用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

摘要

开发了一种微流控涡旋辅助电穿孔平台，可对相同细胞群体依次递送多种分子，并实现精确且独立的剂量控制。在电穿孔前进行的基于尺寸的目标细胞纯化步骤，有助于提高分子递送效率和处理后细胞的存活率。

摘要

电穿孔近年来受到越来越多关注，因为它是一种将非通透性外源分子探针物理导入细胞的极为强大的技术。本研究报道了一种微流控电穿孔平台，能够以精确且分子依赖性的参数控制，向哺乳动物细胞递送多种分子。该系统能够分离出大小分布均一的细胞，从而在给定电场强度下减少电穿孔效率的差异，提高样品存活率。此外，其过程可视化功能可实现对荧光分子摄取过程的实时观察，从而允许及时调整分子递送参数。 原位 以提高效率。为了展示所报道平台的广泛能力，选用不同大小和电荷性质的生物大分子（例如， 相对分子质量为 3,000 和 70,000 Da 的葡聚糖被高效递送至转移性乳腺癌细胞>所有测试分子的细胞存活率均超过70%。该平台已证实其在拓展片上电穿孔技术具有应用潜力的研究领域中的使用价值。

引言

近年来，利用电脉冲促进细胞外分子进入胞质已成为操控哺乳动物细胞的一种有效手段。¹ 该过程也称为电穿孔，可逆性地使细胞膜通透化，从而使原本无法透过细胞膜的分子得以进入细胞内的环境。由于几乎任何类型的分子均可通过电穿孔在细胞膜上暂时形成的孔道导入各类细胞的细胞质中，因此该技术被报道比病毒介导、化学和光学等其他方法更具可重复性、普适性和高效性。^2-3 该技术已被用于引入荧光分子，⁴ 药物⁵ 和核酸^6-7 在保持细胞存活和完整的同时，鉴于这些优势，电穿孔已被采用为一种常见的实验室DNA转染技术， 体内 基因治疗⁸ 以及细胞疫苗研究。然而，传统的电穿孔系统在处理尺寸异质性较大的样本时，仍难以同时实现高效的转染效率和细胞存活率，因为成功电穿孔所需的电场强度与细胞直径密切相关。此外，由于依赖于整体性的随机分子递送过程，这些系统无法精确控制多种分子的递送量。⁹ 为了解决这些问题，许多研究团队开发了微流控电穿孔平台，该平台具有穿孔电压较低、转染效率更高、细胞死亡率显著降低以及能够递送多种分子等优势。^10-13 这些优势的实现得益于微尺度电穿孔系统的小型化设计，其电极间距为亚毫米级，显著降低了成功递送所需的电压。此外，这些微尺度电穿孔系统能够实现均匀的电场分布，并快速消散产生的热量，从而在提高递送效率的同时降低细胞死亡率。采用透明材料制备这些微芯片还可进一步实....

方案

1. 细胞准备

1. 在每瓶组织培养T75培养瓶中加入10 ml Leibovitz L-15培养基（含10% (v/v) 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素），接种转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，细胞密度为1×10⁵ 个细胞/ml。
2. 将MDA-MB-231细胞置于37 °C、湿度饱和、0% CO₂的培养箱中培养。
3. 接种后第2天进行实验，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理细胞2分钟消化细胞，随后加入8 ml完全培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。
4. 将细胞在200 × g离心5分钟收集细胞沉淀，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS，1×，不含Ca²⁺和Mg²⁺）重悬，调整细胞浓度至5 × 10⁵ 个细胞/ml。

2. 装置设计与制备

注意：掩模、主模具制备以及微通道封装过程必须在洁净室中进行，而聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的浇铸过程可在普通实验台面上完成。

1. 使用 AutoCAD 按照图1所示设计一种微流控装置。该装置应包含一个具有多个注射端口的入口、粗滤器以及两条平行的直矩形惯性聚焦通道（长度 L = 7 mm，宽度 W = 40 μm，高度 H = 70 μm....

结果

开发的并行微流控电穿孔仪可将不同大小和电荷的生物大分子递送至活体转移性乳腺癌细胞中。通过监测经电穿孔处理的悬浮细胞荧光强度的变化，定性评估分子递送的成功与否。 原位 并通过流式细胞术分析的定量测量加以验证。 图 4A 显示90%经处理的细胞摄取了70,000 Da的中性葡聚糖。在统计分析中，为每种荧光染料设定强度阈值，以确保大多数（>99%）的未处理活细胞计数低于阈值（见图4（c效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理的细胞总数之比。 图 4B 表明效率并不因分子量或电荷的不同而发生显著变化（P >0.1）。所有测试的葡聚糖分子递送至细胞质的效率均超过70%。此外， 图4D 展示了利用相同分子量（MW = 3,000 Da）的阴离子型和中性葡聚糖成功实现了顺序分子递送，双分子递送效率达56%。当前系统在细胞处理通量及多分子递送效率方面均比先前报道的系统高出10倍。¹⁸ 且该改进不影响单分子递送效率（阴离子和中性葡聚糖分别为82%和70%）。

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讨论

通过新的并行化电穿孔平台，在实现多分子递送通量和效率提升10倍的同时，还保留了先前开发的单腔室系统所具备的全部优势。¹⁸ 此前已有的优势包括：(i) 对目标细胞进行预纯化以获得均匀的尺寸分布，从而提高细胞存活率；(ii) 对分子剂量进行精确且独立的控制；(iii) 操作时所需的电流量较低。选择荧光标记的葡聚糖作为目标分子，是因为它们在分子量、偶联荧光素类型以及电荷性质方面具有广泛的可选范围。这些大分子是此类研究的理想候选，因为它们本身无法穿透活细胞的细胞膜，且不表现出细胞毒性。²⁴ 在开展电穿孔实验前，已针对当前系统确定了荧光葡聚糖的最佳浓度、孵育时间以及电学参数。由于该平台具备实时监测分子摄取过程的能力，优化过程变得相对简单高效。若待测分子或细胞类型缺乏已知的电穿孔参数信息，该实时可视化功能将极为有益。所有测试分子的孵育时间均设定为100秒，此时所有10个腔室中被捕获的细胞均能实时检测到可识别的荧光强度信号，表明分子递送已成功完成。需注意，该时间并非实现分子递送所需的最短孵育时长。

关于使用电穿孔进行分子递送的过程，长期以来一直存在争议.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MDA-MB-231 癌细胞系	美国典型培养物保藏中心（ATCC）	HTB-26
Leibovitz’s L-15 培养基	Cellgro，Mediatech公司	10-045-CV
胎牛血清（FBS）	Gibco，Life Technologies	16000-044
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Cellgro，Mediatech公司	21-030
胰蛋白酶	Gibco，Life Technologies	25200-056
Flow Cytometer easyCyte HT	Millipore	0500-4008
氧气等离子清洗机	Technics Micro-RIE
Dektak 6M 表面轮廓仪	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒	道康宁
压缩氮气	Airgas	NI 300
高压调节器	McMaster-Carr	6162K22
下游调节因子	McMaster-Carr	4000K563
高速3/2通8阀阀组	Festo
内联单向阀	Idex Health and Science	CV3320
5/32" OD × 3/32" ID 聚氨酯管	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID 聚氨酯管	Pneumadyne	PU-250PB-4
1/16" PEEK 管路	Festo	P1533
1/32" PEEK 管路	Idex Health and Science	P1569
PEEK 管路接头	Idex Health and Science	P881
脉冲发生器	HP	8110A
铝线	Bob Martin Company	6061 铝合金
示波器	安捷伦	DSO3062A
50 ml 离心管	VWR	21008-178
15 ml 离心管	VWR	21008-216
T75 培养瓶	VWR	82050-862
葡聚糖，四甲基罗丹明，3,000 分子量，阴离子	Gibco，Life Technologies	D3307
葡聚糖，四甲基罗丹明，70,000 分子量，中性	Gibco，Life Technologies	D1819
葡聚糖，Texas Red，3,000 MW，中性	Gibco，Life Technologies	D3329