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方法文章

利用RNA催化剂作为报告系统筛选抗锥虫RNA编辑药物

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DOI：

10.3791/51712

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2014年7月22日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, McGill University, 2Institute of Parasitology, McGill University, 3McGill Centre for Bioinformatics, McGill University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种高灵敏度的基于核酶的检测方法，适用于对靶向锥虫病原体中RNA编辑这一独特过程的化合物进行高通量筛选。此类抑制剂既可作为研究RNA编辑过程的假设驱动型分析工具，最终也有望开发为治疗药物。

摘要

在确定锥虫线粒体RNA编辑机制方面已取得重大进展。同样，在鉴定催化RNA编辑的编辑体复合物组分方面也取得了显著进展。然而，目前仍不清楚这些蛋白质如何协同发挥作用。通过针对编辑体的高通量筛选获得的化学化合物可能阻断或影响编辑循环中的一个或多个步骤。因此，发现新的化学化合物将为解析编辑体的功能与组装提供有价值的分子探针。在以往的研究中， 体外 编辑活性检测采用放射性标记的RNA进行。这些检测方法耗时长、效率低，且不适用于高通量研究。本文介绍一种均相荧光为基础的“混合即检测”型锤头状核酶 体外 一种用于监测RNA编辑的报告基因检测方法被提出。只有当锤头状核酶发生RNA编辑后，荧光共振能量转移（FRET）寡核糖核苷酸底物才会被切割。随后，荧光基团与淬灭基团分离，从而产生信号。相反，当编辑体功能受到抑制时，荧光信号将被淬灭。该方法灵敏度高、操作简便，具有广泛的适用性，可用于监测 体外 RNA编辑或针对可抑制编辑体功能的化学物质进行高通量筛选。

引言

RNA编辑是一种转录后mRNA修饰过程，最初在锥虫科生物中被发现1。此后，针对布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中RNA编辑机制的研究已开展了大量工作2,3。在一系列酶促反应中，由约20种蛋白质组成的核心复合物——编辑体（editosome），可生成线粒体mRNA成熟产物，这些mRNA编码能量生成相关的氧化磷酸化系统的多个组分。催化反应的顺序由引导RNA（gRNA）决定，包括内切核酸酶切割、尿苷酸（U）的添加或删除，以及连接反应4。

除了核心编辑体复合物蛋白外，还鉴定出多种辅助因子5-7。这些蛋白通常以独立复合物的形式存在。然而，核心编辑体复合物中蛋白的组装顺序以及核心复合物与辅助复合物之间的相互作用模式仍有待阐明。针对锥虫类生物中的RNA编辑过程可能提供可用于研究编辑体复合物组装与功能的化学工具分子。此外，对多个编辑体蛋白的功能研究表明，它们在不同生活阶段均具有必需性，提示其具有作为药物靶点的潜力8-12。因此，已发现的编辑体抑制剂也可能作为抗锥虫类生物的先导化合物。这一研究方向恰逢其时，因为目前用于治疗锥虫类病原体所致疾病的药物普遍存在毒性高、疗效差和价格昂贵等问题13,14。

一种高效且便捷的方法 体外 检测对于探索能够阻断RNA编辑的特异性抑制剂的化学领域十分必要。目前已开发并应用了三种用于监测编辑体活性的检测方法：（a）完整循环 体外 RNA 编辑检测15，（b）预切割 体外 RNA编辑检测实验16,17，以及 (c) 基于锤头状核酶（HHR）的检测方法18前两种检测方法依赖于通过放射性标记直接观察编辑产物（ATPase 6 mRNA）。基于HHR的检测方法采用了一种经过修饰的ATPase 6 mRNA，其结构设计为在发生编辑后可发挥核酶功能。该功能性核酶随后特异性切割放射性标记的RNA底物，从而作为报告信号。最近，Moshiri 等 开发了一种基于HHR的“混合即测”方法 体外 利用报告基因检测监测RNA编辑，其中放射性标记的RNA底物被荧光共振能量转移（FRET）底物取代19该检测方法的主要优势在于：（a）它是一种快速便捷的“混合即检测”型检测，因为活性核酶的生成和底物切割在同一试管中的低体积体系内同时进行，即 20 μl）、（b）避免使用放射性标记材料、（c）在微孔板体系中利用荧光检测仪器提供的高灵敏度，以及（d）高信噪比。通过该检测方法，验证了已知RNA编辑连接酶抑制剂对纯化编辑体的作用19该实验验证了针对完整编辑体的RNA编辑抑制剂快速鉴定检测方法的有效性 T. brucei.

图1 基于荧光的详细逐步示意图 体外 RNA编辑检测实验。该方案可用于监测RNA编辑 体外 或可轻松适用于不同规模的化合物文库筛选。

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方案

以下方案描述了基于荧光的RNA编辑检测实验的操作步骤。该检测可根据实验规模在单个PCR管、96孔板或384孔板中进行。随后可在合适的实时PCR检测系统上读取荧光信号。本文所述方法以384孔板为例进行说明。

1. 培养T. brucei细胞

  1. 准备用于T. brucei前循环型细胞的培养基。配制1 L培养基：
    1. 将25.4 g SDM-79粉末溶解于800 ml MilliQ水中。
    2. 加入2 g NaHCO3，并用10 M NaOH调节pH至7.3。
    3. 加入超纯水至终体积为900 ml，过滤除菌。
    4. 加入胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液和血红素（2.5 mg/ml），使其终浓度分别为10%（v/v）、100 U/ml和7.5 mg/L。
  2. 在28 °C、70 rpm振荡条件下培养300 ml T. brucei 1.7A野生型（前循环型）细胞，使其密度达到1.5 × 107 个细胞/ml。注意：此培养量可获得约3 ml具有活性的编辑体，总蛋白量约为0.5 mg，足以进行600次编辑反应。
  3. 在4 °C下以6,000 × g离心10分钟收集细胞。
  4. 用50 ml预冷的PBSG缓冲液（10 mM Na2HPO4、10 mM NaH2PO4、145 mM NaCl和6 mM葡萄糖）洗涤沉淀，并在4 °C下以10,000 × g再次离心10分钟收集细胞。

2. 粗线粒体的分离

注意：所有步骤均应在冰上或 4 °C 下进行，以保持剪接体活性。

  1. 将收集的细胞重悬于30 ml DTE缓冲液（1 mM Tris-HCl pH 8.0 和 1 mM EDTA）中。使用预冷的40 ml无菌Dounce匀浆器，在冰上上下抽动至少10次，以破坏细胞膜。
  2. 立即加入 4.3 ml 60% 蔗糖溶液（w/v； 即 加入1.75 M的溶液至匀浆中，使终浓度为0.25 M。在4 °C下以15,800 × g离心10分钟，以优先沉淀线粒体。
  3. 将线粒体沉淀重悬于4.6 ml STM缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，250 mM蔗糖和2 mM MgCl₂）中2。加入13.8 μl的0.1 M CaCl₂2 加入4 μl无RNase的DNase I，使其终浓度分别为0.3 mM和9 U/ml。将混合物置于冰上孵育1小时。
  4. 加入4.6 ml STE缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，250 mM蔗糖，2 mM EDTA）以灭活DNase I。在4 °C下以15,800 × g离心10分钟。
  5. 将沉淀重悬于400 μl裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.2，10 mM MgCl₂）中2，100 mM KCl、1 µg/ml pepstatin、1 mM DTT 和 1x 完整无EDTA蛋白酶抑制剂），转移至微量离心管中。
  6. 加入10% Triton X-100至终浓度为1%，将裂解液在4 °C下于试管旋转仪中孵育15分钟。
  7. 在4 °C条件下，以17,000 × g离心15分钟，重复两次，澄清线粒体裂解液；每次保留上清液。

3. 编辑体纯化

  1. 使用2倍HHE梯度缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.9，20 mM Mg(OAc)2，100 mM KCl，2 mM EDTA）和梯度混合器，按照说明书在超速离心管中制备10 ml 10%-30%（v/v）的线性甘油梯度（表1）。
  2. 小心从甘油梯度顶部移除500 μl溶液，轻柔地加载500 μl澄清的线粒体裂解液。在4 °C条件下，使用超速离心机以178,000 × g离心6小时。
  3. 在4 °C条件下，从梯度顶部到底部依次收集500 µl的组分。然后使用液氮迅速冷冻各组分，并于-80 °C保存直至使用。

4. RNA 提取

  1. 将含有与T7启动子序列互补序列的相应DNA模板退火（表 2以1:1的摩尔比将T7启动子寡核苷酸（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）混合，90 °C加热3分钟，然后在室温下冷却至少10分钟。
  2. 使用以下方法转录 RNA 体外 按照说明书操作使用转录试剂盒。
  3. 通过加入等体积的7 M尿素上样缓冲液（7 M尿素，0.05% 茴香青，0.05% 溴酚蓝）终止转录反应。在经滤膜除菌的9%变性聚丙烯酰胺凝胶（9%丙烯酰胺，7 M尿素，1×TBE）上电泳运行。
  4. 使用短波紫外（UV）灯进行紫外阴影法，定位并切出相应的RNA。将切下的凝胶片段放入微量离心管中，加入400 µl凝胶洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5，250 mM NaOAc，1 mM EDTA和0.25% SDS）。在室温下置于管式旋转仪上过夜洗脱。
  5. 加入1 ml冷的100%乙醇沉淀洗脱的RNA，于-80 °C孵育30分钟，或于-20 °C过夜。
  6. 在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 30 分钟，使 RNA 沉淀。
  7. 用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。在4 °C下以16,000 x g离心20分钟。
  8. 将RNA沉淀用无RNase的水适当重悬，以达到所需的浓度，如图所示 表 2.

5. 基于荧光的RNA编辑检测法

  1. 对于单个反应，在微量离心管中混合1 pmol（1 µl）的preA6Rbz和2.5 pmol（1 µl）的gA6Rbz（摩尔比为1:2.5），在70 ºC孵育3分钟，然后在室温下静置至少10分钟。
  2. 同时，根据表3配制主混合液，不含preA6Rbz和gA6Rbz，用于编辑反应，其中包含1x HHE缓冲液（25 mM HEPES pH 7.9、10 mM Mg(OAc)2、50 mM KCl和10 mM EDTA）、1 mM ATP、5 mM CaCl2、16 ng/µl的酿酒酵母RNA、0.1% Triton X-100以及纯化的编辑体。
  3. 将退火后的preA6Rbz和gA6Rbz加入主混合液中，完成反应体系。
  4. 将18 µl主混合液（表3）分装至各孔中，每孔预先加入2 µl无RNase水（不含化合物的孔）或2 µl 200 µM的化合物，并根据图5在板中设置对照样品。
  5. 用封板膜密封反应板，短暂离心以去除气泡。在28 °C孵育4小时。
  6. 向每孔中加入25 pmol（2 µl）的gA6Rbz竞争物。更换新的封板膜，短暂离心后将反应板置于实时荧光定量PCR仪中。设置以下程序：
    步骤1：85 °C 5分钟；步骤2：24 °C 10分钟；步骤3：停止。
  7. 向每孔中加入15 pmol（1 µl）的FRET底物，终体积为23 µl。用新的封板膜密封反应板，快速离心后重新放回实时荧光定量PCR仪中。
  8. 设置新程序，包含以下步骤：
    步骤1：37 °C 1分钟；步骤2：读数；步骤3：返回步骤1，重复40次；步骤4：停止。
  9. 通过选择所有需要读数的孔并选择FAM滤光片进行板设置。输入体积为23 μl，开始运行。
  10. 通过绘制各孔/样品所得数值的斜率，计算其斜率以获得动力学测量结果，并以柱状图形式进行分析。注意：动力学读数可提高样品与背景之间的信噪比，因为背景样品的斜率接近于零；而终点读数的背景噪声较高。

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结果

为了展示建立大规模筛选实验所需的必要步骤，图2-5 为与检测质量相关的代表性对照实验。这些对照实验对于在多天筛选过程中保持检测的一致性，或用于不同筛选实验之间的比较至关重要。

评估荧光信噪比

为确保大规模实验中荧光素标记的寡核糖核苷酸底物的稳定性和质量，采用具有活性的核酶分子（A6Rbz）计算Z’因子，其定义为检测背景信号与最大信号之间的差值。Z’因子符合要求的检测实验 >0.5 被认为适用于高通量筛选。 图2 显示使用5’荧光素（FAM；发射体）和3’标记的FRET底物获得的代表性数据 N,N’-四甲基罗丹明（TAMRA；淬灭基团）（A6Rbz_F/T）。在存在和不存在A6Rbz的情况下，使用72个重复样本计算，该底物的Z’因子为0.64。

在此检测中，使用Iowa Black暗淬灭剂（A6Rbz_F/Ib）作为替代底物相比TAMRA可获得更高的...

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讨论

本文介绍了一种用于筛选抗锥虫RNA编辑复合体抑制剂的新型高通量筛选方法，为应对锥虫动体病原体所致疾病的药物发现提供了新工具。基于FRET的核酶检测技术已被广泛用于多种用途20-22；然而，我们利用基于FRET的核酶检测技术实现了对RNA编辑活性的in vitro监测19。该检测方法有望被拓展应用于真核生物中其他类型的RNA编辑，例如哺乳动物核编码RNA的核苷酸替换编辑23。

本实验的新颖之处并不在于建立基于FRET的核酶检测方法本身，而在于开发一种将该技术整合到RNA编辑检测中的方法，使其适用于对编辑体（editosome）进行高通量化学物质筛选。相比目前用于此目的的其他筛选和检测方法，基于核酶检测的技术具有多项优势。具体而言，该技术采用荧光标记底物而非放射性标记底物，提供了一种灵敏且可重复的“混合-检测”型检测方法，因而适用于高通量筛选19。通过在加入底物后实时监测荧光信号，而非仅获取终点信号，能够更准确地测定被测化合物的IC50值19

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Najmeh Nikpour 和 Fiona Alum 对本文提出了建议并进行了编辑。麦吉尔大学生物化学系通过加拿大健康研究院化学生物学培训计划为 HM 和 VM 提供了支持。本研究得到了加拿大健康研究院（CIHR）基金 119464（授予 R. S.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SDM-79 培养基Gibco by Life Technologies
胎牛血清Life Technologies12483-02055 °C 加热灭活 1 小时
血红素，纯度不低于 80%SigmaH5533-10G
青霉素-链霉素溶液Fisher ScientificMT-30-002-CI
DNase 1 重组产品，无 RNase Roche4716728001
T7 RiboMax Express 大规模 RNA  合成系统 PromegaP1320
Kimble Kontes 玻璃匀浆器  Fisher ScientificK885300-0040  
Gradient Master，版本 5.25 Biocomp107-201M
超透明离心管，13.2 mlBeckman Coulter344059
Optima L-100XP  超速离心机 Beckman Coulter392052
SW 41 Ti 转头Beckman Coulter331336
MicroSeal 'B' 密封盖，密封件BioradMSB1001
CFX 384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统Biorad185-5484
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1），40%（w/v）Bio BasicA0006-500ML
尿素，分子生物学级，1 kgLife TechnologiesAM9902

参考文献

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