阵列比较基因组杂交（CGH阵列），用于检测基因拷贝数变异的

Summary

阵列CGH为基因拷贝数变异的检测已经取代G-带状核型分析。本文介绍了技术及其在诊断服务实验室的应用。

Abstract

用于检测基因组拷贝数变异的

Array CGH 已取代 G 带核型分析。本文介绍了该技术及其在临床诊断服务实验室中的应用。从患者样本（血液、唾液或其他组织类型）中提取的 DNA 用荧光染料（花青 5 或花青 3）标记。参考 DNA 样品用相反的荧光染料标记。接下来是纯化步骤，去除未掺入的核苷酸，然后将标记的 DNA 混合并重悬于杂交缓冲液中，并应用于包含来自整个基因组位点的 ~60,000 个寡核苷酸探针的阵列中，在临床重要区域具有高探针密度。杂交后，洗涤芯片，然后扫描并分析所得图像以测量每个探针的红色和绿色荧光。软件用于评估每个探针测量的质量，计算红色与绿色荧光的比率并检测潜在的拷贝数变体。

Introduction

它已被公知多年了缺失或染色体片段的额外拷贝会导致智力障碍，异形和congentical畸形，并在某些情况下会导致遗传综合征^1。不过，可用，直到2000年代中期的全基因组检测这些变化的唯一技术是G-带状染色体分析，其中有四周5-10Mb的分辨率，这取决于不平衡的地区和性质，并不能检测异常染色体其中材料已经被替换的区域，从一个不同的染色体具有相同的带型。如荧光原位杂交和多重连接特异性探针扩增辅助细胞遗传学技术已经可以为特定位点的审讯，在涉嫌的具体综合征失衡的情况下，但它不是直到引进阵列比较基因组杂交（CGH阵列）进入常规临床诊断service ^2-5的全基因组检测的拷贝数变异（CNV的），在大大提高分辨率（通常大约120KB）成为可能。临床服务工作一起研究的研究表明，CNV的某些区域是在正常人群^6-7普遍，而其他的CNV，先前不可检测的，与neurodisabilities如孤独症和癫痫^8-11相关联。

本文描述的协议，用于在我们的英国国民健康服务（NHS）临床诊断实验室;我们用新颖的杂交策略，批量测试和机器人，以减少在这个国家资助的服务成本。

之前下面详述的协议，高品质的DNA应该提取从适当的起始材料，通常血液，培养的细胞或组织样品。分光光度法，可用于测量浓度（应> 50纳克/ UL），并检查260：280比例的吸光度....

Protocol

1.标签反应

1. 在使用之前，预等分花青3和5标记dUTPs，未标记的核苷酸和随机引物根据制造商建议的浓度到96孔板中，并存储在-20℃以备使用。此协议，等分10.5微升适当标记的dUTP和10.5微升未标记的核苷酸和随机引物，以每个孔的目的。
2. 解冻的准备使用的96孔板核苷酸和引物，在4℃下进行约1小时，避光。
3. 一旦解冻，平衡该板在RT，至少30分钟，避光。
4. 平衡的DNA样品在60℃下至少15分钟。
5. 使用液体处理机器人，分配无核酸酶水到96孔板的每个孔中。
   注：水的体积将取决于每个输入DNA样品的浓度，并应足以导致在50ng /微升的最终浓度。
6. 使用液体汉危及周围机器人，吸管1微克的DNA进96孔板的孔中（见1.5），以使总体积至20微升。
   注意：也可以使用较小的DNA的量，虽然得到的数据的质量可能会受到影响（对珍贵的样品，输入DNA的数量下降到400纳克可以使用）。
7. 使用液体处理机器人，转移20微升平衡核苷酸和引物的成的稀释的DNA的板的各孔中。
8. 密封96孔板用条状盖（一个紧密的密封是至关重要的）。
9. 变性在99℃将DNA用于在PCR机器10分钟以加热盖，然后进行5分钟退火的引物捕捉在冰上冷却。
10. 使用液体处理机器人，加入10微升的克列诺外切DNA聚合酶到每个的DNA和吸管调匀。
    注：总量应为50微升。
11. ....

Results

在杂交阵列，每个探针可视化为红色和绿色荧光染料的混合物（ 见图1）。红色到绿色荧光信号的每个探针的比值由扫描仪量化和关联的软件根据它们的基因组的位置绘出这些为log2比值，并确定区域的下降沿以外的预设边界。结果数组的痕迹让认定为基因组区域的不平衡解释。例如，从一个子带威廉斯综合征，反复出现微缺失综合征由低拷贝重复在7号染色体的近侧区介导的痕迹，示于图2。这种不平衡鉴定由软件和由红色线表示。

探测荧光日志比率应该紧紧围绕群集0， 如图2中 ，表示1的绿色/红色比：1的基因组的正常区域。散阵列的痕迹可能resul吨，因而不能准确调用异常区域的，或无法确定的基因组失衡（ 见图3）。这类分散可由许多因素，包括DNA质量差，或臭氧在大气中的升高水平的存在而引起的。臭氧浓度监测建议，并在高浓度臭氧水平是有问题的，致力于臭氧排除橱柜可用;使用这些机柜通常导致显着改善阵列的品质。

Discussion

阵列CGH不会检测平衡重排或倍体异常，如三倍体。此外，低水平的马赛克的不平衡可能不会被检测到。然而，阵列CGH对CNV检测比G-带状染色体分析，它已经取代了许多细胞遗传学实验室更高的分辨率。因此，目前的黄金标准的全基因组CNV检测。它可能是由下一代测序技术在未来被替换，但目前，它们的成本和技术复杂性与使用短相关读出用于检测CNV的意思，这还不是一个很好的适合临床使用。

这里所描述的协议是在我们的临床服务实验室的日常使用。每96个样品的两个运行每星期用液体处理机器人和一个专用的二氧化硅膜的自旋柱处理机器人处理。自动化强烈建议，以提高一致性和保证质量。从血液中提取DNA，唾液，产前样品（ 如绒毛膜绒毛或羊水）或组织样本就可以了，通常就是使用该协议。

臭氧是众所​​周知的降低菁染料，因此臭氧监测和保护建议。在臭氧含量的季节性变化也是常见的。我们的实验室监测和记录臭氧水平不断。壁挂式臭氧去除单元用于减少臭氧水平和该协议的特别敏感的部位（ 即，洗涤和扫描阵列）在无臭氧抽油烟机执行。如果可能的话，臭氧水.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH 微阵列 8 x 60K	Agilent	G4126
阵列 CGH 洗涤缓冲液	Agilent	5188-5226
阵列 CGH 杂交缓冲液	Agilent	5188-5380
Minelute 纯化试剂盒	Qiagen	28006
阵列 CGH 标记试剂盒	Enzo	ENZ-42672-0000