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方法文章

用于顺序分子递送的微尺度涡流辅助电穿孔仪

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DOI：

10.3791/51702

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2014年8月7日

 , 
1The Rowland Institute, Harvard University

本文内容

摘要

开发了一种微流控涡旋辅助电穿孔平台，可对相同细胞群体依次递送多种分子，并实现精确且独立的剂量控制。在电穿孔前进行的基于尺寸的目标细胞纯化步骤，有助于提高分子递送效率和处理后细胞的存活率。

摘要

电穿孔近年来受到越来越多关注，因为它是一种将非通透性外源分子探针物理导入细胞的极为强大的技术。本研究报道了一种微流控电穿孔平台，能够以精确且分子依赖性的参数控制，向哺乳动物细胞递送多种分子。该系统能够分离出大小分布均一的细胞，从而在给定电场强度下减少电穿孔效率的差异，提高样品存活率。此外，其过程可视化功能可实现对荧光分子摄取过程的实时观察，从而允许及时调整分子递送参数。 原位 以提高效率。为了展示所报道平台的广泛能力，选用不同大小和电荷性质的生物大分子（例如， 相对分子质量为 3,000 和 70,000 Da 的葡聚糖被高效递送至转移性乳腺癌细胞>所有测试分子的细胞存活率均超过70%。该平台已证实其在拓展片上电穿孔技术具有应用潜力的研究领域中的使用价值。

引言

近年来，利用电脉冲促进细胞外分子进入胞质已成为操控哺乳动物细胞的一种有效手段。1 该过程也称为电穿孔，可逆性地使细胞膜通透化，从而使原本无法透过细胞膜的分子得以进入细胞内的环境。由于几乎任何类型的分子均可通过电穿孔在细胞膜上暂时形成的孔道导入各类细胞的细胞质中，因此该技术被报道比病毒介导、化学和光学等其他方法更具可重复性、普适性和高效性。2-3 该技术已被用于引入荧光分子，4 药物5 和核酸6-7 在保持细胞存活和完整的同时，鉴于这些优势，电穿孔已被采用为一种常见的实验室DNA转染技术， 体内 基因治疗8 以及细胞疫苗研究。然而，传统的电穿孔系统在处理尺寸异质性较大的样本时，仍难以同时实现高效的转染效率和细胞存活率，因为成功电穿孔所需的电场强度与细胞直径密切相关。此外，由于依赖于整体性的随机分子递送过程，这些系统无法精确控制多种分子的递送量。9 为了解决这些问题，许多研究团队开发了微流控电穿孔平台，该平台具有穿孔电压较低、转染效率更高、细胞死亡率显著降低以及能够递送多种分子等优势。10-13 这些优势的实现得益于微尺度电穿孔系统的小型化设计，其电极间距为亚毫米级，显著降低了成功递送所需的电压。此外，这些微尺度电穿孔系统能够实现均匀的电场分布，并快速消散产生的热量，从而在提高递送效率的同时降低细胞死亡率。采用透明材料制备这些微芯片还可进一步实现 原位 电穿孔过程的实时观察以及时调整参数。2,12 然而，对于新兴的研究和治疗应用而言，需要精确的剂量控制以及对分子和细胞相关参数的精确调控，6,14-16 仍未解决。

本研究展示了一种微流控涡旋辅助电穿孔系统，能够将多种分子依次递送至预先选定的、具有相同特征的目标细胞群体中。在电穿孔前，利用先前报道的尺寸选择性捕获机制分离出具有均匀尺寸分布的细胞。17-18 由于细胞尺寸分布均一，从而在给定电场强度下实现了更小的电穿孔效率差异和更高的细胞存活率。19 此外，通过微尺度涡旋持续搅动被捕获的细胞，可使分子在整个细胞质中实现均匀递送，这与此前使用另一种涡旋辅助电穿孔平台所报道的结果一致。20 为证明该系统适用于生物学研究中常用的多种分子，本研究将一系列不同分子量的生物大分子递送至转移性乳腺癌细胞中。同时，借助实时过程监测，本工作提供了更多证据，有助于终结长期以来关于电穿孔过程中分子递送机制的争议，即以电泳为主导还是以扩散为主导。14 与其他电穿孔系统不同，该平台独特地集成了多项优势：精确的多分子递送、高分子递送效率、极低的细胞死亡率、可递送分子的广泛尺寸与电荷范围，以及对电穿孔过程的实时可视化。基于上述能力，所开发的电穿孔系统在细胞重编程研究6,14,21-22、药物递送应用10,19 以及需要深入理解电穿孔分子递送机制的应用中，具有实际而广泛的工具性潜力。

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方案

1. 细胞准备

  1. 在每瓶组织培养T75培养瓶中加入10 ml Leibovitz L-15培养基（含10% (v/v) 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素），接种转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231，细胞密度为1×105 个细胞/ml。
  2. 将MDA-MB-231细胞置于37 °C、湿度饱和、0% CO2的培养箱中培养。
  3. 接种后第2天进行实验，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理细胞2分钟消化细胞，随后加入8 ml完全培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。
  4. 将细胞在200 × g离心5分钟收集细胞沉淀，用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS，1×，不含Ca2+和Mg2+）重悬，调整细胞浓度至5 × 105 个细胞/ml。

2. 装置设计与制备

注意：掩模、主模具制备以及微通道封装过程必须在洁净室中进行，而聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的浇铸过程可在普通实验台面上完成。

  1. 使用 AutoCAD 按照图1所示设计一种微流控装置。该装置应包含一个具有多个注射端口的入口、粗滤器以及两条平行的直矩形惯性聚焦通道（长度 L = 7 mm，宽度 W = 40 μm，高度 H = 70 μm）。每条直通道包含5个电穿孔腔室，腔室之间相距800 μm（WC = 400 μm），每个腔室设有两个用于铝电极的通孔。相邻横向排列的两个电穿孔腔室共用一个负极通孔。两条直通道在电穿孔区域下游汇合为一个出口。
  2. 使用 LinkCAD 将带有微结构图案的 CAD 文件转换为 GDSII 文件。利用激光掩模写入仪在 5” × 5” 的掩模空白片上刻写微结构图案。按照制造商的协议对掩模进行显影。注：掩模显影过程包括光刻胶显影、铬层蚀刻和光刻胶去除。或者，也可从第三方制造商处购买高分辨率透明胶片（>20,000 dpi）上的微结构图案作为掩模使用。掩模上的最终微米级特征应为透明区域，以匹配负性光刻胶的极性要求。
  3. 采用标准软光刻技术23在4英寸硅片上制备该装置设计的铸造模具，将负性光刻胶以2,000 rpm转速旋涂，最终厚度为70 μm。
  4. 将涂有负性光刻胶的硅片在95 °C下预烘20分钟。
  5. 将掩模与硅片贴合，使用掩模对准器在紫外光源下曝光80秒（能量为17.4 mJ/cm2）。
  6. 在 SU-8 显影液中对曝光后的硅片显影4分钟。
  7. 使用表面轮廓仪测量显影后光刻胶的厚度。
  8. 将弹性体与固化剂按10:1的比例充分混合（硅橡胶弹性体试剂盒），然后将混合物浇注到铸造模具上以制备 PDMS 复制品。将浇注的弹性体脱气30分钟，随后将含有脱气后弹性体的模具置于70 °C烘箱中固化2小时。
  9. 将固化后的带有微通道图案的 PDMS 复制品从模具上剥离，并使用手摇钻打孔，用于入口、出口及电极插入。注：手摇钻的标准切削刃直径应为0.76 mm，足以牢固固定 PEEK 管（外径1/32”）和铝电极（外径0.029”）。
  10. 通过氧等离子体清洗仪（射频功率75 W，氧气分压500 mTorr）处理玻璃载片7秒，然后将 PDMS 复制品键合至该玻璃载片上，从而形成封闭的微流控通道。

3. 流动实验

  1. 将铝电极（0.029英寸外径）和出口聚醚醚酮（PEEK）管（1/32英寸外径）通过微通道中的孔插入指定位置（参见 图3B).
  2. 连接电气设备18 负责向铝电极产生高压短脉冲方波（参见 图3C）与PDMS模具中流动的溶液接触。注意：设备应包括一个脉冲发生器和一个自制的高压放大器。18
  3. 准备四个50 ml离心管，分别装入DPBS、含细胞的溶液和含生物分子的溶液，并将每根离心管连接至相应的瓶架，再与气动流量控制系统相连（参见 图3A).18
  4. 将进样口PEEK管从样品瓶架连接至微流控装置上相应的进样孔。
  5. 将方波脉冲的幅度 V 设为 100 V，以获得电场强度 E = V/Le，电穿孔室间的电场强度相当于 0.7 kV/cm。注：此处，Le 是正负电极与流动溶液接触的两个点之间的距离（参见 图1).
  6. 将压力调节器设置为40 psi。注意：使用一个可手动调节的氮气源，以均匀加压所有样品瓶，并利用高速多通道装置，通过自行开发的LabVIEW软件及时激活各个溶液通道。18
  7. 用于阀门控制，打开标记为定制开发的 LabVIEW 软件 阀杆，然后从名为“operate”的下拉菜单中点击运行。
  8. 单击每个对应的阀门图标以打开阀门。注意：阀门激活时，其图标应变为绿色。单击已激活的图标将使阀门失活并关闭。关闭的阀门图标应变为灰色。
  9. 打开DPBS储液罐的阀门（即，洗涤液）以启动流速，用于稳定细胞捕获涡流的生成，持续1.5分钟。
  10. 将活性溶液通道从洗涤液切换至细胞溶液，使细胞在电穿孔室中滞留30秒（即，细胞捕获步骤）。
  11. 在细胞捕获步骤之前，同时使洗涤液和细胞溶液流经装置10秒，以确保在溶液切换步骤期间流动不受干扰。注意：每次进行溶液切换时，均应重复此短暂的共流步骤。
  12. 打开冲洗口，冲洗装置 20 秒，以去除未被捕获的污染细胞。
  13. 将含有目标第一种分子的溶液（0.2 mg/ml 的 3,000 Da 中性与阴离子葡聚糖分子，或 1.5 mg/ml 的 70,000 Da 中性葡聚糖分子）注入装置中。
  14. 注射分子溶液后立即施加五个短脉冲（Δt = 30 毫秒，间隔 2 秒），并使用示波器实时监测所施加电脉冲的幅度和持续时间。
  15. 重复步骤 3.10，重复次数与需递送的额外分子数量相同。每次分子递送时，将细胞在分子溶液中孵育 100 秒，然后用洗涤溶液冲洗装置 100 秒，以去除多余的分子。
  16. 以低于5 psi的操作压力将细胞释放至96孔板中，用于后续分析。注意：每次释放可收集约100 μl含100个细胞的溶液。
  17. 重复实验步骤3.9至3.16三次，以收集足够用于流式细胞术的细胞。
  18. 将含有处理后细胞的96孔板在228 × g下离心5分钟。
  19. 移除含有过量荧光分子的上清液。
  20. 用DPBS重悬细胞，用于流式细胞术分析。
  21. 将细胞上样至流式细胞仪，用于分析分子摄取效率。

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结果

开发的并行微流控电穿孔仪可将不同大小和电荷的生物大分子递送至活体转移性乳腺癌细胞中。通过监测经电穿孔处理的悬浮细胞荧光强度的变化，定性评估分子递送的成功与否。 原位 并通过流式细胞术分析的定量测量加以验证。 图 4A 显示90%经处理的细胞摄取了70,000 Da的中性葡聚糖。在统计分析中，为每种荧光染料设定强度阈值，以确保大多数（>99%）的未处理活细胞计数低于阈值（见图4（c效率定义为成功摄取目标分子的细胞数与处理的细胞总数之比。 图 4B 表明效率并不因分子量或电荷的不同而发生显著变化（P >0.1）。所有测试的葡聚糖分子递送至细胞质的效率均超过70%。此外， 图4D 展示了利用相同分子量（MW = 3,000 Da）的阴离子型和中性葡聚糖成功实现了顺序分子递送，双分子递送效率达56%。当前系统在细胞处理通量及多分子递送效率方面均比先前报道的系统高出10倍。18 且该改进不影响单分子递送效率（阴离子和中性葡聚糖分别为82%和70%）。

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讨论

通过新的并行化电穿孔平台，在实现多分子递送通量和效率提升10倍的同时，还保留了先前开发的单腔室系统所具备的全部优势。18 此前已有的优势包括：(i) 对目标细胞进行预纯化以获得均匀的尺寸分布，从而提高细胞存活率；(ii) 对分子剂量进行精确且独立的控制；(iii) 操作时所需的电流量较低。选择荧光标记的葡聚糖作为目标分子，是因为它们在分子量、偶联荧光素类型以及电荷性质方面具有广泛的可选范围。这些大分子是此类研究的理想候选，因为它们本身无法穿透活细胞的细胞膜，且不表现出细胞毒性。24 在开展电穿孔实验前，已针对当前系统确定了荧光葡聚糖的最佳浓度、孵育时间以及电学参数。由于该平台具备实时监测分子摄取过程的能力，优化过程变得相对简单高效。若待测分子或细胞类型缺乏已知的电穿孔参数信息，该实时可视化功能将极为有益。所有测试分子的孵育时间均设定为100秒，此时所有10个腔室中被捕获的细胞均能实时检测到可识别的荧光强度信号，表明分子递送已成功完成。需注意，该时间并非实现分子递送所需的最短孵育时长。

关于使用电穿孔进行分子递送的过程，长期以来一直存在争议...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由罗兰青年研究员项目资助。作者谨向哈佛大学罗兰研究所的科学家和工作人员致以诚挚感谢：Chris Stokes 在定制化计算机辅助压力控制系统搭建过程中提供了帮助，Diane Schaak 博士在生物样本处理方面提供了建议，Winfield Hill 负责了电子系统的开发，Alavaro Sanchez 博士提供了流式细胞仪的使用权限，Scott Bevis、Kenny Spencer 和 Don Rogers 负责加工了压力系统所需的机械管路部件。微流控模具在哈佛大学纳米系统中心（CNS）制备完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MDA-MB-231 癌细胞系美国典型培养物保藏中心（ATCC）HTB-26
Leibovitz’s L-15 培养基Cellgro，Mediatech公司10-045-CV
胎牛血清（FBS）Gibco，Life Technologies16000-044
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Cellgro，Mediatech公司21-030
胰蛋白酶Gibco，Life Technologies25200-056
Flow Cytometer easyCyte HTMillipore0500-4008
氧气等离子清洗机Technics Micro-RIE
Dektak 6M 表面轮廓仪Veeco
KMPR 1050Microchem
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒道康宁
压缩氮气AirgasNI 300
高压调节器McMaster-Carr6162K22
下游调节因子McMaster-Carr4000K563
高速3/2通8阀阀组Festo
内联单向阀Idex Health and ScienceCV3320
5/32" OD × 3/32" ID 聚氨酯管PneumadynePU-156F-0
1/4" OD X 0.17" ID 聚氨酯管PneumadynePU-250PB-4
1/16" PEEK 管路FestoP1533
1/32" PEEK 管路Idex Health and ScienceP1569
PEEK 管路接头Idex Health and ScienceP881
脉冲发生器HP8110A
铝线Bob Martin Company6061 铝合金
示波器安捷伦DSO3062A
50 ml 离心管VWR21008-178
15 ml 离心管VWR21008-216
T75 培养瓶VWR82050-862
葡聚糖，四甲基罗丹明，3,000 分子量，阴离子Gibco，Life TechnologiesD3307
葡聚糖，四甲基罗丹明，70,000 分子量，中性 Gibco，Life TechnologiesD1819
葡聚糖，Texas Red，3,000 MW，中性Gibco，Life TechnologiesD3329

参考文献

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