利用昆虫触角电位传感器在自主机器人上进行嗅觉搜索

摘要

我们介绍了一种将昆虫触角以自主机器人上的电触角图（EAG）形式加以应用的实验方案。我们的实验设计可在一天内实现稳定的记录，并能分辨高达10 Hz的单个气味脉冲。通过驱动机器人向气味源移动，验证了EAG传感器在嗅觉搜索中的高效性。

摘要

用于追踪危险工业设施中化学品泄漏的机器人¹ 或雷区中的爆炸物残留² 面临与昆虫觅食或寻找配偶相同的难题³：嗅觉搜索受到湍流输运物理特性的限制⁴风传气味的浓度分布呈不连续状态，由零星分布的气味团块组成。嗅觉搜寻的前提是能够检测到这些间歇性出现的气味团块。由于其具有高灵敏度和快速响应特性^5-6，昆虫的嗅觉器官为检测提供了独特的机会。过去，昆虫触角不仅被用于检测性信息素⁷ 而且包括与人类相关的化学物质， 例如, 癌细胞释放的挥发性化合物⁸ 或有毒及非法物质^9-11我们在此描述了一种将昆虫触角应用于自主机器人的实验方案，并展示了利用其追踪气味羽流至源头的概念验证。记录了嗅觉神经元的全局反应 原位 以触角电位图（EAGs）的形式呈现。我们的实验设计基于完整昆虫制备，可在一天工作时间内实现稳定的记录。相比之下，离体触角的EAG记录寿命仅为2小时。我们开发了一套定制的硬件/软件接口，连接EAG电极与机器人系统。该测量系统可分辨高达10 Hz的单个气味脉冲，时间分辨率超过人工化学传感器的时间尺度。¹²EAG传感器在嗅觉搜索中的高效性进一步体现在引导机器人朝向信息素源移动的过程中。通过使用与真实动物相同的嗅觉刺激和传感器，我们的机器人平台为检验关于嗅觉编码和搜索策略的生物学假说提供了直接手段。¹³它还可能通过将不同昆虫物种的触角电图（EAG）结合到生物电子鼻构型中，用于检测其他感兴趣的气味物质。¹⁴ 或使用模拟昆虫触角的纳米结构气体传感器¹⁵.

引言

如今，由于狗等动物具有出色的气味检测能力，常被用于涉及化学泄漏物、毒品和爆炸物定位的安全与安保应用中¹⁶。然而，它们会表现出行为差异，长时间工作后容易疲劳，且随着性能随时间下降，需要频繁重新训练¹⁷。克服这些局限性的一种方法是用嗅觉机器人替代训练有素的警犬。

尽管如此，在机器人技术中追踪气味及其来源仍是一项重大挑战。在湍流环境中，气味羽流的空间分布具有高度异质性和不稳定性，由零星分布的气味团块组成⁴。即使距离源头仅数米的较近距离，气味检测也变得断续发生，仅能间歇性地提供线索。此外，在检测发生时，局部的浓度梯度通常并不指向气味源。在信息流动不连续、且检测时局部信息有限的情况下，如何引导机器人向气味源移动？

众所周知，雄性蛾类等昆虫利用化学通讯，能够在远距离（数百米）成功定位配偶。为此，它们采用一种典型的行为模式^18-20：当感知到气味团时，它们会向上风方向快速前进；当气味信号消失时，则进行一种称为“扫掠”（casting）的扩展性搜索。这种“冲刺—扫掠”策略完全是反应性的，即其行为完全由当前的感知（检测到或未检测到气味）所决定。然而，过去在嗅觉机器人上实现该策略的效果有限，原因是人工气体传感器响应速度较慢，难以有效检测气味团。

大多数嗅觉机器人中使用的金属氧化物传感器响应时间和恢复时间长达数十秒，因此通常会滤除湍流羽流中遇到的浓度波动²¹相比之下，昆虫化学感受器的反应时间要短得多， 例如，昆虫触角电位图（EAGs）的上升时间小于50毫秒²²因此，利用昆虫触角电图（EAG），可分辨数赫兹频率的气味脉冲²³这一特性使EAG传感器非常适合用于检测自然气味羽流中的气味细丝。本文介绍了一种将昆虫EAG传感器集成到机器人上的实验方案，从而实现基于前进与扫掠策略的高效嗅觉搜索。

方案

该方案基于一种市售机器人（见材料表）以及雄性蛾类（Agrotis ipsilon）与其性信息素。然而，该方法经过少量修改后，也可适用于其他昆虫种类、气味物质及机器人系统。

1. 昆虫

1. 在人工饲料上饲养Agrotis ipsilon Hufnagel（鳞翅目：夜蛾科）的末龄幼虫，并将幼虫置于单独的塑料杯中饲养至化蛹，饲养条件为23±1 °C和50±5%相对湿度，具体方法参照先前描述²⁴。
2. 按性别分离蛹，并将成虫雄蛾与雌蛾分别饲养于塑料盒中。提供20%蔗糖溶液供其自由取食。
3. 使用雄蛾进行实验。雄性成虫对同种雌蛾释放的性信息素具有高度敏感性。在A. ipsilon中，主要信息素组分cis-7-十二碳烯乙酸酯（Z7-12:OAc）在触角上表现出最强的活性。

2. 电生理学

1. 从整体昆虫标本记录EAG，具体步骤如下（图1A). 完整的触角比离体触角更优，因其具有更长的使用寿命（参见代表性结果）。
2. 将两根银丝浸入浓漂白液中 10–20 分钟进行氯化处理，随后冲洗。该步骤可防止电极发生极化。在实验过程中，若基线发生漂移，或电极间的偏移电压过大而无法被放大器补偿时，均需重复此处理过程。
3. 使用电极拉制仪从火焰抛光的毛细管制作玻璃电极。火焰抛光可防止玻璃电极刮伤氯化银丝。
4. 用CO₂麻醉一只雄性蛾₂ 将其放入泡沫塑料块中，使头部从顶部露出。
5. 用美纹纸在昆虫颈部处固定其头部。
6. 将用作参比电极的银丝插入颈部。
7. 在体视显微镜下，用细条的美纹纸胶带固定触角的尖端和基部以使其 immobilize。
8. 用手术剪剪下触角远端的2-3节。
9. 使用显微操作器将玻璃电极置于天线切端附近。
10. 用镊子剪断玻璃毛细管的末端，使其直径略大于触角切端的直径。
11. 用（单位：mM）6.4 KCl、340 葡萄糖、10 Hepes、12 MgCl 填充玻璃移液管₂，1 CaCl₂，12 NaCl，pH 6.5。
12. 使用显微操作器将天线的切割端插入玻璃毛细管中。
13. 将用作记录电极的银丝插入玻璃毛细管的最大末端。

3. 硬件接口

1. 将整个制备物封片， 即 昆虫电极显微操作器，安装在固定于机器人顶部的金属板上（图1B）。按照下文所述，将电极连接至机器人。
2. 根据先前的研究成果^25-26，设计一个硬件接口，将EAG输出电压（数量级为1 mV，阻抗为几MΩ）转换至适用于机器人扩展板的输入范围。该扩展板接受0-5 V的模拟输入，而低于-200 mV的负电压可能造成严重损坏。请按照3.2.1至3.2.4步骤，使用Eagle设计该接口。
   1. 使用电压稳压器 78L10（① 在 图2A-2C).
   2. 基于仪器放大器 INA121（③）设计一个前置放大器探头（10倍增益） 图2A-2C).
   3. 设计一个二级放大器（25倍增益），并集成噪声滤波功能（一阶高通0.1 Hz滤波器、二阶低通500 Hz滤波器、50 Hz陷波滤波器），基于四通道运算放大器LT1079（④在 图2A-2C).
   4. 设计一个使用运算放大器 LT1079 和二极管 1N4148（⑤ 在 图2A-2C总增益为250，EAG输出范围为0–5 V，其中零点对应2.5 V。
3. 将电极连接到差分EAG输入端（② 在 图2A-2C将记录电极连接至 INA121 的反相输入端，以获得正向的触角电图（EAG）信号。
4. 连接EAG输出（⑥在 图2A-2C将信号连接至机器人扩展板的12个模拟输入端口。由于每个输入端口每毫秒依次读取一次，采样频率为1 KHz。

4. 软件界面

主线程包含图形用户界面（GUI）、信号检测方法以及用于控制机器人的各种功能。

1. 编写一个图形用户界面（GUI）图 2D) 在 Qt-C++ 中用于数据可视化和数字滤波（20 Hz 5^th 使用巴特沃斯低通滤波器）以及EAG中的气味检测。后者可通过两种方式实现：一是利用适当的滤波器对EAG信号进行反卷积（工程学方法，第4.2节），二是建立神经机制模型以研究信息素快速可靠检测的神经基础 A. ipsilon 蛾类（仿生方法，第4.3节）
2. 反卷积滤波器。EAG 可通过非线性级联模型很好地描述²⁷ 由静态非线性组成 1^st 指数脉冲函数低通滤波器 用于 ，参见 图3A. 在应对气味浓度波动时 ，EAG 输出由卷积积分给出 去卷积可通过系统的逆运算简单获得；即 在频域中。然后， 作为脉冲响应的傅里叶变换 对于信号检测，按照步骤 4.2.1 至 4.2.3 进行操作。
   1. 在时域中执行去卷积过程 和 , 图3B.
   2. 近似非线性 通过多项式函数拟合。利用输入-输出数据对拟合多项式参数和时间常数，以最小化实际值与拟合值之间的均方误差 并重建气味浓度
   3. 检测信息素响应信号 超过预设阈值。
3. 神经形态探测器。一种替代性的探测方法是模拟生物系统。在 A. ipsilon 蛾类中，接收来自触角输入的中枢神经元会对信息素产生典型的兴奋-抑制放电模式响应¹³一种具有四种离子电流的霍奇金-赫胥黎型神经元模型 （延迟整流K⁺ 电流，电压门控钠通道⁺ 和 Ca²⁺ 电流，小电导Ca²⁺-依赖性 K⁺ 电流）先前已被开发用于重现观察到的生理反应¹³信号检测请按照步骤 4.3.1 至 4.3.3 进行。
   1. 将神经元模型实现为微分方程，使用EAG信号作为输入电流 膜电位的演化过程 使用膜电容 C = 22.9 pF 和漏电流，其表达式为 电导为 g_L = 0.011161 µS 且反转电位 E_L = -61.4 mV。离子电流由以下方程描述 与 由何处 是非线性函数。参见先前的研究¹³ 详见细节。
   2. 使用 Sirene 通过四阶^th 四阶龙格-库塔方法和时间步长 = 0.01 毫秒。运行尖峰测试 V(t^f) >0 mV 和 V(t^f - ) <0 mV 在线获取峰电位时间及峰间间隔。
   3. 当出现一连串兴奋（3 个连续的峰间间隔）时，检测信息素的响应 <70毫秒）后跟随抑制（峰间间隔≥350毫秒），见 图3C.

结果

上述方案首先使用持续时间为20毫秒的短脉冲信息素（剂量为1 μg和10 μg）直接喷向触角进行测试。图4A展示了对信息素脉冲产生的EAG反应。这些信号呈正向，是因为记录电极连接至放大器的反相输入端，如步骤3.3所述。根据功率谱显示，该测量系统能够分辨高达10 Hz的信息素脉冲。作为对比，我们还测试了一款商用气体传感器。TGS2620是一种用于检测溶剂蒸气的金属氧化物传感器。尽管该传感器对乙醇具有高灵敏度，但无法跟随浓度的变化（见图4B中的虚线曲线）。问题源于传感器外壳。TGS2620出厂时配备一个带有防爆不锈钢网罩的外壳。由于气体实际需要一定时间才能扩散通过网罩并到达金属氧化物表面，导致响应时间较慢；同时，当气体被困在外壳内部时，清除过程也需要较长时间，因此恢复速度也较慢。为此，我们移除了该外壳，这一改进显著提升了传感器的动态性能（见图4B中的实线曲线）。尽管如此，EAG与TGS2620之间仍存在十倍的差异（10 Hz对比1 Hz）。然而，该比较仅为定性结果，因为EAG与TGS2620并未在完全相同的条件下进行测试。

随后，我们将完整昆虫标本（n = 12 只蛾）与离体触角（n = 7 根触角）的稳定性随时间变化进行了比较。通过性信息素刺激（持续时间 500 毫秒，剂量 1 μg）定期记录EAG信号。原始EAG值（单位：mV）被转换为相对EAG值（以 t = 0 时的初始值为100%）。图5显示，在一个工作日内，我们的完整昆虫标本具有非常好的稳定性。相比之下，离体触角记录的EAG信号随时间迅速下降，仅1.5小时后信号即衰减至初始值的一半。这种时间依赖性可用寿命为2小时的指数衰减模型很好地描述。

最后，我们测试了EAG机器人平台使用反应式搜索策略寻找气味源（信息素化合物Z7-12:OAc）的能力（图6A）。该搜索策略在检测到信息素时进行逆风冲刺，而在未检测到时进行螺旋式搜寻²⁸。信息素的存在由步骤4.3中所述的神经形态探测器根据EAG信号进行判断。图6B展示了搜索过程中记录的两个EAG示例。在无气味源的情况下，EAG信号保持在零附近（即 2.5 V），极少或几乎没有检测信号。机器人执行螺旋式搜寻，通常在到达目标位置前便离开搜索区域（在92%的试验中，n = 26次试验，图6C右侧）。在存在气味源的情况下（图6C左侧），EAG信号呈现活动爆发（检测信号）与静默期（无检测信号）交替的模式。螺旋式搜寻主要发生在气味羽流边缘（图6C左侧，红线），当气味信号丢失时，该策略似乎能有效重新定位羽流中心线。在此条件下，气味源通常能够被找到（成功率 = 96%，n = 44次试验）。

图1. 完整昆虫个体的EAG制备及机器人装置示意图。A) 电触角图（EAG）记录来自完整昆虫个体的制备样本（详见正文）。B) 将制备好的样本安装在机器人装置上。请点击此处查看该图的高清版本。

图2. 硬件-软件接口。A) 硬件的Eagle电路图。该电路由六个部分组成（详见正文）。其可在0.1–500 Hz频带（50 Hz陷波）内实现信号滤波、放大（总增益250倍）以及0–5 V范围内的信号调理。B) Eagle布局图，显示铜线走线（顶部为红色，底部为蓝色）和焊盘孔（绿色）。C) 印刷电路板（PCB），展示分立元件。D) 使用Qt-C++编写的图形用户界面（GUI），用于数据可视化（红色曲线 = EAG输入，绿色曲线 = 神经元模型输出）、滤波器设计和信号检测。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. EAG信号检测。A) 触角电位图（EAG）模型。EAG 通过非线性级联进行建模²⁷ 由一个静态非线性环节后接一个1^st 具有指数脉冲函数的低通滤波器 EAG 输出由以下卷积积分给出： . B) 工程学方法。去卷积滤波器写入 和 ，详见正文。当出现气味接触（命中）时即被检测到超过预设阈值。 C) 受生物启发的方法。一种具有五种内向电流（漏电、K⁺，Na⁺，Ca²⁺ 并使用SK来重现实验中观察到的兴奋-抑制（E-I）放电模式¹³在信号检测中，将EAG信号用作输入电流，当放电活动出现先兴奋后抑制的脉冲序列时，即判定为一次有效信号检测。

图4. EAG响应时间。A) 对以不同频率（1、2、4、6、8和10脉冲/秒）施加的持续20毫秒的信息素脉冲（剂量为1 μg和10 μg）所记录的EAG响应。图中显示了在1 Hz和10 Hz脉冲刺激下（剂量为1 μg和10 μg）的归一化EAG功率谱。EAG可分辨高达10 Hz的单个脉冲。B) 气体传感器TGS2620对乙醇（浓度波动）的响应记录。虚线和实线分别表示带盖与不带盖时传感器的响应。带盖的传感器响应时间为数十秒，因此无法跟随气体浓度的快速波动。而不带盖的TGS2620可分辨高达1 Hz的单个浓度波动。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5. 电天线图稳定性（整体昆虫制备 vs 离体触角）。对整体昆虫制备（n = 12 只蛾）每小时记录一次 EAG，持续 8 小时；对离体触角（n = 7 对触角）每 20 分钟记录一次，持续 3.2 小时。图中显示的是相对 EAG 值（以 t = 0 时的初始值为 100%）。离体触角的时间依赖性数据与寿命为 2 小时（半衰期为 1.5 小时）的指数衰减拟合良好。

图6. 机器人实验。A) 激增-扫描策略在检测到气味时向风向上游移动（激增），在未检测到气味时进行螺旋式扫描（扫描）²⁸。B) 机器人移动过程中记录的典型EAG信号（有气味和无气味条件下）。C) 有气味（n = 44 次试验）和无气味（n = 26 次试验）条件下的机器人轨迹。红色虚线表示气味羽流轮廓，在该轮廓内90%的检测事件发生在试验过程中。实验条件：搜索区域 = 4 m × 2.5 m，机器人速度 = 5.6 cm/sec，目标物 = 10 μg 信息素滴加在滤纸上，每2次试验更换一次，机器人起始位置 = 距目标2 m，目标位置处风速 = 0.9 ± 0.2 m/sec。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

近二十年前，Kanzaki 及其同事率先提出了在嗅觉机器人上使用触角电图（EAG）的构想^29-30。他们的技术最初基于离体触角。本文中，我们采用完整触角进行记录，以提高检测灵敏度和制备物的使用寿命。其他研究^31-32也注意到，整体制备物在性能上优于分离的触角。在我们的机器人实验中，记录信号在一天内保持稳定。相比之下，分离触角上的EAG信号寿命仅为2小时（图5）。

我们的EAG-机器人平台主要被开发用于检验关于昆虫嗅觉编码和搜索策略的生物学假说¹³。类似于接收来自昆虫触角输入的中枢神经元，我们将一个神经元模型连接到机器人上真实的蛾类触角，并根据其放电模式实现信息素的检测。检测与未检测事件随后被用于驱动机器人朝向信息素源移动。此处考虑的反应式搜索策略受到雄性蛾类被性信息素吸引时行为模式的启发。该策略在实验室条件下表现良好（图6），能够在相对较大的搜索空间中定位低释放量的信息素源（本研究中信息素剂量为10 μg，而此前研究²⁴为10 mg；初始距离为2 m，而此前实验^20-21中为10 cm）。

这些机器人实验应被视为概念验证，表明昆虫触角适用于机器人嗅觉搜索。尽管已知昆虫触角能够响应有毒气体、毒品和爆炸物^9-11，但要应用于真实场景，仍需进行多项改进。首先，在超过10 m的距离上，当气味羽流的重新捕获变得极不可能时，可能需要采用更复杂的搜索方法^34-36以提高效率。其次，为了检测目标气味物质，可能需要将来自不同物种的触角电位（EAG）信号整合到生物电子鼻的配置中¹⁴。第三，通过记录同一昆虫的两条触角信号获得的双侧感知能力，可能在有效性方面带来优势；两条传感器并行使用确实可增强方向性。第四，尽管在蛾类中并不具有生物学相关性，但为实现实际应用，仍应考虑将搜索策略扩展至多机器人协同搜索³⁷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agrotis ipsilon	PISC http://www-physiologie-insecte.versailles.inra.fr/indexenglish.php		蛾类
Robot Khepera III	K-team www.k-team.com		Khe3Base + KorBotLE + KorWifi
KoreIOLE	K-team		输入/输出扩展板
EAG-robot 接口	LORIA www.loria.fr		定制硬件与软件
Sirene	LORIA		神经元模拟器 sirene.gforge.inria.fr
Eagle	CadSoft www.cadsoftusa.com		PCB 设计软件
显微操作器	Narishige / Bio-logic	UN-3C
磁性底座	Narishige/ Bio-logic	USM-6
适配器	Narishige/ Bio-logic	UX-6-6
万向节	Narishige/ Bio-logic	UPN-B
微型剪刀	MORIA / Phymep	15371-92
蔡司 Stémi 2000 体视显微镜	Fisher Scientific	B19961
20 W KL200 光源	Fisher Scientific	W41745
Narishige PC-10 Na PC-1	Narishige	Narishige PC-10
毛细管 Na PC-1	Fisher scientific	C01065
信息素 cis-7-十二碳烯乙酸酯(Z7-12:OAc)	Sigma-Aldrich	259829
3 支装移液器：2–20 µl / 50–200 µl / 100–1,000 µl	Eppendorf	4910000514	用于信息素稀释及滴加至滤纸
气体传感器 TGS2620	Figaro www.figarosensor.com		可选，用于与EAG比较
电极拉制仪	Narishige	PC-10