通过主要组织相容性复合体II类右旋糖酐微球直接染色检测脑和心脏中自身反应性CD4 T细胞的方案已在本报告中描述。为实现全面分析，需采用一种可靠的方法来定量抗原特异性CD4+ T细胞 原位 也设计了该方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本报告展示了利用主要组织相容性复合体（MHC）II类右旋糖酐微球（dextramers）检测自身反应性CD4 T细胞的方法 原位 在SJL小鼠的髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）139-151诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）以及A/J小鼠的心肌肌球蛋白重链-α（Myhc）334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）中。使用了两组不同的右旋糖酐微球（dextramer）试剂组合，其中dextramers+ 细胞通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行分析：EAE，IAs/PLP 139-151 右旋糖酐微球（特异性）/抗 CD4 和 IAs/Theiler小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）70-86 dextramers（对照）/抗-CD4；以及EAM，IAk/Myhc 334-352 右旋糖酐聚合物/抗 CD4 和 IAk/牛核糖核酸酶（RNase）43-56 右旋糖酐微球（对照）/抗 CD4。对EAE小鼠脑组织切片进行激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）分析，结果显示存在CD4阳性和PLP 139-151右旋糖酐微球阳性细胞，但未检测到TMEV 70-86右旋糖酐微球阳性细胞，表明PLP 139-151右旋糖酐微球的染色具有特异性。同样，对EAM小鼠心脏组织切片的分析也显示存在Myhc 334-352右旋糖酐微球阳性细胞，但未检测到RNase 43-56右旋糖酐微球阳性细胞。+ 细胞与预期一致。此外，还设计了一种全面的方法，用于定量分析“Z”系列图像中抗原特异性CD4 T细胞的频率。
引言
使用主要组织相容性复合体（MHC）II类四聚体来检测抗原特异性CD4 T细胞一直是一项挑战1-7。为了提高MHC II类四聚体的检测灵敏度，研究团队开发了新一代四聚体，称为“dextramer”（右旋糖酐四聚体）8。Dextramer含有右旋糖酐骨架，其上偶联了多个链霉亲和素-荧光素分子，从而使多个带有肽段、生物素化的MHC单体能够结合到一个右旋糖酐分子上9。因此，这种包含多个MHC-肽复合物的大型MHC dextramer聚集体可与多个T细胞受体（TCR）相互作用。
该研究团队近期为多种自身抗原制备了dextramer，并证实dextramer的检测灵敏度较四聚体（tetramer）提高了约五倍。 8实验系统包括：在SJL小鼠中通过蛋白脂质蛋白（proteolipid protein, PLP）139-151诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）；在C57Bl/6小鼠中通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG）35-55诱导的EAE；以及在A/J小鼠中通过心肌肌球蛋白重链-α（cardiac myosin heavy chain-α, Myhc）334-352诱导的实验性自身免疫性心肌炎（EAM）。本研究展示了利用PLP 139-151和Myhc 334-352葡聚糖微球（dextramers）检测抗原特异性CD4 T....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：
所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并经美国内布拉斯加州林肯市内布拉斯加大学林肯分校批准。
1. EAE 的诱导
- 为诱导EAE，按照文献11所述方法制备肽/完全弗氏佐剂（CFA）乳剂，并作如下修改：步骤1.1：将PLP 139-151溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成浓度为1 mg/ml的溶液。步骤1.4：每只动物使用含100 µg PLP 139-151的200 µl CFA乳剂。步骤1.4.1：为免疫十只动物，取1 ml PLP 139-151（1 mg/ml溶于1×PBS）与等体积CFA混合，共制备2 ml乳剂。步骤1.5：将200 μl乳剂分次皮下注射至5至6周龄雌性SJL/J小鼠的两个腹股沟区（每处约75 μl）和胸区（约50 μl）。步骤1.7和1.8不适用于EAE的诱导。
2. EAE 小鼠的临床评分及大脑组织的采集
- 从免疫后第9天开始，每日监测动物临床症状的出现情况，并对疾病严重程度进行评分：0 - 健康；1 - 尾巴无力或后肢无力，但不同时出现；2 - 尾巴无力且后肢无力；3 - 后肢部分瘫痪；4 - 后肢完全瘫痪；5 - 濒死或死亡12。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本报告中， 原位 通过使用MHC II类右旋糖酐微球直接染色来检测抗原特异性的自身反应性CD4 T细胞。新鲜切割的脑组织切片来源于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠，并用含有PLP 139-151（特异性）或TMEV 70-86（对照）右旋糖酐微球及抗-CD4抗体的混合物进行染色。上图面板中 图1 显示用PLP 139-151葡聚糖微球（红色）和CD4抗体（绿色）共染色的脑组织切片的激光扫描共聚焦显微镜分析结果，其中双阳性细胞呈黄色。而在用TMEV 70-86（对照）葡聚糖微球染色的切片中（底部图），未见此特征。共染色（dext+ CD4+) 细胞在周边区域显示出点状斑点。对脑组织切片中PLP特异性T细胞进行定量分析的步骤如下（图 21）制备三对切片，每对中的一张切片分别用抗CD4抗体和PLP 139-151葡聚糖微球单独染色；同样，另取三张切片用抗CD4抗体和对照（TMEV 70-86）葡聚糖微球染色。2）在特定切片上，根据抗CD4染色结果识别出10至15个炎性病灶。3）从每个病灶依次自上而下采集一组.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
与MHC I类四聚体不同，MHC II类四聚体在常规应用中的使用仍具挑战性，尤其是在计数低亲和力自身反应性CD4 T细胞前体频率方面，部分原因在于其依赖细胞活化状态 6,15-17最近，通过开发出新一代的四聚体——“dextramer”，我们得以规避这一问题，从而能够检测针对多种自身抗原的抗原特异性CD4 T细胞，例如PLP 139-151、MOG 35-55和Myhc 334-352 8在本报告中，首次利用MHC II类右旋糖酐多聚体来检测和定量自身反应性CD4 T细胞 原位 已使用EAE小鼠的脑组织切片和EAM小鼠的心脏组织切片进行了验证。从反应体系角度来看，dextramer具有仅需少量MHC/肽复合物的优势。在本方案中，每个反应仅需0.75 µg的MHC/肽单体。此外，dextramer染色为一步反应，因为dextramer可与抗-CD4抗体共同孵育，整个流程从组织切片到染色完成可在一天内完成。相比之下，已发表的方案中 原位 使用传统四聚体染色通常涉及信号放大步骤，即利用针对荧光染料的二抗对荧光信号进行放大。因此，染色过程可能需要长达三天才能完成 <.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究由美国心脏协会和儿童心肌病基金会（SDG2462390204001）以及美国国立卫生研究院（HL114669）提供资助。CM 获得了新泽西州心肌炎基金会颁发的博士后研究奖学金。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | 4 °C 下保存 |
| MTB H37Rv 提取物 | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | 4 °C 下保存 |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | 4 °C 下保存 |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | 4 °C 下保存 |
| 雌性 A/J 小鼠 | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| 雌性 SJL/J 小鼠 | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok 无菌 1 ml 注射器 | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok 无菌 3 ml 注射器 | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| 无菌针头，18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| 无菌针头，27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 三通旋塞阀 | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix 纱布绷带卷 | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| 琼脂糖，低熔点，分析级 | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure 正常山羊血清 | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | -20 °C 下保存 |
| PE 染料标记的抗小鼠 CD4 抗体 | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | 4 °C 下保存 |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | 4 °C 下保存 |
| Faramount 水性封片剂 | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| 锥形管（15 ml） | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| 锥形管（50 ml） | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24 孔平底组织培养板 | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| 水彩 #2 画笔 | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| 普通显微镜载玻片，尺寸：3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| 优质盖玻片，22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| 一次性深底模具组织学盒 | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite 超强胶 | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| 剃须刀片 | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | 4 °C 下保存 | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | 4 °C 下保存 | |
| MHC II 类分子/IAs PLP 139-151 或 TMEV 70-86 右旋糖酐微球（APC 染料标记） | 4 °C 下保存 | ||
| MHC II 类分子/IAk Myhc 334-352 或 RNase 40-56 右旋糖酐微球（APC 染料标记） | 4 °C 下保存 | ||
| 右旋糖酐偶联 SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | 4 °C 下保存 | |
| 无菌手术剪刀和镊子 | INOX tool Corporation | ||
| 微波炉 | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 振动切片机 | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i 共聚焦显微镜 | Nikon Inc. Melville, NY |
参考文献
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
