微型涡辅助电穿孔的顺序传递分子

Summary

微流体涡辅助电平台的连续交付的多个分子进入相同的细胞群与精确，独立的剂量控制开发。该系统的大小基于靶细胞纯化步骤前电穿孔辅助以增强分子递送效率和处理的细胞活力。

Abstract

电越来越受到重视，在过去几年中，因为它是一个非常强大的技术引入物理不可穿透物外源性分子探针进入细胞。这项工作汇报微流体电平台，能够执行多种分子运送到哺乳动物细胞具有精确和分子有关的参数控制。该系统的分离的细胞具有均匀尺寸分布的能力允许在每个给定的电场强度电穿孔效率的变化少;因此，提高样品的可行性。此外，它的过程可视化特征允许观察在实时荧光分子的吸收过程，其允许迅速分子递送参数的调整在原位对提高效率的。来显示报告平台的广大的能力，大分子具有不同尺寸和电荷的（ 例如，右旋糖酐具有3000和70000沓MW）为传送到转移性乳腺癌细胞具有高输送效率（> 70％）对所有测试的分子。该开发平台已经证明了自己的潜力，在研究领域，其中片内电穿孔技术是有益的扩展使用。

Introduction

在最近几年，使用电脉冲，以促进胞内递送的细胞外分子已经成为一种有吸引力的操纵哺乳动物细胞的方法^。1此过程中，也被称为电穿孔，可逆permeabilizes细胞膜，允许固有膜不可渗透的分子，以获得到细胞的细胞内环境。因为几乎所有的分子可以在任何类型的采用电穿孔的细胞的膜通过临时创建的孔被引入到细胞溶质中，该技术已被报告为更可再现的，普遍适用的，并且比其它的方法包括病毒介导的，化学更高效和光学方法^。2-3这一技术已被用来引入荧光分子^，4种药物⁵和核酸^6-7，同时保持细胞存活和完整性。考虑到这些好处，电已被批准为一个共同的劳动用于DNA转染atory技术， 体内基因治疗⁸和细胞疫苗接种研究。它是，但是，仍然难以常规电穿孔系统，可同时实现实用的效率和可行性与大的异质性大小的样品，因为需要成功电穿孔的电场强度密切的细胞的直径相关。此外，这些系统不允许的多个分子的量的精确控制被适当传递到依赖散装随机分子递送过程^。9为了解决这些问题，许多组织已经开发微流体电平台，将提供较低的穿孔电压的优点，更好的转染效率，大量减少细胞死亡，并有能力提供多分子。由于微型电系统，其电极间距小脚印^10-13这些优点能够成为可能长度为亚毫米，显着减少所需的成功交付电压。此外，这些微型电系统可以实现均匀的电场分布，并迅速消散产生的热量，产生降低细胞死亡率，同时提高配送效率。这些芯片进一步透明材料的运用使得原位观察电过程中的提示参数修改^。2,12然而，精确的剂量控制和molecular-和蜂窝相关的参数控制，需要新的研究和治疗应用^{，6， 14-16}仍然没有得到解决。

这项工作提出了一种微流体涡流辅助电穿孔系统，能够提供多种分子依次进入靶细胞的预先选定的相同人口。细胞均匀分布在使用之前报道SI隔离之前，电泽选择性捕获机制^。17-18通过具有粒度分布均匀，变化较少的电效率和每个人实现给定的电场强度增强生存能力^。19此外，不断搅拌用微型涡被困细胞允许在整个统一发货分子整个细胞质中，与该结果相一致以前报道使用另一个涡旋辅助电平台²⁰为了证明这个系统将适用于范围广泛的生物应用中普遍使用的分子，具有宽范围分子量的大分子递送到转移性乳腺癌细胞。此外，实时过程监控的帮助下，这项工作提供了更多的证据来制止有关的分子传递的机制，长期的辩论中electrporation，主要是电泳介导的抗扩散介导的¹⁴ 与其他电穿孔系统，该平台独一无二地提供精确的多分子递送，高分子递送效率，最小的细胞死亡，大小和递送分子的电荷的跨度很广，以及实时可视化的电穿孔的组合优势流程。考虑到这些功能，开发电系统具有实用潜力的多功能工具细胞重编程研究^{，6,14,21-22}给药应用^10,19和应用需要进行深入的了解电的分子传递的机制。

Protocol

1，细胞的制备

1. 板1×10的转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的体积每组织培养的T75烧瓶10毫升在Leibovitz的L-15培养基补充有10％（V / V）胎牛血清和1 ^5个细胞/毫升％青霉素 - 链霉素。
2. 培养MDA-MB-231细胞在潮湿的培养箱中在37℃下用0％CO ₂环境中。
3. 收获细胞用于实验接种后第2天通过用细胞用0.25％胰蛋白酶-EDTA进行2分钟，并通过加入8毫升生长培养基的灭活胰蛋白酶的酶活性。
4. 沉淀细胞离心5分钟，在200×g下，重悬在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，1，不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +），}以5×10 ^5个细胞/ ml的终浓度。

2，设备的设计与制造

注：本面膜，母模捏造和微封装过程要一个干净的房间内进行的，而聚二甲基硅氧烷（PDMS）微铸造工艺可以定期实验室工作台进行。

1. 设计一个微流体装置， 如图1与AutoCAD。该装置应包括具有多个喷射口，粗过滤器和两个平行的直的矩形惯性聚焦通道的入口（L = 7毫米，W = 40微米，和H = 70微米）。通孔的铝电极个人直通道由5个电室，其中放置800微米外（W _C = 400微米）有两个。两个横向相邻的电穿孔室共用孔用于负极。两个直的通道合并成一个出口处的电穿孔区域的下游。
2. 微型图案CAD文件转换为使用LinkCAD一个GDSII文件。写微图案上5“×5”光掩模坯使用激光面膜作家。通过下面的制造商的方案开发的掩模。注：面膜的开发过程，包括光致抗蚀剂显影，蚀刻铬和抵制搬迁。另外，微图案印在高分辨率的透明度（> 20000 DPI）可从第三方厂商购买和使用作为光掩模。在光掩模最终微观特征应是透明的负光致抗蚀剂的极性匹配。
3. 使用标准软光刻技术²³用4英寸的硅晶片上形成负光致抗蚀剂纺涂层以2000rpm到具有70微米的最终厚度制造该设备设计的铸造模具。
4. 预烘和负光致抗蚀剂的晶片20分钟，在95℃下。
5. 与晶片接触 ​​的掩模，并使用掩模对准器暴露到UV光源（17.4毫焦/厘米^2）为80秒。
6. 制定4分钟的SU-8开发者暴露的晶片。
7. 测量发达的抗蚀剂厚度使用表面轮廓。
8. 严格地混合以10:1比例的弹性体与固化剂（有机硅弹性体盒）和上铸型浇注混合物以生成PDMS复制品。脱气浇铸弹性体30分钟，并固化该铸塑模具用脱气的弹性体在烘箱中于70℃下搅拌2小时。
9. 分层固化的PDMS副本与模具和冲压孔用销钳入口，出口和电极插入微图案。注：针钳的正常切削刃直径应0.76毫米，足以紧紧地抱着PEEK管（外径32“）和铝电极（0.029 OD”）代替。
10. 创建封闭的微流体通道由接合PDMS复制品，以在氧等离子体清洁器在75瓦和500毫乇，分别射频功率和氧分压处理7秒的载玻片上。

3，流动实验

1. 插入铝电极（0.029“OD）和一个出口的PEEK管（32”OD）为通过在所述微通道的孔的指定地点（参见图3B）。
2. 连接的电气设备¹⁸负责产生高电压的短方波脉冲的铝电极（ 见图3C），这些在接触中的PDMS模具流动的解决方案。注：该设备应包括一个脉冲发生器和一个内部内置高电压放大器^18。
3. 制备4的50ml离心管中分别含有的DPBS，溶液与细胞和生物分子，并且每个管连接到连接到所述气动流控制系统的各自的小瓶保持器（ 见图^3A）。18
4. 连接入口PEEK管从药瓶持有者成在微流体装置中的各个进气孔。
5. 为了有电动呸设置方波脉冲，V的大小，以100伏LD强E = V / _L E，整个电室相当于0.7千伏/厘米。请注意：在这里，L _e为两点，其中正电极和负电极是在与流动溶液接触之间的距离（参见图1）。
6. 将压力调节到40磅。注：单个手动调节氮源用于均匀加压所有样品瓶和高速歧管采用采用定制的LabVIEW软件，及时启动个性化解决方案的端口¹⁸
7. 对于阀门控制，打开标阀门亚军的定制LabVIEW软件，单击运行，从经营资格的下拉菜单。
8. 通过点击每个相应的阀门图标打开阀门。注：该阀应的图标变成绿色，当它被激活。点击活动图标将停用并关闭阀门。关闭阀门图标应该变成灰色。
9. 打开阀门的DPBS水库（即，洗涤液），以素所需的稳定细胞俘获涡流产生1.5分钟的流速。
10. 从洗涤溶液中的细胞溶液以捕获细胞在电穿孔室中，持续30秒（ 即 ，小区捕获步骤）切换活动溶液端口。
11. 通过该装置同时向细胞俘获步骤流既洗涤和细胞溶液，持续10秒之前，以确保在溶液中切换步骤不间断流动。注：此简短的联合流程的步骤应重复在每个解决方案切换的步骤。
12. 把洗涤端口上和为了除去非截留污染细胞冲洗设备，持续20秒。
13. 注入含有目的插入设备（3000沓中性和阴离子葡聚糖分子或1.5毫克/毫升70000沓中性葡聚糖分子的0.2毫克/毫升）的第一分子的溶液。
14. 及时注射后可申请五短脉冲（ΔT= 30毫秒，2秒间隔）分子溶液并监测实时使用示波器所施加的电脉冲的幅度和持续时间。
15. 重复步骤3.10的次数的额外分子的数量来提供。为每个分子递送，孵育细胞为100秒，在分子的溶液，然后用100秒以除去过量的分子的洗涤溶液冲洗该装置。
16. 通过降低低于5磅的操作压力释放的细胞在96孔板中用于下游分析。注：大约100μl用100细胞溶液从每个释放收集。
17. 运行实验步骤3.9至3.16三次收集到足够的细胞用于流式细胞仪。
18. 离心96孔板中含有处理细胞5分钟，在228×g下。
19. 删除含有过量荧光分子上清。
20. 重悬细胞DPBS流式细胞仪分析。
21. 称重传感器在流式细胞仪分子üptake效率​​分析。

Results

所开发的并行微电穿孔交付大分子具有不同尺寸和电荷为生活转移性乳腺癌细胞。成功的分子递送定性通过监测电穿孔的轨道细胞原位的荧光强度来确定，并通过流式细胞仪分析定量测量证实， 图4A显示了90％的经处理的细胞摄取的70000沓中性葡聚糖。对于统计分析，对每个荧光强度阈值的建立，使得未处理的活细胞中，大部分（> 99％）被计数低于阈值（参见图4 的（c））。的效率被定义为单元的数目之比成功占用感兴趣的分子来处理的细胞的总数。 图4B示出了效率基本上不取决于分子重量或电荷（P> 0.1）。所有被测试的葡聚糖分子被递送到与效率大于70％的细胞溶胶。此外， 图4D显示出已成功用56％的使用阴离子和中性葡聚糖具有相同的分子量（MW = 3000道尔顿）的双分子递送效率进行连续的分子传递。比以前报道的系统¹⁸中的当前系统能够处理的细胞具有10倍更高的吞吐量和多分子递送效率和（，82％和70％的阴离子和中性葡聚糖分别）这种改进并不影响单分子递送。

Discussion

与新的并行电平台，10倍的增强吞吐量和多分子递送效率，除了所有的先前开发的单室型系统提供的优点来实现^。18之前提供的优点包括：（i）预净化的靶细胞与活力增强粒度分布均匀，（ⅱ）精确和个别分子的剂量控制，以及（iii）低操作电流。荧光标记的葡聚糖被选择作为感兴趣的分子，因为它们在很宽范围的分子量，缀合的荧光团的类型和电荷的容易获得的。这些大分子都适合这样的研究，因为他们是天生防渗膜对活体细胞和不显示细胞毒性。荧光右旋糖酐，培养时间为²⁴最佳浓度，以及电参数，确定了当前系统之前吨澳电的实验。优化过程中是相当简单和有效的，由于该平台的能力，以监测实时的分子吸收过程。这个过程的可视化，如果少到没有知识的电参数的分子或细胞类型正在测试非常有利的。温育时间对测试的所有分子被设定为100秒通过的细胞俘获在所有10个室呈现实时检测的荧光强度信号，表示完成分子递送成功的。注意，这不是必需的分子递送的最小温育时间。

有一种关于使用电，分子分娩过程中争论由来已久无论是通过扩散^4,19,25或电泳单独调节^。26鉴定分子...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 癌细胞系	典型培养物保藏中心 （ATCC）	HTB-26
莱博维茨's L-15 培养基	细胞，Mediatech， Inc.	10-045-CV
胎牛血清 （FBS）	Gibco， Life Technologies	16000-044
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Cellgro， Mediatech， Inc.	21-030
胰蛋白酶	Gibco，Life Technologies	25200-056
流式细胞仪 easyCyte HT	Millipore	0500-4008
氧气等离子体清洁剂	Technics Micro-RIE
Dektak 6M 表面轮廓仪	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 有机硅弹性体KIT	道康宁
压缩氮气	Airgas	NI 300
高压调节器	McMaster-Carr	6162K22
下游调节器	McMaster-Carr	4000K563
高速 3/2 通-8 阀组	Festo
内联止回阀	Idex Health and Science	CV3320
5/32" 外径 x 3/32" 内径 聚氨基甲醛管	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" 外径 X 0.17" 内径 聚氨基甲醛管	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK 管	Festo	P1533
1/32" PEEK 管	Idex Health and Science	P1569
PEEK 管接头	Idex Health and Science	P881
发生器	HP	8110A
铝丝	Bob Martin公司	6061铝
示波器	Agilent	DSO3062A
50 ml离心管	VWR	21008-178
15 ml离心管	VWR	21008-216
T75培养瓶	VWR	82050-862
右旋糖酐，四甲基罗丹明，3,000 MW，阴离子	Gibco，Life Technologies	D3307
右旋糖酐，四甲基罗丹明，70,000 MW，中性	Gibco，Life Technologies	D1819
右旋糖酐，德克萨斯红，3,000 MW，中性	Gibco，Life Technologies	D3329