从唾液中提取DNA可提供易于获取的高分子量DNA，且几乎不发生降解或片段化。本方案优化了唾液的采集、储存及DNA提取参数，所获得的DNA在质量和数量上均能满足对质量要求较高的下游DNA检测应用。
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摘要
摘要
在人类遗传学研究中，DNA 的首选来源是血液或源自血液的细胞系，因为这些来源能够提供大量高质量的 DNA。然而，从唾液中提取的 DNA 同样可以获得高质量且几乎无降解或片段化的 DNA，适用于多种 DNA 检测，同时无需专业采血人员，甚至可通过邮寄方式收集样本。然而，目前尚无文献报道适用于下一代测序的唾液 DNA 采集/提取方案。本方案优化了唾液采集/储存及 DNA 提取的各项参数，使其 DNA 的质量和数量均达到最高标准，可用于包括微阵列基因分型和下一代测序在内的各类 DNA 检测。
引言
在人类遗传学研究中，获得高质量的DNA对于疾病致病基因的发现至关重要。尽管血液采集需要侵入性操作且成本高于唾液采集，但由于其可用于建立永生化细胞系以获得无限的DNA来源，或用于功能研究的诱导多能干细胞（iPSCs），因此更受青睐；有时在无法获得细胞系的情况下也会使用血液DNA。然而，血液采集需要经过培训的采血技术人员，且血液样本的半衰期比唾液短1。相比之下，唾液DNA的获取成本更低、操作更简便，因为唾液可由受试者自行采集并通过邮寄方式寄送，无需专业采血人员参与，从而显著扩大了潜在受试人群的范围，不再局限于医院和实验室的服务区域2。当受试者可以选择提供唾液样本而非血液时，研究的入组率可能得到提高3, 4。尽管已有大量研究表明，全唾液（平均每毫升含4.3 × 105个细胞）在DNA检测方面的适用性优于早期未收集足够量唾液的口腔拭子方法2, 3, 4, 5, 6，但人们对唾液来源DNA的产量和质量仍存顾虑，这可能限制了其广泛应用。目前已有一些文献证实，从全唾液提取的DNA适用于包括基于微阵列在内的基因分型应用8, 9, 10，但尚无研究评估其在下一代测序（NGS）中的表现。本全唾液DNA提取方案的优化目标是：在使用常规试剂和耗材、易于实验室实施的前提下，以经济有效的方式最大化DNA的产量和质量，以满足遗传学研究的需求。
从唾液中提取DNA需要经过多个步骤：1）样本采集与保存，2）细胞裂解，3）RNase处理，4）蛋白质沉淀，5）乙醇沉淀，6）DNA重悬。此前所述的DNA稳定缓冲液2无需修改即可有效发挥作用。本研究未对RNase处理和DNA重悬步骤进行优化。针对其余每个步骤，识别出若干可能影响得率的变量。每个变量均单独进行调整，并通过统计学方法评估其对得率和质量的改善效果。对于被证实可提高得率和/或DNA质量的变量，将其最优值纳入最终的实验方案中。
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方案
注意：所有受试者在提供唾液样本前均签署了知情同意书，符合全美儿童医院关于人类受试者处理指南的规定。
1. 唾液采集与保存
- 在采集唾液之前，让受试者用水漱口，并在采样前30分钟内避免进食或饮水，以确保其口腔内无食物或其他外来物质。
- 打开一个含有2.5 ml DNA稳定缓冲液2的15 ml离心管，注意避免触碰管盖或管内壁，然后让受试者将2.5 ml唾液吐入缓冲液中。注意：采集的唾液量超过2.5 ml可能导致样本与DNA稳定缓冲液的比例不足，从而引起样本降解；采集唾液过少则会降低本方案的预期得率。为评估采集体积，可使用管壁上的刻度线。
- 盖紧管盖，通过倒置混匀直至混合物均匀，无需剧烈震荡。样本可短期存放于室温，或长期存放于4 °C（>3个月）。
2. 初始准备与细胞裂解
- 开始提取前，将水浴加热至 37 °C，并准备一个冰桶。每个待提取样品需要三个 15 ml 的锥形离心管。这三个离心管将分别用于盛装细胞和蛋白沉淀、最终提取的基因组 DNA，以及异丙醇和乙醇上清液。
- 从储存处取出样品，反复倒置数次，然后以中等速度涡旋振荡 15 秒。
- 将 2.5 ml 样品加入一个洁净的 15 ml 离心管中，再加入 5 ml 细胞裂解液。通过倒置混合 50 次，并在室温下孵育 30 分钟。
3. RNA 去除
- 加入40 μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液，在37 °C孵育15分钟。
- 将样品从37 °C水浴中取出，在冰上冷却3分钟。
- RNase A孵育结束后，将水浴温度升至65 °C，用于后续实验步骤中的DNA再水合步骤。
4. 蛋白质和脂质去除
- 加入50 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K溶液，反复倒置混匀数次，于室温孵育至少30分钟。注意：本步骤可作为本实验方案的暂停点。加入蛋白酶K溶液后，样品可在4 °C保存，直至完成提取。研究表明，在4 °C保存不超过24小时对提取得率或DNA质量无显著影响。此阶段的长期保存效果尚未评估。
- 加入1.7 ml蛋白质沉淀溶液，高速涡旋振荡20秒，然后将样品置于冰上10分钟。
- 样品在冰上冷却10分钟后，于4 °C以3,000 × g离心10分钟。沉淀的蛋白质必须形成紧密的沉淀块方可继续后续操作。若沉淀不紧密或溶液仍浑浊，可将样品再于冰上冷却5分钟，并重复离心步骤。样品必须始终保持在冰上，以确保形成紧密的沉淀。
5. 基因组DNA的分离与纯化
- 取一个洁净的 15 ml 离心管，用移液器加入 5 ml 异丙醇和 8 μl 浓度为 20 mg/ml 的纯甘油溶液。
- 将步骤 4.3 中含有基因组 DNA 的上清液倒入含有异丙醇和甘油溶液的离心管中，注意留下已沉淀的蛋白质沉淀物。加入上清液后，轻轻颠倒混合样品 50 次，然后在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 30 分钟。
- 缓慢将上清液倒入另一个洁净的 15 ml 管中。去除上清液后，加入 1 ml 70% 乙醇，通过缓慢摇动并轻轻使乙醇多次流过沉淀物以洗涤沉淀。将乙醇保留在管中。
- 初次洗涤后，在 2,000 × g 和 20 °C 条件下离心样品 1 分钟。此离心步骤可在 4 °C 或 20 °C 下进行，温度对此步骤无显著影响。
- 在沉淀物完成初次洗涤和离心后，缓慢倾出管中的乙醇洗涤液并弃去，然后重复步骤 5.3 和 5.4 进行第二次洗涤。
- 第二次洗涤去除上清液后，让沉淀在空气中干燥 15 分钟。
- 如果样品尚未完全干燥，继续风干 15 分钟。
6. 基因组DNA的重悬
- 样本干燥后，加入 300 μl Tris-EDTA 以重悬干燥的基因组 DNA 沉淀。
- 以中等速度涡旋振荡样本 5 秒 ，然后置于 65 °C 水浴中孵育 1 小时。
- 从水浴中取出样本，在室温下过夜孵育。
注意：所使用的所有产品和试剂均列于材料表以及表 4中。
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结果
为确定DNA提取的最佳参数，进行了一系列配对的DNA提取实验。将一份唾液样本分成两份，每份分别用某一变量的两个可能值进行检测。每种配对测试至少重复八次（例如，一份唾液样本被分装，用于测试提取时有无初始处理的差异 50 °C 孵育）。优化基于四个标准指标：总DNA得率、260/280比值、260/230比值，以及电泳后DNA的肉眼观察以评估片段化程度。未对所有变量组合的统计学交互作用进行评估（共169种组合），而是选择分别评估每个变量的边际效应。采用多因素重复测量方差分析（ANOVA）检验效应，并通过相应的回归方程估算效应值。所有显著效应汇总于 表1，以产量平均变化（ng/µl 每毫升唾液输入量）或DNA质量（260/280和260/230）。
通过以下方面优化了细胞裂解（步骤2）：1）在细胞裂解前是否进行50 °C孵育（1小时），以确保蛋白酶K的降解作用以及保存缓冲液介导的细胞裂解反应完全进行；2）是否进行涡旋振荡均质化步骤（中等速度，15秒）；3）裂解液孵育时间（5分钟与30分钟）。结果显示，30分钟的细胞裂解孵育时间使产量平均...
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讨论
本方案是一种经过优化的DNA提取方法，与标准方法相比，显著提高了高分子量DNA的得率，同时不损害DNA质量。其中对得率影响最关键的步骤是第5.2步，该步骤在乙醇沉淀过程中采用了比本文所综述的大多数已发表方案更长的离心时间，仅有一种未广泛传播的方案例外11。未检测到与此延长离心时间相关的DNA质量变化，表明从全唾液样本中可获得的大部分DNA未发生降解，且具有高分子量。
全唾液采集在样本质量方面存在一些局限性，例如可能存在外源性污染物，这需要在采集阶段尽量减少；此外，样本中蛋白质过多可能是潜在感染的征象。大量蛋白质或外源性污染物可能残留在最终提取的DNA中，从而导致定量不准确。如果怀疑在重悬后（步骤6）仍存在残留蛋白质或污染物，可从蛋白沉淀步骤开始进行样本纯化，试剂体积需根据样本投入量按比例调整。本实验方案的另一个局限性是操作步骤耗时较长。虽然可以平行处理多个样本，但建议同时进行的提取反应不超过24个。这一点在蛋白沉淀步骤中尤为重要，因为样本必须保持低温以确保形成紧密的沉淀，若同时处理超过24个样本，可能导致沉淀物有足够时间重新溶解。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院R01项目（DC009453，支持CWB）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 ml 离心管 | Fisher | 12-565-268 | |
| 细胞裂解液 | Qiagen | 158908 | |
| 蛋白酶K | Sigma | P6556 | |
| 蛋白质沉淀溶液 | Qiagen | 158912 | |
| 异丙醇 | Fisher | A416-4 | |
| 糖原 | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% 乙醇 | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) 缓冲液 | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) 溶液 | Fisher | 03-500-506 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher | BP166-100 | |
| 模拟涡旋混合器 | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R 离心机 | Eppendorf | 5811 000.010 |
参考文献
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重印与许可
