同区域获得三对切片（图 2）。每对中的一片切片（共三片）分别放入三个独立的组织培养室，用于特异性右旋糖酐微球（IAs/PLP 139-151）和抗CD4抗体染色。同样，另一组三片切片分别放入三个独立的组织培养室，用于对照右旋糖酐微球（IAs/TMEV 70-86）和抗CD4抗体染色。
  7. 将含有待用特异性右旋糖酐微球染色切片的三个组织培养室转移至24孔板中的三个孔（每孔一个培养室），其中已预先加入300 µl染色混合液，该混合液包含藻红蛋白偶联的PLP 139-151右旋糖酐微球（2.5 μg/ml）和抗CD4-藻红蛋白（PE；5 µg/ml），溶于封闭液（含2%正常山羊血清的1× PBS）中。用盖子覆盖各孔。
  8. 同样，将含有待用对照右旋糖酐微球染色切片的三个组织培养室转移至24孔板中的另外三个孔（每孔一个培养室），其中已预先加入300 µl染色混合液，该混合液包含藻红蛋白偶联的TMEV 70-86右旋糖酐微球（2.5 μg/ml）和抗CD4-PE（5 µg/ml），溶于封闭液中。用盖子覆盖各孔。注意：右旋糖酐微球的制备方法参见Massilamany et al., 8，用于制备右旋糖酐微球的右旋糖酐分子由丹麦哥本哈根Immudex公司惠赠。
  9. 标记各孔，并用铝箔包裹整块板，置于室温下避光、轻轻摇动的摇床上孵育1.5小时。
  10. 孵育结束后，在摇床上进行洗涤：将组织培养室转移至含有1 ml冷1× PBS的新鲜孔中，避免液体从一个孔溅入另一个孔。重复洗涤三次，每次至少10分钟。确保组织切片不被干燥，以免其粘附在培养室壁上。
  11. 将组织培养室转移至24孔板中的新孔，每孔含1 ml过滤后的4% PBS缓冲的多聚甲醛（pH 7.4），在摇床上以轻柔振荡方式固定切片2小时。
  12. 按照步骤3.10所述方法重复洗涤三次。
  13. 使用水彩软毛刷将染色并固定的切片转移至洁净的显微镜载玻片上。擦去多余水分但勿触碰切片，用封片剂封片，加盖盖玻片，并将载玻片置于暗室中室温过夜干燥 。
  14. 将载玻片存放在避光的载玻片储存盒中，于4 °C保存。

4. EAM 诱导及心脏采集

  1. 按照参考文献11所述方法诱导实验性自身免疫性心肌炎（EAM）。
  2. 免疫后第21天，使用配备CO2气瓶的密闭安乐死装置处死小鼠，并将动物浸入70%酒精中消毒。立即将动物置于吸水垫上，用镊子和剪刀剪开胸腔暴露心脏。穿刺右心耳，通过左心室注入10 ml冷的1×PBS进行灌注。取出心脏并置于含有冷的1×PBS的离心管中。

5. 原位 心脏切片的MHC II类（IA）染色k)/Myhc 334-352 Dextramers

  1. 配制 4% PBS 缓冲的低熔点琼脂糖，于 50 °C 加热溶解后，置于 40 °C 水浴中备用。
  2. 将心脏置于冰上放置的一次性深底模具组织学包埋盒中，倒入 40 °C 熔融琼脂糖，使组织完全浸没，操作如步骤 3.2 所述。
  3. 继续执行步骤 3.3。
  4. 修去包埋组织四周多余的琼脂糖，并略微暴露心脏底部。在振动切片机组织块表面涂抹超级胶水，将琼脂糖包埋的组织块转移至涂胶表面，使心脏暴露面朝下贴合胶水。组织一旦固定，切勿移动。
    1. 将含有琼脂糖包埋组织的振动切片机组织块置于冰上，静置 15 分钟使胶水完全干燥。
  5. 继续执行步骤 3.5 和 3.6。
  6. 使用水彩软毛刷将心脏切片转移至置于 24 孔板孔内的组织切片室中。切片过程中将板置于冰上，以防止组织降解。注意：按照这些步骤，从心尖至心底共获得八对切片（图 2）。将所有切片放入切片室中，每室最多放置 3 片。每对切片中的一片（共八片）用于特异性右旋糖酐探针（IAk/Myhc 334-352）和抗 CD4 抗体染色；另一组八片则用于对照右旋糖酐探针（IAk/RNase 43-56）和抗 CD4 抗体染色。
  7. 将含有待用特异性右旋糖酐探针染色切片的三个切片室分别转移至 24 孔板的三个孔中，每孔预先加入 300 µl 含 APC 标记的 Myhc 334-352 右旋糖酐探针（2.5 μg/ml）和抗 CD4-PE（5 µg/ml）的封闭液混合液。用盖板覆盖各孔。
    1. 同样，将含有待用对照右旋糖酐探针染色切片的三个切片室分别转移至 24 孔板的另外三个孔中，每孔预先加入 300 µl 含 APC 标记的 RNase 43-56 右旋糖酐探针（2.5 μg/ml）和抗 CD4-PE（5 µg/ml）的封闭液混合液。用盖板覆盖各孔。
  8. 标记各孔，用铝箔包裹 24 孔板，置于室温避光条件下，在摇床上以轻柔振荡模式孵育 1.5 小时。
  9. 继续执行步骤 3.10 至 3.11。
  10. 按照步骤 3.10 所述方法重复洗涤三次。
  11. 使用水彩软毛刷将染色并固定的切片（每张载玻片最多三片）转移至洁净的显微镜载玻片上。擦去多余水分时避免接触切片，用封片剂封片，加盖盖玻片，于室温避光过夜干燥。
  12. 将载玻片置于避光的切片盒中，于 4 °C 保存。

6. 通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）分析右旋糖酐微球+（dext+）CD4+ T细胞（适用于脑和心脏切片）

  1. 使用 Nikon A1-Eclipse 90i 共聚焦显微镜系统进行常规扫描和图像采集。启动时，点击打开 NIS Elements AR 软件（版本 4.13）。
    1. 从面板中选择“TRITC”和“Cy5”通道。TRITC 和 Cy5 通道的激发/发射波长默认分别为 561.5 nm / 553-618 nm 和 640.7 nm / 663-738 nm。
    2. 分别为 TRITC（CD4-PE）和 Cy5（dextramer-APC）通道指定伪彩色“绿色”和“红色”。
    3. 将待检玻片置于显微镜载物台上，并在 100X 放大倍数下手动调焦。将“HV”设置为 110，偏移量设置为“0”。点击“Focus”，调节“电压”以优化激光。
    4. 点击“Focus”；从上至下扫描切片，并设置图像采集的‘Z’层面。点击“CH 系列”，依次采集图像。根据红色（dextramer）和绿色（CD4）通道信号的共定位，识别呈黄色点状的 dext+ CD4+ T 细胞。
  2. 使用 Olympus FV500-BX60 共聚焦显微镜对 dext+ CD4+ T 细胞进行简便的定量计数。开始时，点击打开 FLUOVIEW 软件（版本 4.3）。
    1. 从下拉菜单中选择染料“Cy3”和“Cy5”，点击“apply”以加载相应的激光器。注意：Cy3（543 nm/伪彩色“绿色”；CD4-PE）和 Cy5（633 nm/伪彩色“红色”；dextramer-APC）通道的激发/发射波长。
    2. 将待检玻片置于显微镜载物台上，在低倍镜（4X 或 10X）下手动调焦。在 Cy3 激光开启状态下点击“Focus”，并对炎症病灶进行聚焦。
    3. 将物镜切换至 100X 放大倍数。从下拉菜单中将文件大小设置为“512/512”。点击“Focus”，分别调节 Cy3 和 Cy5 的“PMT”、“Gain”和“Offset”参数以优化激光。
    4. 点击“Z stage”，然后在两个激光均开启的状态下点击“Focus”。通过点击“上”和“下”箭头设置“Z stage”的厚度。将“Z”间隔设置为 2 µm。
    5. 点击“Stop”，选择“Seq123”。然后点击“XYZ”，开始对炎症病灶内选定区域采集“Z”系列图像。将“Z 序列图像”保存为 AVI 文件。保存图像文件时，从“Z 序列图像”中选择图像，然后以“tiff”格式保存。
  3. 检查来自大脑的三对切片，其中一组三张切片用 IAs/PLP 139-151 dextramer/抗-CD4 染色，另一组三张切片用 IAs/TMEV 70-86 dextramer/抗-CD4 染色，以进行定量分析。
    1. 同样地，对心脏组织分析八对切片，其中一组八张切片用 IAk/Myhc 334-352 dextramer/抗-CD4 染色，另一组八张切片用 RNase 43-56 dextramer/抗-CD4 染色。
  4. 每张脑组织切片中检查 10 至 15 个炎症病灶，每个病灶中依次采集 15 至 25 张连续图像。
    1. 从所有八张心脏切片中共计检查 20 个炎症病灶，从每个病灶中依次采集 10 至 15 张连续图像。扫描玻片时采用“水平-垂直向上-水平-垂直向下”的移动方式采集‘Z’序列图像，以避免在同一病灶内重复采集‘Z’系列图像。
    2. 采集完‘Z’序列图像后，通过识别玻片编号、切片名称以及所采集的‘Z’序列图像编号来命名文件。
      1. 使用‘ImageJ’软件计算 dext+ CD4+ T 细胞占 CD4+ T 细胞总数的比例。在‘ImageJ’中选择“计数器类型”，勾选“显示全部”，通过点击每个细胞中心开始计数，并使用侧向箭头在不同的‘Z’序列图像中继续计数。完成所有 CD4 T 细胞计数后，选择另一种计数器类型，计数 CD4+ dext+ T 细胞。点击结果标签，获取两种不同计数器所计细胞总数。
      2. 为获得总数，将代表全部三张脑组织切片或全部八张心脏切片的所有‘Z’序列图像中的细胞数量相加。

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结果

在本报告中， 原位 通过使用MHC II类右旋糖酐微球直接染色来检测抗原特异性的自身反应性CD4 T细胞。新鲜切割的脑组织切片来源于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠，并用含有PLP 139-151（特异性）或TMEV 70-86（对照）右旋糖酐微球及抗-CD4抗体的混合物进行染色。上图面板中 图1 显示用PLP 139-151葡聚糖微球（红色）和CD4抗体（绿色）共染色的脑组织切片的激光扫描共聚焦显微镜分析结果，其中双阳性细胞呈黄色。而在用TMEV 70-86（对照）葡聚糖微球染色的切片中（底部图），未见此特征。共染色（dext+ CD4+) 细胞在周边区域显示出点状斑点。对脑组织切片中PLP特异性T细胞进行定量分析的步骤如下（图 21）制备三对切片，每对中的一张切片分别用抗CD4抗体和PLP 139-151葡聚糖微球单独染色；同样，另取三张切片用抗CD4抗体和对照（TMEV 70-86）葡聚糖微球染色。2）在特定切片上，根据抗CD4染色结果识别出10至15个炎性病灶。3）从每个病灶依次自上而下采集一组...

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讨论

与MHC I类四聚体不同，MHC II类四聚体在常规应用中的使用仍具挑战性，尤其是在计数低亲和力自身反应性CD4 T细胞前体频率方面，部分原因在于其依赖细胞活化状态 6,15-17最近，通过开发出新一代的四聚体——“dextramer”，我们得以规避这一问题，从而能够检测针对多种自身抗原的抗原特异性CD4 T细胞，例如PLP 139-151、MOG 35-55和Myhc 334-352 8在本报告中，首次利用MHC II类右旋糖酐多聚体来检测和定量自身反应性CD4 T细胞 原位 已使用EAE小鼠的脑组织切片和EAM小鼠的心脏组织切片进行了验证。从反应体系角度来看，dextramer具有仅需少量MHC/肽复合物的优势。在本方案中，每个反应仅需0.75 µg的MHC/肽单体。此外，dextramer染色为一步反应，因为dextramer可与抗-CD4抗体共同孵育，整个流程从组织切片到染色完成可在一天内完成。相比之下，已发表的方案中 原位 使用传统四聚体染色通常涉及信号放大步骤，即利用针对荧光染料的二抗对荧光信号进行放大。因此，染色过程可能需要长达三天才能完成 <...

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致谢

本研究由美国心脏协会和儿童心肌病基金会（SDG2462390204001）以及美国国立卫生研究院（HL114669）提供资助。CM 获得了新泽西州心肌炎基金会颁发的博士后研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CFASigma Aldrich, St Louis, MO58814 °C 下保存
MTB  H37Rv 提取物 Difco Laboratories, Detroit, MI2311414 °C 下保存
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA1814 °C 下保存
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CV4 °C 下保存
雌性 A/J 小鼠 Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
雌性 SJL/J 小鼠Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok 无菌 1 ml 注射器BD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok 无菌 3 ml 注射器BD, Franklin Lakes, NJ309657
无菌针头，18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
无菌针头，27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
三通旋塞阀 Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Kerlix 纱布绷带卷 Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
琼脂糖，低熔点，分析级Promega corporation, Madison, WIV2111
Immunopure 正常山羊血清Thermo Scientific, Waltham, MA31873-20 °C 下保存
PE 染料标记的抗小鼠 CD4 抗体eBioscience, San Diego, CA 120041854 °C 下保存
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA192024 °C 下保存
Faramount 水性封片剂Dako, Carpinteria, CA10073021
锥形管（15 ml）BD Biosciences, San Jose, CA352099
锥形管（50 ml）BD Biosciences, San Jose, CA352070
24 孔平底组织培养板BD Biosciences, San Jose, CA356775
水彩 #2 画笔Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
普通显微镜载玻片，尺寸：3" x 1" x 1.2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
优质盖玻片，22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
一次性深底模具组织学盒Laboratory prodcust, Rochester, NYM-475-10
Loctite 超强胶Henkel Corporation, Westlake, OH1471879
剃须刀片Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MA4 °C 下保存
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Neopeptide, Cambridge, MA4 °C 下保存
MHC II 类分子/IAs PLP 139-151 或 TMEV 70-86 右旋糖酐微球（APC 染料标记）4 °C 下保存
MHC II 类分子/IAk Myhc 334-352 或  RNase 40-56 右旋糖酐微球（APC 染料标记）4 °C 下保存
右旋糖酐偶联 SA-APCImmundex, Copenhagen, Demark4 °C 下保存
无菌手术剪刀和镊子INOX tool Corporation
微波炉GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 振动切片机Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  激光扫描共聚焦显微镜Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i 共聚焦显微镜Nikon Inc. Melville, NY

参考文献

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原位检测脑和心脏中使用主要组织相容性复合物II类右旋糖酐微球的自身反应性CD4 T细胞
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