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方法文章

一种感染方案 秀丽隐杆线虫 与 鼠伤寒沙门氏菌

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DOI：

10.3791/51703

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2014年6月26日

 , 
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的一种新型遗传学模型。本文介绍了一种利用Salmonella typhimurium感染C. elegans并结合双链RNA干扰（RNAi）技术来研究宿主基因在抵御Salmonella感染中作用的实验方案。

摘要

在过去的十年中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）已成为研究宿主与病原体相互作用的无脊椎动物模型，包括宿主对革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的防御反应。Salmonella 可在 C. elegans 肠道内建立持续性感染，并导致感染个体早期死亡。目前已在 C. elegans 中鉴定出多种免疫机制，用于抵御 Salmonella 感染。自噬是一种在进化上保守的溶酶体降解途径，已被证明可在 C. elegans 和哺乳动物中限制 Salmonella 的复制。本文介绍了一种感染 C. elegans 的实验方案，使线虫仅短暂暴露于 Salmonella，类似于人类中的 Salmonella 感染过程。Salmonella 感染显著缩短了 C. elegans 的寿命。以自噬关键基因 bec-1 为例，我们将该感染方法与 C. elegans 的RNAi喂养技术相结合，证明该方案可用于研究 C. elegans 宿主基因在抵御 Salmonella 感染中的功能。由于目前已具备覆盖 C. elegans 全基因组的RNAi文库，本方案使得利用全基因组RNAi文库系统性筛选抵抗 Salmonella 及其他肠道病原体的 C. elegans 基因成为可能。

引言

自由生活的土壤线虫Caenorhabditis elegans是一种结构简单且遗传操作便利的模式生物，被广泛用于研究多种生物学问题。C. elegans主要以自体受精的雌雄同体形式存在，雄性个体则在配子形成过程中因X染色体不分离而自发产生1,2。在食物充足的情况下，C. elegans会连续经历四个幼虫阶段后发育为成虫。温度也影响C. elegans的发育过程，较高温度下发育速度更快。在实验室中，通常将C. elegans培养在接种了大肠杆菌Escherichia coli（菌株OP50）作为食物的琼脂平板上，标准培养温度为20 °C1,2。

近十年来，C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的无脊椎模式生物3-5。在自然环境中，C. elegans 以细菌作为营养来源1,2。其常规的实验室细菌食物 OP50 可轻易替换为其他病原菌，从而研究 C. elegans 与特定病原菌之间的相互作用。在此类条件下，肠道是感染的主要部位。事实上，多种细菌病原体已被证实可对 C. elegans 造成致死性感染3-5。

革兰氏阴性菌Salmonella是一种胃肠道病原体，可在全球范围内引起人类食源性疾病6,7。C. elegans是Salmonella typhimurium的良好宿主模型，因为该细菌可在其中复制并引发持续性肠道感染8-10。研究人员已利用C. elegans鉴定出多种新的以及已知的Salmonella毒力因子11。有趣的是，C. elegans的免疫系统能够有效限制Salmonella的复制。先前有报道称，抑制自噬相关基因会导致Salmonella在C. elegans体内复制增加，从而导致感染线虫过早死亡10。巨自噬（本文中简称为自噬）是一个动态过程，涉及细胞内膜结构的重排，以包裹细胞质成分和细胞器，并将其运送至溶酶体进行降解12。已有研究报道，自噬可在C. elegans及哺乳动物中限制Salmonella的复制10,13。

这 秀丽隐杆线虫 基因组是首个被测序的多细胞真核生物基因组；其对RNAi处理具有响应性14-16此外，可通过让蠕虫摄取含有目的基因双链RNA的细菌（称为RNAi喂养）来有效实施RNAi。16,17. 已构建全基因组RNAi饲喂文库，用于全基因组范围的RNAi筛选16,18. 此处，一种 沙门氏菌 感染方案与RNAi喂养相结合，以实现检测 秀丽隐杆线虫 目的基因在抵御特定作用方面的保护能力 沙门氏菌 感染。

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方案

1. XLD（木糖赖氨酸脱氧胆酸盐）琼脂平板

XLD 琼脂是一种用于Salmonella的选择性培养基，该菌在 XLD 琼脂平板上呈现黑色菌落。然而，若无污染顾虑，可使用普通的 LB 平板替代。

  1. 称取 5.5 g XLD 琼脂，加入 5 ml 去离子水中重悬。
  2. 充分混匀直至所有琼脂润湿，再加入 95 ml 去离子水，搅拌至无结块，培养基完全重悬。
  3. 加热煮沸使培养基完全溶解（切勿高压灭菌）。
  4. 将培养基在室温下冷却至 50 °C。
  5. 每块 95 × 15 mm（直径 × 高度）的培养皿中倒入 25 ml 琼脂（用 Parafilm 封口的培养皿可在 4 °C 保存长达 1 个月）。

2. 线虫生长培养基（NGM）RNAi 饲喂平板

秀丽隐杆线虫（C. elegans）NGM 平板的制备方法已有先前报道19。此处简要描述向 NGM 培养基中添加抗生素氨苄青霉素和 RNAi 化学诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以制备 RNAi 饲喂平板的步骤。

  1. 将3 g NaCl和2.5 g Bacto蛋白胨溶解于1 L 去离子水中。
  2. 向培养基中加入17 g Bacto琼脂。
  3. 将培养基在高压灭菌器中灭菌45分钟 ，然后在水浴中冷却至50 °C。
  4. 加入以下溶液：1 ml胆固醇溶液（5 mg/ml，溶于95%乙醇）、1 ml 1 M CaCl2、1 ml 1 M MgSO4和25 ml 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）。充分混匀。
  5. 加入1 ml 1 M IPTG和500 µl氨苄青霉素溶液（100 mg/ml，溶于无菌水）。
  6. 充分混匀后，按照无菌操作规程，使用移液器辅助装置和25 ml血清移液管，将溶液倒入60 × 15 mm（直径 × 高度）的培养皿中，每皿加入12 ml琼脂。平板可在4 °C保存最多1 个月。

3. 准备用于感染的RNAi处理动物

以必需的自噬基因 bec-1 为例，研究宿主基因在抵御沙门氏菌感染中的功能。实验流程如图1和表1所示。以下为用于感染实验的RNAi处理动物的制备方案，括号中注明各实验步骤的进行日期。

  1. 将 -80 °C 保存的 bec-1 RNAi 饲喂细菌和对照空载体 L4440 RNAi 饲喂细菌的冻存菌块接种至 2 ml 添加了 100 mg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中（第 1 天）。在整个实验期间每周重复此步骤一次，以获得新鲜的 RNAi 细菌。不使用时将菌液保存于 4 °C 冰箱中。
  2. 将 100 ml 过夜培养的 RNAi 细菌接种到 RNAi 平板上。准备三个 bec-1 RNAi 平板和三个对照空载体 RNAi 平板。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养（第 2 天）。
  3. 将 RNAi 平板从 37 °C 培养箱中取出，在实验台上静置至室温。挑取健康摄食的 L4 期野生型 N2 雌雄同体线虫，转移至 bec-1 RNAi 和对照空载体 RNAi 平板中。每板放置三条线虫，每个处理设三个重复平板。同一天，按照步骤 3.2 所述方法准备新的 RNAi 平板（第 3 天）。
  4. 将接种了线虫的 RNAi 平板置于 20 °C 培养箱中培养 36–40 小时 ，然后将线虫转移至步骤 3.3 中准备的新鲜对应 RNAi 平板上。线虫转移后，将平板继续在 20 °C 培养箱中培养 64 小时 （第 4 天）。

4. 准备用于感染的Salmonella

  1. 将 -80 °C 保存的沙门氏菌（Salmonella）菌种划线接种于 1 XLD 琼脂平板上，37 °C 培养过夜（第 5 天）。
  2. 挑取一个分离良好的黑色沙门氏菌（Salmonella）单菌落，接种至 2 ml LB 液体培养基中，37 °C 振荡培养过夜（第 6 天）。
  3. 将 80 ml 沙门氏菌（Salmonella）过夜培养物接种至 1 个秀丽隐杆线虫（C. elegans）60 × 15 mm（直径 × 高度）NGM 琼脂平板上，共制备 6 个平板。室温孵育 6 小时，使细菌培养物干燥并在平板表面形成菌苔（第 7 天）。

5. 用RNAi处理的蠕虫进行感染 沙门氏菌

  1. 转移 bec-1 经RNAi处理的及对照空载体RNAi处理的L4期N2雌雄同体线虫（第3步中设置的线虫的子代） 沙门氏菌 平板。每板放置40条线虫于3个 每组使用培养板，在20 °C条件下将线虫培养板孵育48小时 (第7天).
  2. 按照步骤 3.1 和 3.2 所述，制备一组新鲜的 RNAi 平板（第7天 和 第8天).
  3. 48 小时后 感染，转染 沙门氏菌将感染的线虫转移至第5.2步制备的相应RNAi平板中，于20 °C培养（第9天).

6. 存活率测定

  1. 每天记录线虫的存活情况，并在线虫产卵期间将其转移至新鲜的相应RNAi平板上。每次转移线虫前，按照步骤3.1和3.2所述方法预先准备一组新鲜RNAi平板。用末端压平的铂金丝轻轻触碰线虫身体（头部、中段和尾部）。若未观察到线虫身体任何部位的运动，则记为死亡。
  2. 每天或每隔一天记录一次线虫存活情况；在线虫停止产卵后，每周将线虫转移至新鲜的相应RNAi平板两次。
  3. 当所有线虫死亡后，将三个重复平板的存活数据合并为一个数据集。将每组的存活数据输入适当的统计软件（如GraphPad Prism），以生成生存曲线并进行Kaplan-Meier生存分析。整个实验至少重复一次，以验证结论。

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结果

在20 °C条件下，野生型N2线虫的中位寿命为17天（图2A和表2）。Salmonella感染显著缩短N2线虫的中位寿命至10.5天（p = 0.0002，log-rank检验）（图2A）。

如果一个 C. elegans 基因在抵御 Salmonella 感染中发挥重要作用，则预测其抑制将导致对 Salmonella 感染的易感性增加。事实上，与经 Salmonella 感染并以对照 RNAi 处理的 N2 动物相比，经 Salmonella 感染并以 bec-1 RNAi 处理的 N2 蠕虫的中位寿命从 10.5 天缩短至 9 天（p < 0.0001，log-rank 检验）（图 2B 和 表 2）。其最大寿命显著缩短了 14 天（从 24 天缩短至 10 天，图...

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讨论

C. elegans 是一种简单的遗传模式生物，以细菌作为营养来源。因此，很容易将其正常的食物细菌替换为肠道病原体，以研究 C. elegans 与特定病原体之间的相互作用。本文描述了一种将 Salmonella 感染与 C. elegans 的 RNAi 饲喂处理相结合的实验方案，用于探究宿主基因在抵御 Salmonella 感染中的作用。以往的感染方案通常在整个生命周期内使 C. elegans 暴露于包括 Salmonella 在内的致病菌中20。在本方案中，Salmonella 对线虫的感染仅持续两天。此后，线虫不再接触 Salmonella。这种 Salmonella 感染显著缩短了 C. elegans 野生型个体的寿命。因此，侵入的 Salmonella 可在线虫体内复制并导致其死亡10。这种短期暴露于 Salmonella 的方式模拟了人类的

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Diane Baronas-Lowell 博士对本文稿的审阅。本研究得到了佛罗里达大西洋大学查尔斯·E·施密特理学院种子基金以及艾利森医学基金会老年医学奖学金对 K.J. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB 肉汤FisherBP9723-500
XLD 琼脂EMD Chemicals1.05287.0500
Bacto 琼脂FisherDF0140-01-0
蛋白胨FisherBP1420-500
氯化钠FisherS671-500
氯化钙FisherC69-500
硫酸镁FisherM65-500
IPTGGold Biotechnology12481C50
胆固醇SigmaC8667-25G
氨苄青霉素FisherBP1760-25
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028
95 × 15 mm 培养皿FisherFB0875714G
60 × 15 mm 培养皿 Fisher08-757-13A
Falcon 血清移液管Fisher13-668-2
Falcon Express Pipet-AidFisher13-675-42
MaxQ6000 摇床培养箱 Thermo ScientificSHKE6000-7
培养箱PercivalI-36DL

参考文献

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