对形态学和神经化学鉴定的海马中间神经元进行全细胞膜片钳记录

摘要

皮层网络由少量但类型多样的抑制性中间神经元所调控。因此，对中间神经元的功能研究需要靶向记录和严格鉴定。本文描述了一种联合方法，包括对单个神经元或突触耦合的成对神经元进行全细胞记录并结合细胞内标记，以及后续的形态学和免疫细胞化学分析。

摘要

GABA能抑制性中间神经元在脑内神经环路中发挥核心作用。中间神经元仅占神经元群体的一小部分（10–20%），但其在生理学、形态学和神经化学方面表现出高度异质性，反映了它们功能的多样性。因此，对中间神经元的研究为理解神经环路的组织原则和功能提供了重要线索。然而，这需要结合生理学与神经解剖学的方法，以选择并鉴定特定类型的中间神经元。利用在中间神经元特异性标记物启动子驱动下表达荧光蛋白的转基因动物，对其急性脑切片进行全细胞膜片钳记录，是一种有效靶向并电生理表征特定中间神经元类型内在特性和突触特性的方法。结合细胞内染料标记，该方法可进一步进行事后形态学和免疫细胞化学分析，从而系统性地鉴定所记录的神经元。这些方法可根据广泛的科学问题进行调整，适用于研究多种皮层神经元的功能特性。

引言

由于海马神经元回路在学习、记忆以及人类和啮齿类动物空间导航中的关键作用，其解剖学和生理学特性长期以来一直受到广泛关注。同时，海马结构显著而简单的层状排列使其成为研究皮质网络结构与功能特性的理想脑区。

海马回路由兴奋性主细胞（>80%）和一小部分（10–20%）但高度多样化的抑制性中间神经元组成^1-3。中间神经元从其轴突末梢释放γ-氨基丁酸（GABA），作用于快速的离子型GABA_A受体（GABA_ARs）和慢速的代谢型GABA_B受体（GABA_BRs）⁴。这些抑制机制可抵消兴奋性输入，并调控主细胞的兴奋性，从而调节其放电的时间和模式。然而，中间神经元释放的GABA不仅作用于主细胞，也作用于中间神经元自身^5,6。突触前和突触后受体介导了反馈调节以及不同类型中间神经元之间的相互抑制作用。这些中间神经元网络内的抑制机制被认为在群体活动模式（特别是不同频率的振荡）的产生和塑造过程中起核心作用⁷。

全细胞膜片钳记录是研究神经元内在特性和突触相互作用的成熟方法。然而，由于中间神经元类型的多样性较高，对抑制性中间神经元的研究需要对记录的细胞进行严格鉴定。由于海马中间神经元类型具有不同的形态学特征和神经化学标志物表达，结合解剖学和免疫细胞化学检测可为精确确定中间....

方案

伦理声明：所有实验操作和动物饲养均遵循机构指南、德国动物福利法、欧洲理事会关于动物保护的指令86/609/EEC以及当地主管部门的指导方针（柏林，T-0215/11）

1. 急性海马切片的制备

1. 取一只表达荧光蛋白Venus/YFP的转基因大鼠（17至24日龄），该蛋白在vGAT启动子驱动下可标记大部分皮层抑制性中间神经元¹³。将大鼠断头后迅速解剖出脑组织（<40秒），并将其浸入预冷、持续通入碳合气（95% O₂/5% CO₂）的蔗糖型人工脑脊液（sucrose-ACSF，图1A）中。
2. 使用安装在护目镜上的505 nm LED灯和515 nm发射滤光片，检测离体大鼠脑组织中Venus/YFP的荧光信号。
3. 用解剖刀切除额叶前三分之一部分及小脑，随后分离两侧半球；再去除皮层背侧表面，以获得一个平整的粘附面，便于后续固定脑组织，操作方法如前所述¹⁴。
4. 在振动切片机上将海马结构切成300 μm厚的横切片，切片过程中应将脑半球置于预冷且持续通入碳合气的蔗糖-ACSF中（图1B）¹⁴。同时去除额前皮层、中脑和脑干等多余组织。将每一片切片转移至盛有蔗糖-ACSF的浸没式储存室中，该溶液需持续通入碳合气并加热至35 ºC。

结果

只要脑片质量足够好，即可相对容易地对CA1锥体细胞（PCs）和快速放电型中间神经元（FS-INs）进行记录。该转基因大鼠品系在vGAT启动子驱动下表达Venus/YFP¹³ 不能明确鉴定FS-INs，也确实无法鉴定BCs。然而，对周围及其中的INs进行记录 锥体细胞层，其中FS-INs的密度通常较高¹，导致选择FS-INs的概率较高（图2B）。FS-INs 可通过其特有的生理特性与 CA1 PCs 和 RS-INs 区分开来。它们具有相对较去极化的静息膜电位（-58.9 ± 1.5 毫伏，15 细胞，与 -62.6 相比 ± 1.1 mV 在 CA1 锥体细胞中，26 个细胞），低输入电阻（92 ± 12 MΩ 对比 103 ± 14 MΩ 在PCs中）和较快的表观膜时间常数（15.4 ± 2.6 毫秒 与 22.0 ± 2.7 毫秒（在浦肯野细胞中），导.......

讨论

我们介绍一种方法，该方法结合电生理学与神经解剖学技术，在体外对形态学和神经化学特性明确的神经元进行功能性表征，特别是对皮层抑制性中间神经元（INs）的多种类型进行研究。该实验流程的关键步骤包括：（1）预先筛选潜在的中间神经元；（2）细胞内记录与神经元可视化；最后（3）对记录过的中间神经元进行形态学及免疫细胞化学分析。尽管本研究特别针对小清蛋白阳性中间神经元（PV-INs），但所描述的实验方案只需稍作调整，即可适用于其他类型中间神经元或各类神经元的类似记录研究。

皮层区域的中间神经元数量相对较少，因此对这些细胞进行随机选择和记录效率极低。由于不同中间神经元在定位和形态特征上的差异，研究人员得以区分并常规记录某些类型的中间神经元。然而在脑片中，对胞体层内及邻近区域的中间神经元进行鉴定仍然困难，例如快速放电型中间神经元（FS-INs）。随着能够在特定中间神经元群体中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系的出现，这一难题得到了优雅的解决，使得这些神经元的预先筛选和记录效率大大提高²。目前已有多种可用的转基因品系，主要是小鼠，但大鼠品系也日益增多¹³，这为中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转基因 vGAT-venus 大鼠			参见 Uematsu 等人， 等, 2008
Venus（515 nm）护目镜	BLS有限公司，匈牙利
解剖工具	即 FST		用于脑组织取出
振动切片机	Leica	VT1200S	或具有最小垂直振荡的其他高端振动切片机
切片孵育室			实验室自制
直立式红外微分干涉相差显微镜	日本 Olympus	BX50WI	使用显微操作仪系统； 即 Luigs 和 Neumann，Kleindiek 等等。
CCD相机	Till Photonics	VX55
505 nm LED 系统	凯恩研究	OptiLED 系统	或汞灯或其他LED系统 即 CooLED
Multiclamp 700B	Axon Instruments		或者使用两台 Axopatch 200B 放大器
WinWCP 采集软件	John Dempster，斯特拉斯克莱德大学		任何高质量的采集软件均可使用， 即 EPHUS、pClamp、Igor 等
电极拉制仪	Sutter	P-97	与盒式灯丝一起使用
硼硅酸盐移液管玻璃	希尔根贝格，德国	1405020	外径2 mm，内径1 mm，无纤维丝
蠕动泵	Gilson	Minipuls	可使用其他泵或重力进样替代
数字温度计			定制
数字压力计	Supertech，匈牙利
独立恒压刺激器	Digitimer Ltd.	DS-2A
生物胞素	Invitrogen	B1592	又称 ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) 二钠盐	Abcam 生化产品	ab120271
DNQX 二钠盐	Abcam 生化产品	ab120169	或者 NBQX 或 CNQX
加巴嗪（SR95531）	Abcam 生化产品	ab120042	或选用荷包牡丹碱甲碘化物
R-巴氯芬	Abcam 生化产品	ab120325
CGP-55,845 盐酸盐	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
抗PV小鼠单克隆抗体	斯旺特，瑞士	235	工作浓度 1:5,000–1:10,000
抗小鼠二抗	Invitrogen	A11030	若使用 Venus 或 GFP 转基因啮齿动物，请采用红色通道（即 建议使用546 nm。
正常山羊血清	Vector Labs	S-1000
显微镜载玻片			任何高质量品牌
玻璃盖玻片			通常为 22 x 22 mm
琼脂垫片			琼脂块，使用振动切片机切成300 μm
激光扫描共聚焦显微镜	日本 Olympus	Fluoview FV1000	或其他类似系统
Fiji（Fiji 即 ImageJ）	http://fiji.sc/Fiji		参见 Schindelin 等, 2012