对形态学和神经化学鉴定的海马中间神经元进行全细胞膜片钳记录

摘要

皮层网络由少量但类型多样的抑制性中间神经元所调控。因此，对中间神经元的功能研究需要靶向记录和严格鉴定。本文描述了一种联合方法，包括对单个神经元或突触耦合的成对神经元进行全细胞记录并结合细胞内标记，以及后续的形态学和免疫细胞化学分析。

摘要

GABA能抑制性中间神经元在脑内神经环路中发挥核心作用。中间神经元仅占神经元群体的一小部分（10–20%），但其在生理学、形态学和神经化学方面表现出高度异质性，反映了它们功能的多样性。因此，对中间神经元的研究为理解神经环路的组织原则和功能提供了重要线索。然而，这需要结合生理学与神经解剖学的方法，以选择并鉴定特定类型的中间神经元。利用在中间神经元特异性标记物启动子驱动下表达荧光蛋白的转基因动物，对其急性脑切片进行全细胞膜片钳记录，是一种有效靶向并电生理表征特定中间神经元类型内在特性和突触特性的方法。结合细胞内染料标记，该方法可进一步进行事后形态学和免疫细胞化学分析，从而系统性地鉴定所记录的神经元。这些方法可根据广泛的科学问题进行调整，适用于研究多种皮层神经元的功能特性。

引言

由于海马神经元回路在学习、记忆以及人类和啮齿类动物空间导航中的关键作用，其解剖学和生理学特性长期以来一直受到广泛关注。同时，海马结构显著而简单的层状排列使其成为研究皮质网络结构与功能特性的理想脑区。

海马回路由兴奋性主细胞（>80%）和一小部分（10–20%）但高度多样化的抑制性中间神经元组成^1-3。中间神经元从其轴突末梢释放γ-氨基丁酸（GABA），作用于快速的离子型GABA_A受体（GABA_ARs）和慢速的代谢型GABA_B受体（GABA_BRs）⁴。这些抑制机制可抵消兴奋性输入，并调控主细胞的兴奋性，从而调节其放电的时间和模式。然而，中间神经元释放的GABA不仅作用于主细胞，也作用于中间神经元自身^5,6。突触前和突触后受体介导了反馈调节以及不同类型中间神经元之间的相互抑制作用。这些中间神经元网络内的抑制机制被认为在群体活动模式（特别是不同频率的振荡）的产生和塑造过程中起核心作用⁷。

全细胞膜片钳记录是研究神经元内在特性和突触相互作用的成熟方法。然而，由于中间神经元类型的多样性较高，对抑制性中间神经元的研究需要对记录的细胞进行严格鉴定。由于海马中间神经元类型具有不同的形态学特征和神经化学标志物表达，结合解剖学和免疫细胞化学检测可为精确确定中间神经元身份提供有效手段^6,8,9。

本文介绍了一种实验方法，该方法将单个神经元或突触耦合神经元对的全细胞膜片钳记录与细胞内标记相结合，随后进行离体后的形态学和免疫细胞化学分析，从而实现对已鉴定中间神经元中由GABA_B受体介导的慢抑制效应的表征。作为示例，我们聚焦于一种主要类型的中间神经元，即所谓的“篮状细胞”（BC）的一个亚群，这类细胞支配其突触后靶细胞的胞体和近端树突，具有“快速放电”（FS）的放电模式、轴突密集覆盖细胞体层，并表达钙结合蛋白小清蛋白（PV）^10,11。这些中间神经元在GABA_BR激活时表现出显著的突触后抑制性电流以及其突触输出的明显突触前调节¹²。此处描述的技术组合同样适用于研究其他多种已鉴定神经元类型的固有特性或突触机制。

方案

伦理声明：所有实验操作和动物饲养均遵循机构指南、德国动物福利法、欧洲理事会关于动物保护的指令86/609/EEC以及当地主管部门的指导方针（柏林，T-0215/11）

1. 急性海马切片的制备

1. 取一只表达荧光蛋白Venus/YFP的转基因大鼠（17至24日龄），该蛋白在vGAT启动子驱动下可标记大部分皮层抑制性中间神经元¹³。将大鼠断头后迅速解剖出脑组织（<40秒），并将其浸入预冷、持续通入碳合气（95% O₂/5% CO₂）的蔗糖型人工脑脊液（sucrose-ACSF，图1A）中。
2. 使用安装在护目镜上的505 nm LED灯和515 nm发射滤光片，检测离体大鼠脑组织中Venus/YFP的荧光信号。
3. 用解剖刀切除额叶前三分之一部分及小脑，随后分离两侧半球；再去除皮层背侧表面，以获得一个平整的粘附面，便于后续固定脑组织，操作方法如前所述¹⁴。
4. 在振动切片机上将海马结构切成300 μm厚的横切片，切片过程中应将脑半球置于预冷且持续通入碳合气的蔗糖-ACSF中（图1B）¹⁴。同时去除额前皮层、中脑和脑干等多余组织。将每一片切片转移至盛有蔗糖-ACSF的浸没式储存室中，该溶液需持续通入碳合气并加热至35 ºC。
5. 从最后一片切片进入温育ACSF开始计时，让切片在35 ºC下恢复30分钟，以重新激活代谢过程并促进被切断的神经突起重新封闭。随后转移至室温下保存（图1C）。

2. 记录电极的制备与填充

1. 使用玻璃毛细管拉制膜片钳电极，使其在充满过滤（注射器滤器，孔径：0.2 μm）的含0.1%生物胞素（用于细胞内标记）的细胞内液后，电极阻抗达到2–4 MΩ。将细胞内液置于冰上冷藏，以防止其成分降解。
2. 用于鉴定突触后电流的膜片钳电极，应充入含有生理相关低Cl^-浓度的溶液（E_R(Cl-) = -61 mV；参见溶液列表）。
3. 对于配对记录以鉴定突触前受体介导反应的情况，膜片钳电极应填充低Ca²⁺缓冲能力的细胞内液，以避免干扰突触前神经递质释放，同时提高Cl^-浓度至4倍（E_R(Cl-) = -20 mV），以改善所观察到的IPSCs的信噪比⁵，从而准确评估药理学反应性。需注意，改变Cl^-浓度可能影响IPSC的动力学特性¹⁵。

3. 来自FS-INs的全细胞膜片钳记录

1. 将ACSF通入碳合气体，并通过蠕动泵（同时通过吸液管路从记录室中移除ACSF，图2A）输送至记录室。开启实验装置中的所有设备，准备进行记录。
2. 将脑片转移至记录室，并用串有单根丝线的铂金环固定。调整脑片位置，使CA1区的锥体细胞层（str. pyramidale）在视野中呈垂直走向，以便同时用两根移液管分别接触辐射层（str. radiatum）和最内层（str. oriens）（图2C和图4A）。
3. 将记录室放入实验装置中，开始以5–10 ml/min的流速灌注已碳合气体饱和并加热至32–34 ºC的记录用ACSF。
4. 在40倍物镜下使用红外微分干涉（IR-DIC）光学系统评估脑片质量，并通过CCD相机在显示器上观察。若在平滑且轻微凹凸的表面下20–30 μm深度处的锥体细胞层中可见大量圆形、中等对比度的CA1锥体神经元（CA1 PC），则认为脑片质量良好（图2C）。质量差的脑片则含有大量高对比度、皱缩或肿胀的细胞，且脑片表面不平整。
5. 在落射荧光照明下识别表达Venus/YFP的疑似快速放电型中间神经元（FS interneurons）（图2B），其大型多极胞体位于或靠近锥体细胞层。选择位于脑片较深层（50–100 μm，图2C）的细胞，以更好地保持其形态完整性。
6. 将记录电极安装至放大器头stage的移液管夹持器中，然后通过管路施加较低的正压（20–30 mBar）。将移液管降至脑片表面，略微偏离所选神经元的中心位置。
7. 按照先前描述的方法建立全细胞记录构型^14,16，参见图2D和图2E：
   1. 靶向细胞：将压力升至70–80 mBar，并迅速将移液管穿过脑片，降至目标细胞胞体正上方（图2D，顶部）。
   2. 接近细胞：将移液管轻压细胞膜，使其产生“凹陷”（图2D，顶部）。此步骤应迅速完成，以防止邻近细胞被生物胞素标记。
   3. 形成吉欧姆封接：释放压力，同时向移液管施加20 mV的电压指令。通常会迅速形成吉欧姆级封接（1–50 GΩ；图2D，底部和图2E，中部）。封接完成后，施加预期的静息膜电位（通常为-70至-60 mV）作为电压指令。
   4. 击穿膜片：封接形成后，施加短暂的负压脉冲以破裂膜片，从而实现全细胞记录构型（图2E，底部）。
8. 补偿全细胞电容和串联电阻（R_S）。R_S通常为5–20 MΩ，并在长达120 min内保持稳定。若穿入时膜电位（V_M）去极化程度超过-50 mV；初始R_S大于30 MΩ；或记录过程中R_S变化超过20%，则应放弃该细胞。
9. 通过快速放电型中间神经元（FS-INs）对一系列由超极化至去极化电流脉冲（-250至+250 pA，图2F，顶部）的响应（在电流钳模式下）进行识别。FS-INs具有相对较去极化的V_M（通常为-50至-60 mV）、较短的膜时间常数（<20 msec），并在注入500 pA去极化电流时产生频率>100 Hz的锋电位串（APs）¹¹（图2F，底部），这与CA1锥体神经元的响应明显不同（图2F，中部）。

4. 通过细胞外电刺激诱发 GABA_BR 介导的反应

1. 为观察突触诱发反应，将细胞外刺激电极（内充2 μL溶液的膜片钳玻璃微电极）置于适当位置 M NaCl；电阻：0.1–0.3 MΩ）在切片的边界处 辐射层 和 str. lacunosum-moleculare 将电极置于胞体外侧 200–300 μm 处，以避免对细胞进行直接电刺激，并减少刺激伪迹（图3A).
2. 待刺激电极定位后，对选定细胞进行全细胞记录，并按照第3.9节的方法在电流钳模式下评估其生理表型。图3B）.
3. 采用电压钳记录神经元（V_M -65 毫伏），以50 Hz的频率对突触前轴突施加电刺激 V（约500 μA 有效刺激），每20 秒，使用独立的恒压刺激器。采用单次刺激（持续时间100 μsec， 图3C，顶部）以观察GABA_BR介导的IPSCs，并与多刺激串（200 Hz）交替进行 Hz）以促进更多的神经递质释放。
4. 浴施离子型谷氨酸受体拮抗剂（AMPA受体：DNQX [10 μM]；NMDA受体：d-AP5 [50 μM]），以分离出单突触抑制性突触电流（IPSC）图3C，中上部）。进一步分离 GABA_BGABA应用下的R介导IPSC_AR阻断剂（加巴嗪[10 μM]）； 图3C 中下部
5. 确认产生的缓慢外向电流（图3C 较低，扩展）为 GABA_B由后续应用CGP-55,845 [5 μM]介导的图3C 较低，下方以灰色标示

5. 全程记录FS-IN与CA1-PC之间突触连接的配对记录

1. 通过同时记录突触耦合的中间神经元（IN）与锥体细胞（PC）之间的信号，评估GABA_BR介导的抑制性突触传递的突触前调控作用，记录方法如下所述。
2. 首先，建立突触前中间神经元的全细胞记录（如第3节所述），并确认其快放电（FS）表型（图4A）。
3. 随后，对邻近的CA1 PC进行膜片钳（距离20-100 μm，图4A），并向突触前IN（保持在电流钳模式）施加短暂的超阈值去极化电流脉冲（持续时间1 msec，幅度1-5 nA）以诱发动作电位（AP）。若存在突触连接，则IN中的动作电位将在电压钳制的CA1 PC中引发抑制性突触电流（IPSC），串联电阻（R_S）补偿至约80%。
4. 如有必要，更换新的记录电极并继续记录其他CA1 PC，直至发现有效连接。
5. 一旦建立连接，通过在突触前FS-IN中诱发成对动作电位，评估单个突触反应及其动态特性。采用典型的双脉冲刺激方案，两次去极化刺激间隔50 msec（图4B）。
6. 在基础条件下采集对照记录。随后，在灌流的ACSF中加入选择性GABA_BR激动剂巴氯芬（baclofen，10 μM），以激活GABA_BR，再加入拮抗剂CGP-55,845（5 μM），以完全阻断受体介导的效应。在每种药物作用达到稳态后，采集约50次记录（图4B和C）。
7. 记录完成后，通过形成外向膜片（outside-out patch）封闭胞体膜：在电压钳模式下缓慢将电极从细胞体移出，当串联电阻（R_S）上升时，将膜电位（V_M）降至-40 mV，以促进外向膜片的形成；随后将电极从浴液中移出。

6. 电生理学特性的分析

1. 注意：有多种不同的软件包可用于电生理数据的采集。此处使用的是免费的斯特拉斯克莱德电生理学软件包（Strathclyde Electrophysiology Software）中的 Windows 程序 WinWCP，该程序支持最多 16 个模拟输入通道的记录以及 10 个数字信号的输出。
2. 将所有数据以 5–10 kHz 进行低通滤波，并以 20 kHz 的频率采样。
3. 使用离线分析套件分析生理数据。
   注意：本实例中使用的是包含 Python 命令行的开源软件包 Stimfit；但也可轻松替换为其他替代软件。
   1. 从电流钳模式下记录的神经元静息膜电位出发，分析其被动膜特性。
   2. 从记录起始阶段记录反应的基线测量平均静息膜电位。
   3. 利用欧姆定律，根据对最小超极化电流脉冲（≤ -50 pA）产生的电压反应计算输入电阻。为提高信噪比，需对多个轨迹进行平均。注意：本研究中的示例通常为 10–50 次独立扫描的平均值。
4. 通过将单指数曲线拟合至最小超极化电流脉冲反应的衰减相，估算表观膜时间常数。
5. 分析动作电位波形，确定由阈值去极化电流脉冲诱发的动作电位阈值、幅度（从阈值到峰值）和持续时间（在半峰高度处测量的宽度）。
6. 从电压钳记录中分析 GABA_BR 介导的抑制性突触电流（IPSCs）。对轨迹进行离线高斯滤波（500 Hz），并评估 GABA_BR 介导反应的峰值幅度和潜伏期（至少 10 次轨迹的平均值）。
7. 通过测量 GABA_AR 介导的抑制性突触电流（IPSCs）峰值与其前基线之间的峰值幅度变化，检测 GABA_BR 对中间神经元（INs）抑制性输出的影响。分别计算对照期以及所有药理学处理阶段稳态下 ≥50 次轨迹的平均幅度。

7. FS-Ins 的可视化与免疫细胞化学染色

1. 记录完成后，将脑片浸入含4%多聚甲醛和0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH=7.35）中，于4 °C过夜固定。
2. 如有需要，可将脑片转移至PB中，并在处理前于4 °C保存约1周。
3. 用新鲜PB充分洗涤脑片，随后在含0.9% NaCl的0.025 M PB（PBS，pH=7.35）中洗涤。
4. 为减少非特异性抗体结合，将脑片在含有10%正常山羊血清（NGS）、0.3% Triton-X100（用于膜通透的去垢剂）和0.05% NaN₃的PBS溶液中，于室温封闭1小时。
5. 为标记PV表达，使用抗PV单克隆小鼠抗体，将其稀释于含5% NGS、0.3% Triton-X100和0.05% NaN₃的PBS溶液中，4 °C孵育2–3 天¹²。随后用PBS彻底漂洗脑片。
6. 加入荧光标记的抗小鼠二抗（例如 Alexafluor-546），同时加入与荧光染料偶联的生物素结合蛋白链霉亲和素（例如，Alexafluor-647）；将上述试剂溶于含3% NGS、0.1% Triton-X100和0.05% NaN₃的PBS溶液中，4 °C避光过夜孵育。
7. 用PBS充分漂洗脑片2–3次 ，再用PB漂洗2–3次。将脑片贴附于载玻片上，使用300 μm厚的琼脂垫片防止组织塌陷。用荧光封片剂加盖盖玻片，并以指甲油封固。

8. 可视化FS-Ins的成像与重建

1. 使用扫描共聚焦显微镜观察切片，用适当的激光线激发荧光染料报告分子（Alexafluor-647 采用 635 nm 的二极管激光；Alexafluor-546 标记 PV 采用 543 nm 的氦-氖激光；Venus/YFP 采用 488 或 515 nm 的氩离子激光）。
2. 以适当的 Z 轴分辨率（通常为 0.5–1 μm 步长，使用 20X 物镜）采集图像，生成整个细胞的 Z 轴图像序列（Z-stack）。通常需要多个图像序列以覆盖整个细胞，可后续使用 FIJI/ImageJ 软件进行数字拼接（图 5A）。
3. 利用半自动追踪方法（FIJI/ImageJ 软件包中的 Simple Neurite Tracer 插件¹⁷）对拼接后的图像序列进行细胞重建（图 5C）。
4. 最后，使用高数值孔径物镜（60X 硅油浸入式物镜，N.A.=1.3）评估中间神经元的 PV 免疫反应性。对胞体、近端树突和近端轴突成像，或在胞体 PV 洗脱过强时改为其轴突末梢成像。若免疫标记信号与生物胞素标记的结构一致，则判定该细胞对 PV 具有免疫反应性（图 5B）。

结果

只要脑片质量足够好，即可相对容易地对CA1锥体细胞（PCs）和快速放电型中间神经元（FS-INs）进行记录。该转基因大鼠品系在vGAT启动子驱动下表达Venus/YFP¹³ 不能明确鉴定FS-INs，也确实无法鉴定BCs。然而，对周围及其中的INs进行记录 锥体细胞层，其中FS-INs的密度通常较高¹，导致选择FS-INs的概率较高（图2B）。FS-INs 可通过其特有的生理特性与 CA1 PCs 和 RS-INs 区分开来。它们具有相对较去极化的静息膜电位（-58.9 ± 1.5 毫伏，15 细胞，与 -62.6 相比 ± 1.1 mV 在 CA1 锥体细胞中，26 个细胞），低输入电阻（92 ± 12 MΩ 对比 103 ± 14 MΩ 在PCs中）和较快的表观膜时间常数（15.4 ± 2.6 毫秒 与 22.0 ± 2.7 毫秒（在浦肯野细胞中），导...

讨论

我们介绍一种方法，该方法结合电生理学与神经解剖学技术，在体外对形态学和神经化学特性明确的神经元进行功能性表征，特别是对皮层抑制性中间神经元（INs）的多种类型进行研究。该实验流程的关键步骤包括：（1）预先筛选潜在的中间神经元；（2）细胞内记录与神经元可视化；最后（3）对记录过的中间神经元进行形态学及免疫细胞化学分析。尽管本研究特别针对小清蛋白阳性中间神经元（PV-INs），但所描述的实验方案只需稍作调整，即可适用于其他类型中间神经元或各类神经元的类似记录研究。

皮层区域的中间神经元数量相对较少，因此对这些细胞进行随机选择和记录效率极低。由于不同中间神经元在定位和形态特征上的差异，研究人员得以区分并常规记录某些类型的中间神经元。然而在脑片中，对胞体层内及邻近区域的中间神经元进行鉴定仍然困难，例如快速放电型中间神经元（FS-INs）。随着能够在特定中间神经元群体中表达荧光蛋白的转基因小鼠品系的出现，这一难题得到了优雅的解决，使得这些神经元的预先筛选和记录效率大大提高²。目前已有多种可用的转基因品系，主要是小鼠，但大鼠品系也日益增多¹³，这为中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
转基因 vGAT-venus 大鼠			参见 Uematsu 等人， 等, 2008
Venus（515 nm）护目镜	BLS有限公司，匈牙利
解剖工具	即 FST		用于脑组织取出
振动切片机	Leica	VT1200S	或具有最小垂直振荡的其他高端振动切片机
切片孵育室			实验室自制
直立式红外微分干涉相差显微镜	日本 Olympus	BX50WI	使用显微操作仪系统； 即 Luigs 和 Neumann，Kleindiek 等等。
CCD相机	Till Photonics	VX55
505 nm LED 系统	凯恩研究	OptiLED 系统	或汞灯或其他LED系统 即 CooLED
Multiclamp 700B	Axon Instruments		或者使用两台 Axopatch 200B 放大器
WinWCP 采集软件	John Dempster，斯特拉斯克莱德大学		任何高质量的采集软件均可使用， 即 EPHUS、pClamp、Igor 等
电极拉制仪	Sutter	P-97	与盒式灯丝一起使用
硼硅酸盐移液管玻璃	希尔根贝格，德国	1405020	外径2 mm，内径1 mm，无纤维丝
蠕动泵	Gilson	Minipuls	可使用其他泵或重力进样替代
数字温度计			定制
数字压力计	Supertech，匈牙利
独立恒压刺激器	Digitimer Ltd.	DS-2A
生物胞素	Invitrogen	B1592	又称 ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) 二钠盐	Abcam 生化产品	ab120271
DNQX 二钠盐	Abcam 生化产品	ab120169	或者 NBQX 或 CNQX
加巴嗪（SR95531）	Abcam 生化产品	ab120042	或选用荷包牡丹碱甲碘化物
R-巴氯芬	Abcam 生化产品	ab120325
CGP-55,845 盐酸盐	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
抗PV小鼠单克隆抗体	斯旺特，瑞士	235	工作浓度 1:5,000–1:10,000
抗小鼠二抗	Invitrogen	A11030	若使用 Venus 或 GFP 转基因啮齿动物，请采用红色通道（即 建议使用546 nm。
正常山羊血清	Vector Labs	S-1000
显微镜载玻片			任何高质量品牌
玻璃盖玻片			通常为 22 x 22 mm
琼脂垫片			琼脂块，使用振动切片机切成300 μm
激光扫描共聚焦显微镜	日本 Olympus	Fluoview FV1000	或其他类似系统
Fiji（Fiji 即 ImageJ）	http://fiji.sc/Fiji		参见 Schindelin 等, 2012