基因组拷贝数变异的检测已由染色体微阵列分析（array CGH）取代传统的G显带核型分析。本文介绍了该技术及其在临床诊断服务实验室中的应用。
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摘要
摘要
基因组拷贝数变异的检测已由阵列比较基因组杂交（array CGH）技术取代了G带核型分析。本文介绍了该技术及其在临床诊断服务实验室中的应用。从患者样本（血液、唾液或其他组织类型）中提取的DNA用荧光染料标记（氰染料5或氰染料3），参考DNA样本则用相反的荧光染料标记。随后进行纯化步骤以去除未掺入的核苷酸，然后将标记的DNA混合并重悬于杂交缓冲液中，再加至包含约60,000个寡核苷酸探针的微阵列上；这些探针分布于全基因组位点，在临床重要区域具有高探针密度。杂交完成后，对微阵列进行洗涤，随后扫描并分析所得图像，以测量每个探针的红色和绿色荧光信号。通过软件评估每个探针测量值的质量，计算红绿荧光信号的比值，并识别潜在的拷贝数变异。
引言
多年来人们已经知道，染色体片段的缺失或额外拷贝会导致智力障碍、发育异常和先天性畸形，在某些情况下还会引起遗传综合征1。然而，直到21世纪初，用于全基因组范围检测这些变异的唯一技术是G显带染色体分析，其分辨能力约为5-10 Mb，具体取决于区域和不平衡的性质，并且无法检测那些被具有相同带型的不同染色体区域所替换材料而导致的异常染色体。辅助细胞遗传学技术，如荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization）和多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification），可用于怀疑存在特定综合征性不平衡时对特定基因座进行检测。但直到微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，array CGH）被引入常规临床诊断服务2-5，才实现了在显著提高的分辨率（通常约为120 kb）下对全基因组范围的拷贝数变异（copy number variants, CNVs）进行检测。临床服务工作与研究相结合表明，某些区域的CNVs在正常人群中广泛存在6-7，而其他一些先前无法检测到的CNVs则与自闭症和癫痫等神经发育障碍相关8-11。
本文所述方案应用于我们英国国家医疗服务体系（NHS）的临床诊断实验室；我们采用新型杂交策略、批量检测和机器人技术，以降低这一政府资助服务的成本。
在进行下述实验方案之前，应从合适的起始材料（通常为血液、培养细胞或组织样本）中提取高质量的DNA。可使用分光光度法测定DNA浓度（应>50 ng/μL）并检测260:280吸光度比值（应在1.8–2.0之间）。可通过凝胶电泳检测DNA是否具有高分子量且无明显降解。
本方案专为高通量实验室设计，适用于使用自动化液体处理机器人每次运行标记96个样本的情况。然而，该方案也可根据需要调整，用于无自动化设备的低通量实验室。
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方案
1. 标记反应
- 使用前，将氰基3和5标记的dUTP、未标记的核苷酸及随机引物按照制造商推荐的浓度预先分装至96孔板中，并于-20 °C保存备用。根据本实验方案的要求，向每个孔中分装10.5 µl相应标记的dUTP以及10.5 µl未标记的核苷酸和随机引物。
- 将含有核苷酸和引物的96孔板在4 °C避光条件下解冻约1小时。
- 解冻后，在避光条件下于室温平衡至少30分钟。
- 将DNA样本在60 °C条件下平衡至少15分钟。
- 使用液体处理机器人，向96孔板的每孔中加入无核酸酶的水。
注意：加水量取决于各DNA样本的起始浓度，应确保最终浓度为50 ng/µl。 - 使用液体处理机器人，向96孔板的每孔中加入1 µg DNA（见步骤1.5），使总体积达到20 µl。
注意：可使用更少的DNA量，但可能影响最终数据质量（对于珍贵样本，最低可使用至400 ng的DNA输入量）。 - 使用液体处理机器人，将20 µl已平衡的核苷酸和引物混合液转移至含有稀释后DNA的96孔板各孔中。
- 用条形封板膜密封96孔板（确保密封严密）。
- 在带有加热盖的PCR仪中于99 °C变性10分钟，随后立即置于冰上快速冷却5分钟，以促进引物退火。
- 使用液体处理机器人，向每个DNA样本中加入10 µl Klenow Exo DNA聚合酶，并用移液器充分混匀。
注意：总体积应为50 µl。 - 密封96孔板，并在37 °C孵育16小时。
注意：较短的4小时孵育时间亦足够，但过夜孵育可能更为方便。 - 使用液体处理机器人，向每孔加入5 µl终止缓冲液。
注意：标记反应所用试剂的汇总见表1。
2. 去除未掺入的核苷酸
- 使用基于硅胶膜的离心柱和专用的离心柱处理机器人去除未掺入的核苷酸（离心柱也可手动处理）。请遵循制造商的说明。
- 将每个孔中的内容物转移至一个 2 ml 离心管中；预先用孔编号标记这些离心管。
注意：此步骤可手动操作，但更推荐使用液体处理机器人。 - 若使用离心柱处理机器人，则向机器人加载 2 ml 离心管、DNA 纯化离心柱及相关缓冲液。
- 向标记反应体系中加入 250 µl 高盐DNA结合缓冲液（缓冲液 PB），使标记的 DNA 结合到硅胶膜上。
- 用 500 µl 洗涤缓冲液（缓冲液 PE）洗涤膜两次，以去除杂质。
- 向膜上加入 15 µl 低盐洗脱缓冲液（缓冲液 EB），以约 12 µl 体积回收纯化的标记 DNA。
- 将每个孔中的内容物转移至一个 2 ml 离心管中；预先用孔编号标记这些离心管。
3. 结合杂交配对
- 使用液体处理机器人，将适当配对的Cy3和Cy5标记的DNA、COT-1 DNA、厂商提供的封闭混合液以及厂商提供的杂交缓冲液混合。
注意：这些杂交配对可以是样本与参考DNA，或样本与样本之间的配对（如果共同的拷贝数变异（CNV）不是问题）（例如， 我们通常将表型不匹配的样本配对，如肾发育不良患者与颅缝早闭患者，因为他们极不可能携带相同的具有临床意义的CNV）。如果使用参考DNA，建议采用商业来源的DNA，并应与样本一同进行处理。- 使用液体处理机器人，向96孔板的每个孔中加入COT-1 DNA（3333 ng/µl）、厂商提供的封闭混合液和杂交缓冲液，使每孔最终含有1.1 µl COT-1 DNA、4.95 µl封闭混合液和24.75 µl杂交缓冲液。
- 向每个孔中加入9.35 µl适当的Cy3标记DNA。预先润洗每支吸头以提高移液准确性。
- 向每个孔中加入9.35 µl适当的Cy5标记DNA。预先润洗每支吸头以提高移液准确性。
- 密封96孔板，涡旋振荡1分钟。离心96孔板，使各孔内容物沉降至孔底。
4. 杂交
- 将杂交炉预热至 65°C，并为每张芯片载玻片预先加热一张背板和一个杂交室。
- 在将标记的 DNA 应用于芯片之前，先在预杂交孵育中进行变性处理。在旋转炉中进行 24 小时的杂交反应。
- 将 96 孔板在 70 °C 下孵育 30 分钟，然后在 37 °C 下静置至少 5 分钟。
- 在 42 °C 的加热平台上操作，使用前将每张背板装入杂交室中。确保垫圈载玻片的透明部分与杂交室的“窗口”部分对齐。
- 用移液器将先前制备的 42 µl 杂交混合液（见第 3 节）加至芯片背板的相应位置。预先润湿每个吸头以提高移液准确性。缓慢地将液体加至每个位置的中心，确保液体不接触橡胶圈边界。
- 当背板上的所有位置均加样完毕后，小心地将芯片载玻片盖在背板上，并组装杂交室。确保芯片上有文字的一侧朝向背板。务必完全拧紧杂交室的螺丝。
- 检查组装好的杂交室。当杂交室垂直立放时，确保杂交混合液未从橡胶圈边界泄漏，且每个气泡高度约为 4 mm。旋转杂交室，检查是否有气泡滞留不动。如有此类情况，应将杂交室在实验台上轻敲一下。确认所有气泡均可移动。
- 将杂交室放入 65 °C 的旋转炉中孵育 24 小时。确保炉内转子平衡；必要时可使用其他空杂交室配平。
5. 洗涤和扫描玻片
- 洗涤芯片以去除过量的标记DNA，然后进行扫描以测定每个探针的荧光信号。
- 将杂交盒从烘箱中取出并拆开。芯片载玻片与垫片载玻片会粘在一起；将其浸入洗涤缓冲液1中，并使用一对塑料平头镊子小心分离。
- 弃去垫片载玻片，将芯片载玻片放入浸没于缓冲液1中的玻片架中。
- 在约700 ml新鲜的洗涤缓冲液1中洗涤芯片载玻片5分钟，剧烈搅拌（使用磁力搅拌子和磁力搅拌器）。
- 将芯片载玻片转移至约700 ml洗涤缓冲液2中，剧烈搅拌洗涤90秒。轻轻将芯片载玻片从洗涤缓冲液2中提起，其表面应自然干燥。
- 使用玻片保护装置将芯片载玻片装入扫描仪的玻片架中。按照芯片制造商的说明，将玻片装入芯片扫描仪并进行扫描。
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结果
杂交阵列上的每个探针均显示为红色和绿色荧光染料的混合信号（见图1）。扫描仪对每个探针的红绿荧光信号比值进行量化，相关软件根据其基因组位置将这些比值绘制成log2比值图，并识别超出预设边界的区域。所得的阵列图谱可用于判读被识别为基因组不平衡的区域。例如，图2展示了一名威廉姆斯综合征患儿的图谱，该综合征是一种由7号染色体近端区域低拷贝重复序列介导的复发性微缺失综合征。该不平衡区域已被软件识别，并以红线标示。
探针荧光对数比值应紧密聚集在0附近，如图2所示，表明基因组正常区域的绿/红比值为1:1。散乱的芯片信号轨迹可能导致异常区域的错误判读，或无法识别基因组失衡（见图3）。此类散乱信号可能由多种因素引起，包括DNA质量差，或大气中臭氧浓度升高。建议监测臭氧水平；当臭氧水平较高造成问题时，可使用专用的臭氧排除柜；使用此类设备通常可显著提高芯片质量。
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讨论
阵列CGH无法检测平衡性重排或倍性异常（如三倍体）。此外，低水平的嵌合体失衡可能无法被检出。然而，与已被其取代的G显带染色体分析相比，阵列CGH在拷贝数变异（CNV）检测方面具有更高的分辨率。因此，目前阵列CGH是全基因组CNV检测的金标准。尽管未来可能被新一代测序技术所取代，但目前由于成本较高，以及使用短读长进行CNV检测所伴随的技术复杂性，尚不适合临床应用。
本文所述方案已在我们的临床服务实验室中常规使用。每周使用液体处理机器人和专用的硅胶膜离心柱处理机器人各运行两次，每次处理96个样本。强烈建议采用自动化操作，以提高一致性和保证质量。从血液、唾液、产前样本（例如，绒毛膜绒毛或羊水）或组织样本中提取的DNA均可用于本方案，且已在常规中使用。
臭氧会降解花青素染料，因此建议进行臭氧监测与防护。臭氧浓度的季节性变化也很常见。本实验室持续监测并记录臭氧水平。使用壁挂式臭氧清除装置以降低臭氧浓度，尤其敏感的实验步骤（即 洗涤和扫描芯片）在无臭氧通风柜中进行。如有可能，臭氧浓度应保持在5...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CGH 微阵列 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| 阵列 CGH 洗涤缓冲液 | Agilent | 5188-5226 | |
| 阵列 CGH 杂交缓冲液 | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute 纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| 阵列 CGH 标记试剂盒 | Enzo | ENZ-42672-0000 |
参考文献
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- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
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重印与许可
