一种用于间隙连接功能检测的实验方法；在氧化铟锡上对贴壁细胞进行电穿孔

摘要

本演示介绍了一种利用电穿孔技术对贴壁培养细胞进行研究的方法，用于分析细胞间连接通讯，同时细胞生长在涂有导电透明氧化铟锡的载玻片上。

摘要

该技术将细胞培养在部分镀有氧化铟锡（ITO）的玻璃载片上，ITO 是一种透明且具有导电性的材料。通过这种非创伤性的方式，可将多种分子（如多肽或寡核苷酸）导入几乎 100% 的细胞中。  此处，我们描述该技术如何用于研究细胞间通过缝隙连接的通讯。当对细胞所生长的导电表面施加电脉冲时，细胞膜上会形成孔道，荧光素黄即可进入细胞，这一过程称为电穿孔。紧邻电穿孔区域、生长在非导电 玻璃表面的细胞不会通过电穿孔摄取荧光素黄，但可通过连接它们与电穿孔细胞的缝隙连接，接收到传递而来的荧光染料。细胞间染料传递的结果可在荧光显微镜下观察。该技术可实现对缝隙连接通讯的精确定量。此外，该方法还可用于导入多肽或其他非通透性分子，而小分子多肽经电穿孔后通过缝隙连接传递至邻近未电穿孔细胞以抑制信号传导，是研究信号抑制作用的有力例证。

引言

对细胞施加电流会通过一种称为电穿孔的过程在细胞膜上形成孔隙。这些孔隙允许多种非通透性分子穿过细胞膜。通过精确控制电场，可使形成的孔隙非常微小，并在对细胞生理状态干扰最小的情况下迅速重新闭合。有趣的是，贴壁细胞可在涂有导电且透明的氧化铟锡（ITO）的玻片上培养，并进行电穿孔。 原位，即在细胞生长的表面上进行，无需将细胞从表面解离并在悬浮状态下进行电穿孔。细胞在此表面上可良好生长，且由于细胞保持贴壁和伸展状态，可实现精细的显微观察。利用该技术，可将小分子非通透性物质瞬时导入几乎所有100%的细胞中，因此该技术特别适用于研究受体在配体刺激后信号通路中各组分的激活情况（综述见¹).

电穿孔技术主要用于导入DNA（亦称为电转染）。然而，电穿孔 原位 可用于引入多种分子，例如多肽^2-4寡核苷酸，例如反义RNA、双链DNA诱饵寡核苷酸（用于抑制转录因子结合）或siRNA^3,5,6放射性核苷酸^7-10蛋白质¹¹¹² 或前体药物¹³电穿孔后，细胞可进行裂解以用于生化分析，或经固定后用抗体染色。

导电的ITO涂层非常薄，厚度为800-1,000Å，因此当细胞生长跨越导电涂层边缘时，不会因两种表面的高度差异而干扰细胞生长。这一特性使得未电穿孔的细胞可以与电穿孔的细胞并排培养，作为对照。如视频中所述，该方法也可用于检测间隙连接细胞间通讯（GJIC）。

间隙连接是连接相邻细胞内部的通道¹⁴间隙连接性细胞间通讯在肿瘤形成和转移过程中发挥重要作用，而癌基因（如Src）会抑制间隙连接性细胞间通讯^15,16为了检测间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），通常通过显微注射或划痕载入法将荧光染料（如 Lucifer yellow，LY）导入培养细胞中。¹⁷ 通过荧光照明在显微镜下观察染料向邻近细胞的扩散情况。然而，这些技术 invariably 会造成细胞损伤。本文描述了一种细胞培养于部分涂覆 ITO 的玻璃载片上的技术¹⁸在载玻片的导电区域上生长的细胞中加入LY（或其他染料）后施加电脉冲，使染料进入细胞，同时在荧光照明下通过显微镜观察染料向相邻未电穿孔细胞的迁移情况。为了避免干扰容易从单层脱落的敏感细胞，设计了一种无需将电极放置在细胞上方即可施加电流的装置。¹⁹该方法能够在大量细胞中定量检测间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），且不会对细胞代谢产生可检测到的干扰，这一点通过血清刺激后G1期持续时间未受影响得以证实。¹²，fos原癌基因蛋白水平升高（Raptis，未发表）或两种与细胞应激相关的激酶p38^hog 或 JNK/SAPK 激酶¹这种方法使得考察两者之间的关联成为可能 水平 癌基因表达、转化及间隙连接通讯¹⁸，以及Src和Stat3在多种细胞类型中对GJIC的影响，包括从肺肿瘤标本中 freshly cultured 的细胞^20-23此外， 原位 采用所述无顶部电极装置进行电穿孔，已成功用于展示脂肪细胞分化过程中间隙连接的关闭，尽管在此阶段细胞对基质的贴附性有所降低^19,24.

方案

1. 将细胞接种至电穿孔室中

1. 在超净工作台中，按照常规无菌操作技术对细胞进行胰蛋白酶消化。
   注意：必须通过离心彻底去除胰蛋白酶的所有残留，因为其可能阻碍细胞在玻璃表面的铺展，从而影响黏附连接和间隙连接的形成。
2. 将1 ml细胞悬液移液至随附的无菌电穿孔室中 原位 电穿孔仪（图1），置于37 ^oC，CO₂ 培养箱
   注意：可通过在纤连蛋白、胶原蛋白、多聚赖氨酸或细胞与组织黏附剂上包被来提高细胞黏附性（参见材料表）。
3. 当细胞形成融合单层时，即可进行间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）检测。

2. 电穿孔实验步骤

由于电穿孔法检测间隙连接通讯（GJIC）仅需几分钟，因此可在超净工作台外进行。若特定实验需要更长的孵育时间，则可全程在超净工作台内进行。无论何种情况，细胞培养的腔室必须保持无菌。

1. 配制5 mg/ml的Lucifer yellow溶液：将10 mg LY粉末（随电穿孔仪提供）溶解于2 ml无钙培养基中。对于需要较长孵育时间的实验，需对溶液进行滤膜除菌，并于4^oC保存。
2. 吸除培养基，用无钙培养基轻轻洗涤细胞，注意避免刮伤单层细胞或使细胞干燥。若细胞干燥，其细胞核通常颜色变深，并在未进行电穿孔的情况下非特异性摄取LY染料。该现象在载玻片中央区域更为明显，因该区域更易暴露于气流中（图4F）。
3. 使用Eppendorf移液器将染料溶液（整个腔室加400 μl）沿腔室边缘加入，注意避免接触细胞层。
4. 将培养腔室放入电穿孔仪配套的夹持装置中，并施加适当强度的电脉冲（参见讨论部分）。
5. 小心吸除部分LY溶液。该溶液可在次要实验中重复使用一次。
6. 加入含10%透析血清的无钙DMEM培养基。
7. 将细胞置于培养箱中孵育3–5分钟，以允许染料通过间隙连接进行转移。
   注意：此步骤中加入透析血清有助于细胞膜孔道的闭合。
8. 用无钙DMEM洗涤未摄入的染料，用于活细胞观察。或者，可在本步骤固定细胞，即向孔中加入4%多聚甲醛，随后用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤。无论何种情况，洗涤步骤均需彻底去除背景染料。
   注意：在初步实验以确定最佳条件时，若电压过低，可将细胞在培养箱中恢复数分钟，然后对同一张载玻片进行第二次电穿孔，以节省载玻片成本。

3. 显微镜检查

1. 使用配备适合所用染料滤光片的倒置显微镜，在荧光照明下观察细胞。对于 Lucifer yellow，激发波长为 423 nm，发射波长为 555 nm，适用于 Nikon IX70 显微镜的 WBV 滤光片。
2. 在塑料小室中加满液体后，将玻璃盖玻片置于其上，以消除弯月面效应，从而在相差显微镜下观察细胞形态。为获得更清晰的图像，可将小室从载玻片上取下，再将盖玻片放置于框架上。对于固定后的细胞，可在小室中加入甘油以便显微观察；而对于活细胞，则必须使用培养基填充。
   注意：在染料转移后（如上文步骤 2.7 所述）用甲醛固定细胞，将更便于后续的洗涤和拍照。若细胞未固定，荧光通常在约 60 分钟内消失，具体时间取决于细胞类型、电压以及引入的 Lucifer yellow（LY）量；而在固定细胞中，荧光可维持数小时。然而，即使在固定细胞中，经过过夜（O/N）孵育后荧光也会逐渐减弱或消散。因此，电穿孔后应尽快拍照（图 2）。

4. 细胞间通讯的定量分析

1. 使用20倍物镜在荧光和相差显微镜下拍摄细胞照片（图3）。
2. 在电穿孔区域与非电穿孔区域交界处，识别并用星号标记发生电穿孔的细胞（图2，箭头所示，电穿孔边缘）。
3. 在非电穿孔侧识别并通过圆点标记因染料通过间隙连接转移而产生荧光的细胞（图3A 和 图3B）。
4. 将非电穿孔区域中荧光细胞的总数除以沿边缘的电穿孔细胞数量（图3A 和 图3B）。
   注意：每次实验需计算至少200个连续相邻的边缘电穿孔细胞的染料转移情况。所得数值即为GJIC值。

结果

图2显示了经电穿孔导入LY后的大鼠肝上皮T51B细胞²²，在固定和洗涤后，分别在荧光（图A和图B）或相差（图C）照明下拍摄的图像。在图A中，电穿孔区域的边缘以红色标出。红色线右侧的荧光梯度表示染料通过间隙连接进行了转移。在图3A和3B中展示了间隙连接通讯的定量结果：电穿孔区域边缘的细胞被识别并用星号标记，而染料转移到达的细胞则用圆点标记。该比值表示每个电穿孔边缘细胞平均转移染料至多少个细胞。在此示例中，共有57个圆点和10个星号，即，GJIC=5.7。

在 C 和 D 中，通过慢病毒载体稳定表达 siRNA，T51B 细胞中的信号转导子和转录激活子-3（Stat3）表达下调，导致间隙连接通讯（GJIC）减少，这表现为缺乏染料传递²²。

讨论

实验方案中的关键步骤

电穿孔材料
用于电穿孔的材料纯度至关重要。如果细胞非常扁平，则必须使用更高浓度的示踪染料（对于 Lucifer Yellow（LY）可高达 20 mg/ml），在这种情况下，材料纯度的重要性甚至超过形状更接近球形的细胞¹。除了 LY 外，已有多种其他染料或非通透性分子被使用，例如一系列 Alexa 染料，可用于检测由不同连接蛋白（connexins）组成的通道²⁵。然而，溴化乙锭（Ethidium Bromide）或碘化丙啶（Propidium Iodide）等染料会嵌入 DNA 中，导致细胞核强烈荧光，从而使染料转移的定量分析更加困难（图 4D）。示踪染料的配制及洗涤步骤必须在无钙生长培养基中进行，因为钙离子内流可能中断细胞间连接通讯，并降低细胞活力。所有溶液在电穿孔前必须保持在 37^oC，这有助于孔道闭合并提高细胞存活率¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Cellgro http://www.cellgro.com/	50-013-PB
不含钙的DMEM	Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)	SH30319-01
供体小牛血清	PAA: http://www.paa.com/	货号 B15-008
胎牛血清	PAA: http://www.paa.com/	货号 A15-751
电穿孔装置	Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/	ACE-100
培养室	Cell Projects Ltd UK	ACE-04-CC	4孔
培养室	Cell Projects Ltd UK	ACE-08-CC	8孔
荧光黄	Cell Projects Ltd UK	ACE-25-LY	高纯度
CelTak	BD Biosciences	354240	细胞和组织粘附剂
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F1141
胶原蛋白	BD Biosciences	354236
多聚赖氨酸	Sigma Aldrich	P8920