一个简单的行为分析在检测视觉功能非洲爪蟾

Summary

非洲爪蟾蝌蚪喜欢上一个黑/白罐的白边游泳。此行为是由他们的愿景指导。基于这种情况，我们提出了一个简单的实验来测试蝌蚪的视觉功能。

Abstract

在青蛙的蝌蚪视功能测量， 非洲爪蟾 ，允许筛选的盲目性在活的动物。在视动反应是已经在测试的所有脊椎动物中观察到一个基于视觉的，反身的行为。蝌蚪眼睛小所以尾部翻转响应作为替代措施，这需要训练有素的技术人员来记录微妙的响应。我们开发了一种替代行为分析基础上的事实，蝌蚪喜欢当放置在一个用黑色和白色的边槽上槽的白边游泳。这里提出的分析是，创建一个容易测量的响应一种廉价，简单的替代方法。该装置由一个三脚架，摄像头和嵌套测试的坦克，在大多数非洲爪蟾实验室一应俱全。本文包括一个电影展示蝌蚪的行为，前后切断视神经后。为了测试一只眼睛的功能，我们还包括下列国家代表蝌蚪在每只眼睛的视网膜进行干切断连续数天的sentative结果。未来的研究可以制定此法的自动版本测试许多蝌蚪的视力一次。

Introduction

非洲爪蟾已被用来作为一种模式生物来研究眼的形成。眼睛快速发展，成长到成熟，在不到一个星期的那些对视觉发育和功能的影响测试基因或通路。来测试视觉功能，视动和optomotor反应已被用于在斑马鱼和爪蟾蝌蚪，分别^1,2。由于非洲爪蟾蝌蚪的眼睛比斑马鱼相对较小，此法需要使用专门的设备和训练有素的人员来检测在非洲爪蟾的微妙尾巴翻转和眼动行为。在非洲爪蟾的更健壮的行为是偏爱使用白色背景，在此³所述游泳在一个罐中。当放置在一个半黑/半白罐蝌蚪，预变质蝌蚪迅速游到水箱的白边。我们以前使用此测定法来确定是否多能干细胞衍生的眼睛的功能^4。这里，我们报告了详细的版本该测定的，它可以被用来测试premetamorphic 爪蟾蝌蚪的视觉功能。

此法比optomotor响应试验简单，因为它只需要安装数码摄像机，数码相机的软件和标准的设备在大多数非洲爪蟾的实验室发现。此外，记录的响应并不需要特别的训练来统计结果。我们的代表性的结果表明，在相同组的蝌蚪，已经经历双视网膜干切断，游随机周围的罐中。我们还包括来自代表蝌蚪的行为分析结果，显示一只眼睛可以为视觉反应测试。工作表已经被包括在内，以便在试验过程中获得的号码可以被插入和分析。此表可用于确定测试的蝌蚪是否有一个视觉响应。

Protocol

动物护理

非洲爪蟾在这项研究中使用的蝌蚪生长，并提出处理根据实验动物的护理和使用经州医科大学IACUC和引导程序。

1，预行为设置：蝌蚪

1. 从市售来源获得受精爪蟾胚胎或体外受精的卵母细胞中，如前所述^6。
2. 将囊胚神经板期胚胎在18˚C 60毫米并载0.1X孕产妇死亡率[10 X Marc的改良林格（MMR）解决方案股票（10毫米MgCl ₂的培养皿中，20毫米氯化钾，20毫米氯化钙_2; 50毫米肝素钠; 1 M氯化钠;用50微克/毫升庆大霉素抗生素调节至pH 7.5，高压灭菌，并存储在RT）]。改变0.1X孕产妇死亡率每一天，并移除任何死胚。
3. 一旦胚胎达到Nieuwkoop和法贝尔阶段〜七月27日至³⁰日，第切换é胚胎成0.1X孕产妇死亡率无抗生素，使肠道细菌的生长。
4. 长出蝌蚪，直到他们到达饲养阶段（阶段45）和移动为100毫米培养皿充满0.1X孕产妇死亡率。喂它们荨麻粉上清液隔日了一个星期，改变0.1X孕产妇死亡率的干预一天。
5. 在100mm的培养皿中一周后，将动物以半加仑罐填充有水蛙[0.5 g / L的瞬间海洋和2mM磷酸氢二钠（的Na ₂ HPO _4：分子量141.96），pH为6.8。放他们，如同在步骤2.4，但换水，每周只有2-3次水时是阴天。维持动物在12小时light/12暗光周期与灯光早上6点打开。
6. 将半加仑的油箱与测试对象在一个白色的表面像一个实验室工作台底垫，至少有12小时的O / N，在测试之前。
7. 在阶段45到50的测试蝌蚪在下面的步骤3所述。

2，预行为设置：技术设备吨

1. 设置在实验室的行为分析的区域一边。它应该是在一个安静的，与标准荧光灯低流量区域。
2. 制备的测试槽的动物。
   嵌套，半加仑的测试坦克是由两部分组成：一个内罐，将举行水和蝌蚪;和外罐的视觉刺激。
   1. 为内槽，使在外侧角部与Sharpie笔，5厘米从底部的小标记;这是吃水线（ 图1A，绿色虚线）。
   2. 另外，对于内槽，填充在储罐中的d​​ivets（在角部和中心）的惰性化合物，类似的Sylgard弹性体。注：蝌蚪会在这些领域徘徊，如果他们不填写。
   3. 对于外槽，盖1罐用黑色导电胶带，另一半用白色纸巾图1B的外侧的恰好一半。
3. 将坦克上的接种转盘。
4. 安装摄像头/三脚架，这样它上面的测试坦克。调整相机以允许测试区域的可视化， 如图1C所示 。
5. 将摄像头连接到电脑与安装了⁵个QuickTime播放器软件。打开相机电源。在QuickTime Player，下文件，选择“新建动画拍摄。”行为分析安装程序将在计算机上看到的时候了。
6. 悬垂一个轻量级的棉布在整个安装，以减少外部线索，可能会影响蝌蚪的行为，以及，降低水的表面上反射光。
7. 确保在35-50之间cd /米²的布措施的亮度。

3，行为分析

1. 填写内部测试坦克5cm的水痕在步骤1.2.1与青蛙的水制成。
2. 用一个小网，轻轻将动物移入内部测试箱。
3. 开放的问答计算机，并使用外罐为指导uickTime软件，请确保相机能够以可视化并记录试验区。
4. 写在一张纸上，并记录在相机的动物名称，日期和时间。
5. 将测试箱插入外箱与箱的黑色侧向右图2。
6. 开始安排的罐后，立即记录该电影，并设置计时器，持续2分钟。
7. 当计时器的蜂鸣声，取出内测试箱，旋转外槽180°，然后将外槽内的内槽试验。启动定时器。注：黑方现在应该在另一边。
8. 总共十次重复步骤3.7，八个次。使用图2为指导，检查了每个试验。
9. 重复的行为分析上的两个独立的日子。

4，视网膜干切断

1. 将动物在0.02％三卡因，直到他们反应迟钝到尾巴捏了＃3镊子。
2. 熔体1％琼脂糖在0.1X孕产妇死亡率，然后添加了60毫米的培养皿。一旦冷却，使一个小的矩形草皮在琼脂糖和蝌蚪加至用少量0.02％三卡因的草皮，从而使动物被部分地浸没在液体中。
3. 刺穿皮肤的眼用25号针头的背侧区域后方成45度角，而对支撑在另一侧镊子的动物。
4. 注意不要剪断静脉，它位于靠近视神经，小心伸入带＃5镊子孔，剪断视神经和翻转出来的方式。如果出现严重出血，由于不小心剪断动脉，然后迅速将动物在2％三卡因安乐死。注意：2％三卡因溶液可引起麻木的人类。这个解决方案应该带手套处理。
5. 恢复的动物在手术后，将动物在100毫米的皮氏培养皿用0.7X MMR和50微克/毫升庆大霉素20分钟。 NEXT，蝌蚪转移到污水箱中的青蛙水。让动物休息的O / N。
6. 第二天早上，测试如上所述（步骤3.1-3.9）的视功能。

5。分析结果

1. 后的试验完成后，测量时间的蝌蚪停留在罐的黑色侧的量。
   1. 手动查看使用软件所显示的时间，并允许频繁暂停的视频。看视频显示时间。写下两分钟的审判，这是当内罐成功巢外罐内部，平方鉴于摄像头的开始。
   2. 使用的蝌蚪的眼睛的位置来定义该罐的侧面将动物游泳。定义跨越从水箱的一侧，以仅当两个眼睛已经越过了黑/白线对其他。
2. 写下每个间隔（以秒为单位）的开始和结束该动物花费在黑边。暂停和重新风的视频，以确保准确性。总计每次试验中的秒。
3. 输入这些数字进入附加行为工作表。工作表将计算的时间，该动物减去花费在坦克从总120秒试验和除以以秒为单位的总时间的黑边所花费的时间上的白边的比[（120 - 总秒数花在黑边）/ 120秒]。工作表的平均值这一比例在所有10项试验。
4. 利用学生的T检验，配对，双尾分布，以确定是否天的试验是显著（P≤0.05）。

Results

以前的报告显示，premetamorphic 爪蟾蝌蚪喜欢游泳，黑色/ ​​白色背心的白边，并呼吁该试验中，背景色彩偏好分析^3，我们为了测试的两种蝌蚪眼在视功能改变了这一试验不到一个星期。以这种方式，他们的眼睛可以被收集用于组织学检查。

我们在这里显示了如何响应是由于视觉线索。在电影1中，在左面板和右面板的蝌蚪是相同的动物。在左边是手术前和右侧的动物，切断两者视神经后的动物。我们打​​旋水以表明没有被添加到从黑边驱赶动物，或将其吸引到白色的一面。在电影中，我们提供的蝌蚪在底角的示意图，它显示了视神经的状态为每组动物。在电影1，正常，U正操作的蝌蚪背景颜色响应，在不到30秒的测试箱​​，而盲蝌蚪游漫无目的地周围的罐中。动画的速度增加，而实际时间记录在右上角的角落。

为了测试一只眼睛的视力，我们已经有来自动物的视神经被切断了一只眼睛，并在我们的实验测试的结果。在另一只眼睛的视神经被切断后两天的测试，并在随后的日子里的视觉引导...

Discussion

我们在这里报告，可以很容易地进行下一个星期由受过训练的最低限度实验室人员一个简单的视觉引导行为分析。而其他检测需要专门的设备和专业技术在动物行为，此法可快速测试，以确定视觉功能。另一个行为分析中，视觉回避试验中，已开发，以确定如何在顶盖有助于视觉感知在爪 ^10。该测定法测量空间的调谐和对比敏感度响应于移动与稳定的背景，因此，可以测量比简单的检测更专门的基于视觉的行为报告在这里。一种自动化系统的行为已有报道，可以测量所花费的时间上的槽⁸的一侧上的量。也有市售软件（ 如任何迷宫软件）已被用来测量时间斑马鱼的花费在黑暗或明亮的环境中⁹的量。在一个SSAY我们在这里报告并不需要购买这些类型的昂贵的设备或软件的，而是依赖于日常的试剂和设备来测量视觉功能。

在视觉引导法是在一个动物进行，以测试其视觉功能。当几个蝌蚪的行为分析结果进行比较彼此，我们观察到在治疗组动物之间差异无统计学意义。我们测试了连续六天3蝌蚪，也测试了另外五个动物连续三天，每天运行十次。在任一种情况下，我们发现其中未处理的或单...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2加仑弹性油箱带盖	eNasco	SB19271M	尺寸：5-3/8" x 7" x 3-3/4"
黑色电工胶带
白色薄纸
大型接种转盘	VWR	50809-022	尺寸：直径114.3 x 高 76.2 毫米 （4 1/2  x  3"）
Durasorb 底垫	VWR	82004-836	尺寸：43.2 x 60.1 厘米（17 x 24 英寸）
Kimwipe	Krackeler Scientific， Inc.	1945-34155-CS
标准三脚架		各种
iSight 相机或网络摄像头	Apple	M8817LL/A	适合较大的蝌蚪，但小的难以看到
便携式电脑	Apple/PC	各种	我们使用了运行 MacOSX Lion 10.7.5 MiniDV 手持摄像机的 13 英寸 MacBook，2 GHz Intel Core 2 Duo
	索尼	DCR-HC42	通过 FireWire 通过 6 线和 4 线 alpha FireWire 400 连接到计算机
Handycam station	SONY	DCRA-C121	这可用于将火线连接到相机
QuickTime Player 软件	Quicktime	Version 10.1
26 G 针（5/8" 长度）	VWR	BD305115
Dumont #5 镊子	精细科学工具	11295-10
一次性用品
硫酸庆大霉素 [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	储存在 RT
Sylgard 184 有机硅弹性体	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster 和 Smith	CD-116528	储备溶液 = 100 g/L 储存在 RT
磷酸氢钠	Sigma Aldrich	S0876	储备溶液 = 0.4 M 储存在 RT
体外受精胚胎	eNasco	LM00490MX	100 个胚胎/单位