雄性附属腺体产物对腹足类软体动物产卵的影响

摘要

本视频实验方案展示了一种利用雌雄同体的淡水螺 Lymnaea stagnalis 研究精液对腹足类动物影响的方法。

摘要

在内受精动物中，精液通常由精子与精浆共同组成。精浆不仅为精子提供营养并激活其活性，其中的组分还可能影响雌性生理，从而提高精子供体的受精成功率。尽管已有大量研究报道了在雌雄异体物种中的此类效应，但在同时具有雌雄两性功能的雌雄同体动物中，相关研究仍较少。本视频实验方案介绍了一种用于研究软体动物精浆效应的方法，以同时具有雌雄功能的淡水螺类——大椎实螺 Lymnaea stagnalis 作为模式生物。实验过程以完整的前列腺提取物为例进行演示，但同样适用于单独测试精浆中的各个组分（i.e.，蛋白质、多肽及其他化合物）。通过记录产卵频率以及每次产卵团中的卵粒数量等更为精细的雌性生殖表现指标，可量化接收到的精液组分对产卵行为的影响。结果表明，精浆蛋白能够影响该雌雄同体物种的雌性生殖产出，凸显了其在性选择过程中的重要性。

引言

转移过程中，精子通常伴随着由雄性附属腺体产生的精液。虽然一些精液成分在滋养和激活精子方面发挥作用¹，但其他成分则会影响雌性生理，以提高提供精子的雄性的受精成功率^2-4。当一个物种具有高度滥交行为，并具备高效的精子储存和消化能力时，此类效应尤其会通过性选择被强化⁵。在这种条件下，提供精子的雄性之间会激烈竞争卵子的受精机会。尽管存在大量相关性证据表明精液物质对雄性受精成功具有重要作用，但直接证据仍较为稀少，且很少有研究深入探讨所涉及的生理变化和/或具体物质的细节⁶。

在雌雄异体的物种中（即，雄性和雌性；雌雄异体）在精液成分及其效应方面已有少数研究较为深入的模式物种。例如黑腹果蝇， 黑腹果蝇⁶, 疟疾蚊子， Anopheles gambiae⁷，以及赤拟谷盗 赤拟谷盗⁸这类精液研究在同时具有雌雄同体特征的物种中则要罕见得多。即个体同时具有功能上的雄性和雌性特征），尽管这种繁殖方式在动物界中十分普遍⁹最显著的雌雄同体动物附属腺体物质传递实例可能是陆生蜗牛射出所谓的“爱之箭”^2,10，其中物质通过精子供体的皮下注射转移^11,12, 即，而非与精子一同传递。但有许多同时性雌雄同体动物会将雄性附属腺体产物与精子一同传递，例如本研究中使用的模式物种——大池塘螺 Lymnaea stagnalis先前的研究已经表明，该物种雌性个体接受精液会影响其生殖产出。^13-15，并已鉴定出多种相关的精液蛋白^16,17.

本实验方案的整体目标是测试精液蛋白对腹足类软体动物产卵各项参数的影响，该方案扩展了Koene et al¹⁶ 报道的方法。首先，从标准化实验室培养的性隔离供体螺中解剖出前列腺（即雄性附属腺体，产生精液的腺体）。其次，从供体的精囊中收集精子，并配制不同的处理溶液。随后，将测试螺麻醉，并通过阴道内注射给予测试溶液（例如，仅前列腺提取物、前列腺提取物加精子、仅精子、仅载体介质）。之后，在标准条件下对这些测试螺进行数天至数周的观察，以记录其产卵情况。收集卵块，进行数字化扫描以计数并测量各项参数，然后分别放入独立的小瓶中孵化。约两周后，统计孵化出的幼螺数量并进行数字化扫描。所有卵块和幼螺的扫描图像均使用一款免费的图像分析软件包进行分析。

本实验方案使用大型池塘螺（Lymnaea stagnalis）的实验室品系，该品系在阿姆斯特丹的VU大学进行培育。该物种作为研究雌雄同体生物中性选择与繁殖问题的模式系统。该动物相对较大的体型使其在实验操作上具有很高的可及性。此外，由于该物种在多个生物学领域中被广泛用作模式生物，我们对其基本生物学特性已有较为深入的了解。本方法将有助于普遍性地研究由精液蛋白介导的性选择过程的相关问题。此外，由于这些生物属于同时性雌雄同体，还可进一步探讨此类蛋白在性别分离的物种中是否以相似和/或不同的方式发挥作用^16,17。

方案

1. 繁殖设施

1. 获取成年个体标本 Lymnaea stagnalis （L.）来自实验室培养物，例如VU大学的培养物。
2. 在育苗设施（软体动物养殖系统）和实验水箱中，保持低铜含量水体的温度为 20 °C，且水体持续交换。
3. 设置光照/黑暗周期为12小时:12小时。
4. 用于繁殖时，喂食成体蜗牛无农药的生菜 随意，用TetraPhyll（鱼食）薄片喂养幼体。根据年龄将螺类分开放置在不同的水族箱中饲养，从24小时内产下的卵块开始。
5. 蜗牛一旦从繁殖缸中移出便不再放回，以避免因短暂处于不同培养条件下而产生的影响，并防止伪重复。

2. 解剖

1. 将蜗牛隔离1 周，并喂养它们 随意摄取，以确保其拥有充足的精子和精液储备。
2. 准备一台体视显微镜、一个带固定针的解剖板、小型手术剪、粗镊子和细镊子、一支装有50 mM MgCl₂溶液的10 ml注射器₂ 溶液、注射针头（0.3 mm × 13 mm）以及一些纸巾。
3. 通过注射 MgCl₂ 处死一只蜗牛₂ 溶液（通常成年蜗牛需3 ml或更多，其壳长为31.6 ± 2.1 mm，湿重为2.89 ± 0.55 g）。以45°角将注射针头刺入足部，并持续轻柔施加压力进行注射，直至蜗牛放松并保持伸展状态（数秒内）。拔出注射针头，检查蜗牛是否已被安乐死（例如，通过检测触角回缩反射是否消失）。
4. 使用粗镊子沿贝壳的曲率小心去除外壳。进行到一半时，用镊子轻轻刮除将柱状肌与贝壳分离。沿贝壳的螺旋方向轻轻扭转，将蜗牛从壳中取出。
5. 将蜗牛置于解剖板上，用大头针固定足部后端。随后，用大头针穿过头部，并对蜗牛施加一定张力，以利于解剖操作。
6. 定位雌性生殖孔，该位置后续将作为解剖的参考点。
7. 使用手术剪和精细镊子，在外套膜边缘下方进行第一处切口，并向雌性生殖孔方向剪切。当剪刀的一侧刀刃插入体壁下方时，轻轻向上抬起，以确保仅切割体壁，而不损伤内部器官。继续在生殖孔上方朝头部方向沿直线剪开。
8. 定位前列腺（后方）和精囊（前方）。仔细解剖分离，并置于冰上保存。用这些组织制备含有精液和/或精子的测试溶液。使用生理盐水 Lymnaea 生理盐水（5.83 mmol/L） CaCl₂·2H₂O，3.76 mmol/L MgCl₂·6H₂O，42.69 mmol/L NaCl，37.53 mmol/L KCl）作为载体介质。
9. 收集存在于前列腺腺腔内的精液以及来自精囊的精子。随后，用镊子轻轻挤出其内容物并去除组织碎片，将二者分别悬浮于生理盐水中。样品置于冰上保存，并于同日使用。之后，将这些悬浮液混合，以制备不同的处理溶液。

3. 阴道内注射

1. 在开始阴道内注射操作之前，准备好硅胶外壳模具（定制为适合外壳尖端）、1 mm注射器、长度为10–12 cm且直径为1 mm的硅胶管、钝化注射针（0.3 mm × 13 mm）、粗镊子，以及同一支装有50 mM溶液的10 ml注射器 MgCl₂ 带有锐利注射针头的溶液装置。
2. 收集精子，某些处理中需将其加入精液（或单个精液蛋白）；生物学相关剂量为每次注射前列腺和精囊腺总量的1/3。
   注意：在代表性结果部分（图1) 一项包含三种不同处理的实验结果如下：对照组（载体培养基， 即，生理盐水）、单独的Ovipostatin（一种已鉴定的精液蛋白）以及伴随精子的Ovipostatin。此外，为估算其他物种中具有生物学意义的剂量，需测定近期交配个体与长期性隔离个体前列腺重量的差异¹⁶.
3. 为每种配制好的测试溶液准备1 ml注射器。将每种溶液分别装入注射器中，并确保内部无气泡。
4. 在每支注射器上安装钝头注射针。
5. 注射时使用直径为1 mm、最小长度为10 cm的硅胶管。
6. 小心地将硅胶管套在注射针头上，注意不要刺穿管子，并通过轻轻按压注射器排出管内的空气。
7. 按照第2.3点中的相同方案麻醉一只蜗牛。此次需确保注射的50 mM MgCl₂溶液不超过2-3 ml。₂.
8. 将蜗牛放入壳模中以保持其稳定位置。
9. 找到雌性生殖孔，其位于动物右侧、右触手前方，雄性生殖孔之前，呈明显的白色斑点状（该位置特征同样适用于其他种类的淡水螺）。确保操作视野无遮挡，便于接触。
10. 使用镊子夹住硅胶管末端，轻轻插入约2-4 mm 将硅胶管插入雌性生殖孔。
11. 小心施加压力，向注射器中注入0.03 ml的待测溶液。等待半分钟，使管内压力充分扩散至雌性生殖道后，再移除导管。
12. 将处理后的蜗牛放回其隔离容器中，在实验水箱中进行观察，并使其从镇静状态中恢复。

4. 生物测定

1. 为每只蜗牛标记编号以供识别，并测量其壳长。壳长是衡量个体大小的良好指标，在量化繁殖输出时具有重要意义。
2. 将每只蜗牛单独饲养于一个460 ml的容器中，容器需打孔以便与实验水箱进行水体交换。所有容器应正确放置，使孔洞朝向水流方向，以确保高效的水体交换。
3. 在生物测定期间，定期为蜗牛提供标准化量的生菜作为食物。使用圆形金属打孔器切割生菜。本方案中使用面积为19.6 cm²的生菜圆片，该大小接近蜗牛单日最大摄食量。
4. 使用刮刀的平面端收集卵块，并从容器壁上轻轻刮下卵块，再用勺状端收集卵块。
   注意：刚产出的不透明卵块不能用于扫描（通常在产卵后数小时内会变为透明）。对于本方案中的模式物种Lymnaea stagnalis，应每天检查卵块，因其每周可产2–3次卵块。其他物种的产卵频率可能有所不同。
5. 使用配备扫描仪驱动程序的（笔记本）电脑、平板扫描仪、标准毫米刻度尺、刮刀、转移培养皿和玻璃载片，对收集的卵块进行数字化扫描。
6. 将每个卵块放置在转移培养皿上，重复此操作直至培养皿放满。随后用纸巾轻轻吸干卵块表面水分，并按照在转移培养皿上的相同顺序将其转移至玻璃载片上。
7. 将每块载片翻转倒置（卵块将附着于玻璃表面），然后小心地将其放置在平板扫描仪上，紧邻毫米 刻度尺下方。施加适当压力以压平卵块，使卵粒均匀分布，确保所有卵均处于同一焦平面上清晰可见。在每块载片的两个边缘使用固定量的胶带固定，以保证所有卵块受压程度一致。
8. 调整扫描仪设置。需将分辨率调至最高，先进行预扫描，裁剪工作区域，并调整亮度与对比度，然后正式扫描卵块。
9. 将每个卵块分别放入已标记的20 ml玻璃小瓶中，用于后续发育和孵化。
10. 每隔一天更换一次孵化瓶中的水，以保持充足的溶氧量。换水方式应根据孵化幼体的数量和大小按以下顺序进行：倾倒法（无幼体孵出）、溢流法（开始孵化）、移液器吸取法（大量幼体孵出）。

5. 卵的测量与计数

1. 安装免费的图像分析软件 ImageJ（NIH，美国）及细胞计数插件。
2. 打开 ImageJ 以及一个电子表格程序 用于数据转录。然后在 ImageJ 中打开卵块的扫描图像。
3. 使用缩放工具导航至毫米 刻度线处进行定标。放大图像，调整窗口使 1 mm 刻度充满屏幕。使用直线工具在表示 1 mm 的两条线之间画一条线。进入“分析”菜单，选择“设置标尺”。在弹出菜单中，“测量长度”选项将显示，将“已知距离”设为 1，“长度单位”设为 mm。勾选“全局”选项，然后关闭窗口。
4. 通过进入“分析”菜单并选择“设置测量”来设定所需的测量参数（长度、宽度、周长），选择“面积”和“Feret 直径”（长度和宽度）。点击“确定”以确认并继续进行图像分析。
5. 测量卵时，放大需测量的第一个卵块中的一个卵。建议放大至 800%。然后使用椭圆工具在卵周围精确绘制一个椭圆形，按 ctrl+D 在图像上标记该轮廓（防止重复测量同一卵）。接着按 ctrl+M 记录该椭圆的测量参数（长度、宽度、周长）；弹出窗口将显示测量结果。
   注意：使用椭圆工具测量卵并不适用于所有物种。对于卵形状不规则的物种，应使用自由选择工具代替。
6. 根据需要测量尽可能多的卵，并将测量结果保存为 .xls 工作表。也可选择将数据直接复制到工作表中。
7. 随后使用计数器窗口对卵块内的卵进行计数，并将计数值手动输入工作表中。
8. 或者，可借助细胞计数插件对每个卵块中的卵进行单独计数。操作方法为：进入“插件”菜单，然后选择“分析”中的“细胞计数器”。细胞计数器窗口将弹出，勾选“保留原始”选项并点击“初始化”。新的计数器窗口出现后，从工具栏中选择十字光标工具，并在细胞计数器菜单中选择一种计数类型。在细胞计数器窗口中通过点击各个卵进行计数。在细胞计数器菜单中观察对应计数类型的总数。将该数值手动复制到电子表格中，或点击“结果”获取数据。
9. 如有需要，可通过添加多个计数类型，在一次计数过程中统计多个卵块。

结果

图1显示了在阴道内注射对照物质（生理盐水）、排卵抑制素（Ovipostatin）或排卵抑制素与精子共同注射后，产卵动物所占的百分比。每组处理的样本量 N = 15；详见 Koene et al.¹⁶ 中的详细信息和统计分析（来源：图3，Koene et al. 2010，PLoS ONE）。

图1. Ovipostatin 对Lymnaea stagnalis产卵团的影响。 该图显示了经阴道注射对照物质（生理盐水）、Ovipostatin 或 Ovipostatin 与精子共同注射后，产卵动物所占的百分比。每组处理的样本量 N=15；详见 Koene et al. 2010 的实验细节与统计分析。经许可转载自 Koene et al. 2010 PLoS ONE 5: e10117。

讨论

本方案展示了如何采集精液以及如何以具有生物学意义的方式对精液进行检测。尽管此处以前列腺提取物为例进行说明，但同样可采用该流程检测单一纯化精液蛋白的作用。显然，在此类实验中，必须始终设置适当的对照（如假处理组），以确保操作过程和/或载体介质不会影响所考察的参数^14,16。利用该方法，已有研究证实存在一种名为Ovipostatin的精液蛋白可介导产卵量的减少^14,16。该蛋白由前列腺产生，并在交配过程中随精子一同转移，是迄今在同时性雌雄同体生物中首个被完全表征的精液组分，且迄今为止未发现其与任何已知蛋白具有相似性。

发现Ovipostatin能减少受体个体的卵块产量，这与早期研究结果一致，表明精液中的物质可能影响产卵行为^13-15。通过转移具有生物学意义的剂量（见3.2¹⁶），可以明确证明是精液中的蛋白质而非精子本身介导了产卵减少的现象（图1）。鉴于通过自然交配反复接受精液会增加每个卵子的资源投入¹⁵，现在量化其他产卵相关参数变得尤为重要。本文所提供的实验方案为此类研究提供了必要的方法。尽管尚未发现Ovipostatin对受体所产卵子的孵化成功率有影响¹⁶，但可能存在其他精液蛋白与此蛋白协同作用。因此，在此背景下需要量化的参数除了产卵频率和卵子数量外，还应包括卵子大小、孵化时间、幼体发育状况及幼体体型。此外，还可考察其对雌性其他生理过程的影响，例如精子储存与利用，以及生殖资源在雌性和雄性功能之间的分配^14,17。显然，该方法对于在Lymnaea stagnalis及其他淡水螺类中深入研究上述后续问题具有重要意义。

总之，采用本实验方案的研究表明，在这些同时性雌雄同体生物中，转移的精液蛋白会影响受体雌性生殖表现。鉴于目前相关研究较少，这类现象在体内受精的雌雄同体生物中可能比现有科学文献所反映的更为普遍。尤其值得注意的是，已有研究证实，交配前的配偶选择和精子竞争在这些雌雄同体生物中具有重要作用¹⁴，这凸显了此类雄性附属腺体蛋白在此系统中受到性选择的潜力。最后，本研究有助于支持一个正在形成的观点，即精液蛋白对于同时性雌雄同体生物的重要性，与对雌雄异体物种的重要性相当。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鱼食薄片	TetraPhyll
体视显微镜
小型手术剪刀	WPI
粗镊子和细镊子	WPI
10 ml 注射器
注射针头（0.3 mm × 13 mm）
50 mM MgCl2
5.83 mmol/L CaCl2·2H2O
3.76 mmol/L MgCl2·6H2O
42.69 mmol/L NaCl
37.53 mmol/L KCl
双组分硅胶	Sylgard
1 mm 注射器
硅胶管（直径 1 mm）
钝化注射针头（0.3 mm × 13 mm）
离心管	Eppendorff
460 ml 带孔容器
金属打孔器（19.6 cm2）
刮勺/药匙
（笔记本）电脑
平板扫描仪
毫米刻度尺
转移培养皿
玻璃瓦片
20 ml 玻璃小瓶