本文描述了一种高灵敏度的基于核酶的检测方法，适用于对靶向锥虫病原体中RNA编辑这一独特过程的化合物进行高通量筛选。此类抑制剂既可作为研究RNA编辑过程的假设驱动型分析工具，最终也有望开发为治疗药物。
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方法文章
利用RNA催化剂作为报告系统筛选抗锥虫RNA编辑药物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在确定锥虫线粒体RNA编辑机制方面已取得重大进展。同样，在鉴定催化RNA编辑的编辑体复合物组分方面也取得了显著进展。然而，目前仍不清楚这些蛋白质如何协同发挥作用。通过针对编辑体的高通量筛选获得的化学化合物可能阻断或影响编辑循环中的一个或多个步骤。因此，发现新的化学化合物将为解析编辑体的功能与组装提供有价值的分子探针。在以往的研究中， 体外 编辑活性检测采用放射性标记的RNA进行。这些检测方法耗时长、效率低，且不适用于高通量研究。本文介绍一种均相荧光为基础的“混合即检测”型锤头状核酶 体外 一种用于监测RNA编辑的报告基因检测方法被提出。只有当锤头状核酶发生RNA编辑后，荧光共振能量转移（FRET）寡核糖核苷酸底物才会被切割。随后，荧光基团与淬灭基团分离，从而产生信号。相反，当编辑体功能受到抑制时，荧光信号将被淬灭。该方法灵敏度高、操作简便，具有广泛的适用性，可用于监测 体外 RNA编辑或针对可抑制编辑体功能的化学物质进行高通量筛选。
引言
RNA编辑是一种转录后mRNA修饰过程，最初在锥虫科生物中被发现1。此后，针对布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中RNA编辑机制的研究已开展了大量工作2,3。在一系列酶促反应中，由约20种蛋白质组成的核心复合物——编辑体（editosome），可生成线粒体mRNA成熟产物，这些mRNA编码能量生成相关的氧化磷酸化系统的多个组分。催化反应的顺序由引导RNA（gRNA）决定，包括内切核酸酶切割、尿苷酸（U）的添加或删除，以及连接反应4。
除了核心编辑体复合物蛋白外，还鉴定出多种辅助因子5-7。这些蛋白通常以独立复合物的形式存在。然而，核心编辑体复合物中蛋白的组装顺序以及核心复合物与辅助复合物之间的相互作用模式仍有待阐明。针对锥虫类生物中的RNA编辑过程可能提供可用于研究编辑体复合物组装与功能的化学工具分子。此外，对多个编辑体蛋白的功能研究表明，它们在不同生活阶段均具有必需性，提示其具有作为药物靶点的潜力8-12。因此，已发现的编辑体抑制剂也可能作为抗锥虫类生物的先导化合物。这一研究方向恰逢其时，因为目前用于治疗锥虫类病原体所致疾病的药物普遍存在毒性高、疗效差和价格昂贵等问题13,14。
一种高效且便捷的方法 体外 检测对于探索能够阻断RNA编辑的....
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方案
以下方案描述了基于荧光的RNA编辑检测实验的操作步骤。该检测可根据实验规模在单个PCR管、96孔板或384孔板中进行。随后可在合适的实时PCR检测系统上读取荧光信号。本文所述方法以384孔板为例进行说明。
1. 培养T. brucei细胞
- 准备用于T. brucei前循环型细胞的培养基。配制1 L培养基：
- 将25.4 g SDM-79粉末溶解于800 ml MilliQ水中。
- 加入2 g NaHCO3，并用10 M NaOH调节pH至7.3。
- 加入超纯水至终体积为900 ml，过滤除菌。
- 加入胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液和血红素（2.5 mg/ml），使其终浓度分别为10%（v/v）、100 U/ml和7.5 mg/L。
- 在28 °C、70 rpm振荡条件下培养300 ml T. brucei 1.7A野生型（前循环型）细胞，使其密度达到1.5 × 107 个细胞/ml。注意：此培养量可获得约3 ml具有活性的编辑体，总蛋白量约为0.5 mg，足以进行600次编辑反应。
- 在4 °C下以6,000 × g离心10分钟收集细胞。
- 用50 ml预冷的PBSG缓....
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结果
为了展示建立大规模筛选实验所需的必要步骤，图2-5 为与检测质量相关的代表性对照实验。这些对照实验对于在多天筛选过程中保持检测的一致性，或用于不同筛选实验之间的比较至关重要。
评估荧光信噪比
为确保大规模实验中荧光素标记的寡核糖核苷酸底物的稳定性和质量，采用具有活性的核酶分子（A6Rbz）计算Z’因子，其定义为检测背景信号与最大信号之间的差值。Z’因子符合要求的检测实验 >0.5 被认为适用于高通量筛选。 图2 显示使用5’荧光素（FAM；发射体）和3’标记的FRET底物获得的代表性数据 N,N’-四甲基罗丹明（TAMRA；淬灭基团）（A6Rbz_F/T）。在存在和不存在A6Rbz的情况下，使用72个重复样本计算，该底物的Z’因子为0.64。
在此检测中，使用Iowa Black暗淬灭剂（A6Rbz_F/Ib）作为替代底物相比TAMRA可获得更高的.......
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讨论
本文介绍了一种用于筛选抗锥虫RNA编辑复合体抑制剂的新型高通量筛选方法，为应对锥虫动体病原体所致疾病的药物发现提供了新工具。基于FRET的核酶检测技术已被广泛用于多种用途20-22；然而，我们利用基于FRET的核酶检测技术实现了对RNA编辑活性的in vitro监测19。该检测方法有望被拓展应用于真核生物中其他类型的RNA编辑，例如哺乳动物核编码RNA的核苷酸替换编辑23。
本实验的新颖之处并不在于建立基于FRET的核酶检测方法本身，而在于开发一种将该技术整合到RNA编辑检测中的方法，使其适用于对编辑体（editosome）进行高通量化学物质筛选。相比目前用于此目的的其他筛选和检测方法，基于核酶检测的技术具有多项优势。具体而言，该技术采用荧光标记底物而非放射性标记底物，提供了一种灵敏且可重复的“混合-检测”型检测方法，因而适用于高通量筛选19。通过在加入底物后实时监测荧光信号，而非仅获取终点信号，能够更准确地测定被测化合物的IC50值19
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Najmeh Nikpour 和 Fiona Alum 对本文提出了建议并进行了编辑。麦吉尔大学生物化学系通过加拿大健康研究院化学生物学培训计划为 HM 和 VM 提供了支持。本研究得到了加拿大健康研究院（CIHR）基金 119464（授予 R. S.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SDM-79 培养基 | Gibco by Life Technologies | ||
| 胎牛血清 | Life Technologies | 12483-020 | 55 °C 加热灭活 1 小时 |
| 血红素，纯度不低于 80% | Sigma | H5533-10G | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| DNase 1 重组产品，无 RNase | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express 大规模 RNA 合成系统 | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes 玻璃匀浆器 | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master，版本 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| 超透明离心管，13.2 ml | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP 超速离心机 | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti 转头 | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' 密封盖，密封件 | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Biorad | 185-5484 | |
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1），40%（w/v） | Bio Basic | A0006-500ML | |
| 尿素，分子生物学级，1 kg | Life Technologies | AM9902 |
参考文献
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology....
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