C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的一种新型遗传学模型。本文介绍了一种利用Salmonella typhimurium感染C. elegans并结合双链RNA干扰（RNAi）技术来研究宿主基因在抵御Salmonella感染中作用的实验方案。
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摘要
摘要
在过去的十年中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）已成为研究宿主与病原体相互作用的无脊椎动物模型，包括宿主对革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的防御反应。Salmonella 可在 C. elegans 肠道内建立持续性感染，并导致感染个体早期死亡。目前已在 C. elegans 中鉴定出多种免疫机制，用于抵御 Salmonella 感染。自噬是一种在进化上保守的溶酶体降解途径，已被证明可在 C. elegans 和哺乳动物中限制 Salmonella 的复制。本文介绍了一种感染 C. elegans 的实验方案，使线虫仅短暂暴露于 Salmonella，类似于人类中的 Salmonella 感染过程。Salmonella 感染显著缩短了 C. elegans 的寿命。以自噬关键基因 bec-1 为例，我们将该感染方法与 C. elegans 的RNAi喂养技术相结合，证明该方案可用于研究 C. elegans 宿主基因在抵御 Salmonella 感染中的功能。由于目前已具备覆盖 C. elegans 全基因组的RNAi文库，本方案使得利用全基因组RNAi文库系统性筛选抵抗 Salmonella 及其他肠道病原体的 C. elegans 基因成为可能。
引言
自由生活的土壤线虫Caenorhabditis elegans是一种结构简单且遗传操作便利的模式生物，被广泛用于研究多种生物学问题。C. elegans主要以自体受精的雌雄同体形式存在，雄性个体则在配子形成过程中因X染色体不分离而自发产生1,2。在食物充足的情况下，C. elegans会连续经历四个幼虫阶段后发育为成虫。温度也影响C. elegans的发育过程，较高温度下发育速度更快。在实验室中，通常将C. elegans培养在接种了大肠杆菌Escherichia coli（菌株OP50）作为食物的琼脂平板上，标准培养温度为20 °C1,2。
近十年来，C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的无脊椎模式生物3-5。在自然环境中，C. elegans 以细菌作为营养来源1,2。其常规的实验室细菌食物 OP50 可轻易替换为其他病原菌，从而研究 C. elegans 与特定病原菌之间的相互作用。在此类条件下，肠道是感染的主要部位。事实上，多种细菌病原体已被证实可对 C. elegans 造成致死性感染3-5。
革兰氏阴性菌
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方案
1. XLD（木糖赖氨酸脱氧胆酸盐）琼脂平板
XLD 琼脂是一种用于Salmonella的选择性培养基，该菌在 XLD 琼脂平板上呈现黑色菌落。然而，若无污染顾虑，可使用普通的 LB 平板替代。
- 称取 5.5 g XLD 琼脂，加入 5 ml 去离子水中重悬。
- 充分混匀直至所有琼脂润湿，再加入 95 ml 去离子水，搅拌至无结块，培养基完全重悬。
- 加热煮沸使培养基完全溶解（切勿高压灭菌）。
- 将培养基在室温下冷却至 50 °C。
- 每块 95 × 15 mm（直径 × 高度）的培养皿中倒入 25 ml 琼脂（用 Parafilm 封口的培养皿可在 4 °C 保存长达 1 个月）。
2. 线虫生长培养基（NGM）RNAi 饲喂平板
秀丽隐杆线虫（C. elegans）NGM 平板的制备方法已有先前报道19。此处简要描述向 NGM 培养基中添加抗生素氨苄青霉素和 RNAi 化学诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以制备 RNAi 饲喂平板的步骤。
- 将3 g NaCl和2.5 g Bacto蛋白胨溶解于1 L 去离子水中。
- 向培养....
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结果
在20 °C条件下，野生型N2线虫的中位寿命为17天（图2A和表2）。Salmonella感染显著缩短N2线虫的中位寿命至10.5天（p = 0.0002，log-rank检验）（图2A）。
如果一个 C. elegans 基因在抵御 Salmonella 感染中发挥重要作用，则预测其抑制将导致对 Salmonella 感染的易感性增加。事实上，与经 Salmonella 感染并以对照 RNAi 处理的 N2 动物相比，经 Salmonella 感染并以 bec-1 RNAi 处理的 N2 蠕虫的中位寿命从 10.5 天缩短至 9 天（p < 0.0001，log-rank 检验）（图 2B 和 表 2）。其最大寿命显著缩短了 14 天（从 24 天缩短至 10 天，图.......
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讨论
C. elegans 是一种简单的遗传模式生物，以细菌作为营养来源。因此，很容易将其正常的食物细菌替换为肠道病原体，以研究 C. elegans 与特定病原体之间的相互作用。本文描述了一种将 Salmonella 感染与 C. elegans 的 RNAi 饲喂处理相结合的实验方案，用于探究宿主基因在抵御 Salmonella 感染中的作用。以往的感染方案通常在整个生命周期内使 C. elegans 暴露于包括 Salmonella 在内的致病菌中20。在本方案中，Salmonella 对线虫的感染仅持续两天。此后，线虫不再接触 Salmonella。这种 Salmonella 感染显著缩短了 C. elegans 野生型个体的寿命。因此，侵入的 Salmonella 可在线虫体内复制并导致其死亡10。这种短期暴露于 Salmonella 的方式模拟了人类的
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Diane Baronas-Lowell 博士对本文稿的审阅。本研究得到了佛罗里达大西洋大学查尔斯·E·施密特理学院种子基金以及艾利森医学基金会老年医学奖学金对 K.J. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB 肉汤 | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD 琼脂 | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto 琼脂 | Fisher | DF0140-01-0 | |
| 蛋白胨 | Fisher | BP1420-500 | |
| 氯化钠 | Fisher | S671-500 | |
| 氯化钙 | Fisher | C69-500 | |
| 硫酸镁 | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8667-25G | |
| 氨苄青霉素 | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| 95 × 15 mm 培养皿 | Fisher | FB0875714G | |
| 60 × 15 mm 培养皿 | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon 血清移液管 | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 摇床培养箱 | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| 培养箱 | Percival | I-36DL |
参考文献
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M.
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重印与许可
