本文视频介绍了一种基于体外微阵列的 in vitro 方法，用于确定双组分系统反应调节因子的基因靶标及其结合位点。
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本文内容
摘要
摘要
体内 方法（如 ChIP-chip）是用于确定转录因子全局基因靶标的成熟技术。然而，在研究激活条件尚未明确的细菌双组分调控系统时，这些方法的应用受到限制。此类系统仅在特定信号存在下被激活后才调控转录。由于这些信号通常未知，本文视频文章中描述的基于 体外 微阵列的方法可用于确定应答调控因子的基因靶标及其结合位点。这种 DNA 亲和纯化芯片法可适用于任何具有测序基因组的生物中的任意纯化调控蛋白。该方案包括使纯化的带标签蛋白与剪切后的基因组 DNA 结合，随后亲和纯化蛋白结合的 DNA，再对 DNA 进行荧光标记并杂交至定制的平铺微阵列。本文还描述了可用于优化特定调控因子检测的前期步骤。通过微阵列数据分析产生的信号峰可用于预测结合位点基序，随后通过实验验证这些基序。这些基序预测还可用于确定近缘物种中同源应答调控因子的基因靶标。我们通过确定环境细菌 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 中依赖 sigma54 的应答调控因子 DVU3023 的基因靶标和结合位点基序，进而预测其功能，展示了该方法的适用性。
引言
细菌的存活与增殖能力在很大程度上取决于其感知环境变化并作出响应的能力，而这种能力又依赖于其信号转导系统。一种细菌所编码的信号系统数量被称为其“微生物智商”（microbial IQ），可反映其生存环境的多变性以及感知多种信号并精细调控响应的能力1。双组分信号转导系统（TCS）是细菌中最普遍的信号系统，由一个组氨酸激酶（HK）和一个效应响应调节蛋白（RR）组成：HK感知外界信号，并通过磷酸化将信号传递给效应RR2。RR可具有多种输出结构域，因而表现出不同的效应模式，但最常见的响应是通过DNA结合结构域实现的转录调控1。绝大多数TCS所感知的信号及其相应功能至今仍不清楚。
尽管染色质免疫沉淀结合芯片技术（ChIP-chip）等体内方法通常用于确定转录因子的基因组结合位点3，但这些方法仅在已知激活条件或信号的情况下才能用于细菌双组分系统中的反应调节子（RRs）。通常，激活双组分系统的环境信号比其靶基因更难确定。本文所述的基于体外微阵列的检测方法可有效且快速地确定双组分系统的靶基因并预测其功能。该检测方法利用了反应调节子可在体外通过乙酰磷酸等小分子供体进行磷酸化并从而被激活的特性4。
在本方法中，即DNA亲和纯化芯片法（DAP-chip，DNA-affinity-pu....
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方案
注意：以下方案专为确定细菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough中反应调节因子DVU3023的基因靶标而设计，也可根据需要调整用于研究其他感兴趣的转录调控因子。
1. 克隆并纯化RR
- 从脱硫弧菌 Hildenborough（D. vulgaris）中克隆 RR 基因 DVU3023，并将其插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体，使该基因带有C端His标签，且其表达受T7启动子调控。
注意：可采用多种克隆方法，具体由研究人员决定。也可使用其他亲和标签。 - 将表达载体转化至大肠杆菌（E. coli）BL21 (DE3) 表达菌株中。
- 在37 °C下培养1 L BL21表达菌液。当菌液达到对数中期时，加入IPTG至终浓度0.5 mM以诱导蛋白表达。随后在室温下继续培养24小时。
- 在4 °C条件下，以5,000 × g离心10分钟收集菌体。用裂解缓冲液（20 mM 磷酸钠，pH 7.4，500 mM NaCl，40 mM 咪唑，1 mg/ml 溶菌酶，1× 苯并核酸酶）重悬菌体，并在4 °C下使用French压滤器裂解细胞。
- 在4 °C条件下，以15,000 × g离心裂解液30分钟，随后使用0.45 µm针头滤器过滤。
- 在FP....
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结果
上述方法已应用于确定模式硫酸盐还原菌 Desulfovibrio vulgaris Hildenborough7 中响应调节蛋白（RR）的全基因组靶基因。该生物含有大量双组分系统（TCS），其响应调节蛋白超过70种，表明其可感知并响应多种多样的信号。由于这些信号通路的信号分子及其激活条件尚不明确，因此难以在 体内 对其功能开展分析。本研究采用DAP-chip方法鉴定了代表性响应调节蛋白DVU3023的靶基因，从而预测其可能的生物学功能。
DVU3023 是一种依赖 sigma-54 的响应调节子（RR），其编码基因位于一个包含相应组氨酸激酶（HK）的操纵子中（图 3A）。在其C端添加了His标签的基因被克隆并在 E. coli 中表达并纯化。为初步确定其靶标，将纯化的RR用于检测其与下游十基因操纵子（DVU3025–3035）的结合能力，该操纵子包含乳酸摄取和氧化相关基因。RR DVU3023 能够迁移 DVU3025 上游区域（图 3B）.......
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讨论
本文所述的 DAP-chip 方法已成功用于确定中国台湾希氏脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris Hildenborough）中多个响应调节蛋白（RR）的基因靶标7，其中一项结果在此作为代表性示例展示。对于 RR DVU3023，候选基因靶标的选取较为直接：DVU3025 位于 RR 基因的下游紧邻位置，且该 RR 基因与靶基因在多种脱硫弧菌（Desulfovibrio）物种中均保守存在，此外 DVU3025 还具有预测的 σ54 依赖型启动子。电泳迁移率变动分析（EMSA）提供了一种简便方法，可快速检测 RR 是否与候选靶基因结合，同时可用于评估纯化蛋白样品的活性，并确定蛋白-DNA 结合的最佳条件。
也可在存在和不存在乙酰磷酸的条件下检测DNA结合活性，以确定磷酸化是否为DNA结合所必需。并非所有响应调节蛋白（RR）都能被小分子供体磷酸化9，在这些情况下，如果条件允许，可使用纯化的同源传感器激酶来激活该蛋白。目前已发现一些非典型的RR，其接收结构域中缺乏关键的活性位点残基，因而无法.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Amy Chen 在视频拍摄准备过程中提供的帮助以及对实验技术的示范。本研究由 ENIGMA：生态系统与基因及分子组件集成网络（http://enigma.lbl.gov）完成，ENIGMA 是劳伦斯伯克利国家实验室的科学重点研究领域项目，项目经费由美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室通过合同编号 DE-AC02-05CH11231 提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HisTrapFF 柱（Ni-Sepharose 柱） | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer（FPLC 仪器） | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 脱盐柱 | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| 生物素标记的寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% 聚丙烯酰胺-0.5x TBE 预制小型 DNA 迁移延迟凝胶 | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | 也可自行灌制凝胶。 |
| 尼龙膜 | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD 半干式电泳转移系统 | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| 加厚印迹纸，8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV 交联仪 XL-1000 型 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| 核酸化学发光检测试剂盒（Pierce） | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA 琼脂糖树脂 | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex 全基因组扩增试剂盒（片段化缓冲液、文库制备缓冲液、文库稳定化溶液、文库制备酶、10x 扩增主混合液、WGA 聚合酶） | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | 用于 DNA 定量 | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix（含 ROX） | Quanta biosciences | 95055-500 | 可使用任何 Sybr Green PCR 混合液 |
| qPCR 用超透明热封膜（PlateMax） | Axygen | ||
| [header] | |||
| 96 孔透明低矮 PCR 微孔板 | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus 实时 PCR 系统 | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | 可使用任何实时 PCR 系统 |
| Qiaquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | 可使用任何 PCR 纯化试剂盒 |
| Cy3/Cy5 标记的九聚体 | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow 聚合酶 50,000 U/ml，3'-5' 外切酶- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| 杂交系统 | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | 该公司已不再生产芯片及相关产品，需使用 Agilent 或 Affymetrix 等替代来源。 |
| 定制打印的微阵列及混匀器 | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| 杂交试剂盒（2x 杂交缓冲液、杂交组分 A、定位寡核苷酸） | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| 洗涤缓冲液试剂盒（10x 洗涤缓冲液 I、II、III，1 M DTT） | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A 微阵列扫描仪 | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | 该型号已被更先进的型号取代 | |
| GenePix Pro 微阵列软件 | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4，ChIP-chip 分析软件 | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A |
参考文献
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol.
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重印与许可
