一种用于检测非洲爪蟾（Xenopus laevis）视觉功能的简单行为学实验方法

摘要

Xenopus laevis 蝌蚪倾向于在黑白相间的水箱中游向白色一侧。这种行为由其视觉引导。基于这一行为，我们提出了一种简单的检测蝌蚪视觉功能的实验方法。

摘要

测量非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪的视觉功能，可实现对活体动物失明状态的筛选。视动反应是一种基于视觉的反射性行为，在所有已测试的脊椎动物中均能观察到。由于蝌蚪的眼睛很小，过去常采用尾部翻转反应作为替代检测方法，但这需要经过训练的技术人员来记录细微的行为反应。我们开发了一种新的行为检测方法，其依据是：当蝌蚪被置于一侧为黑色、另一侧为白色的水箱中时，它们倾向于游向白色一侧。本文介绍的这一检测方法成本低、操作简便，且能产生易于测量的行为反应。实验装置由三脚架、网络摄像头以及嵌套式测试水箱组成，这些材料在大多数Xenopus实验室中均容易获得。本文附有一段视频，展示了在切断视神经前后蝌蚪的行为变化。为了测试单眼功能，我们还提供了对同一只蝌蚪在连续两天内分别对其双眼进行视网膜轴突切断后的代表性实验结果。未来的研究可在此基础上开发自动化版本，以同时检测大量蝌蚪的视觉功能。

引言

非洲爪蟾 被用作研究眼睛形成的模式生物。其眼睛发育迅速，不到一周即可成熟，便于检测对视觉发育和功能有影响的基因或通路。为检测视觉功能，已在斑马鱼中应用视动反射和视动反应。 非洲爪蟾 蝌蚪，分别^1,2 . 由于眼睛的 非洲爪蟾 蝌蚪体型相对小于斑马鱼，因此该检测需要使用专业设备和经过培训的人员，以识别其微小的尾部抽动和眼部运动行为 非洲爪蟾更稳健的行为 非洲爪蟾 偏好在白色背景的水箱中游泳，本文对此进行了描述³将蝌蚪放入一半黑色、一半白色的水箱中时，变态前的蝌蚪会迅速游向水箱的白色一侧。我们此前曾利用该检测方法来判断多能干细胞来源的眼睛是否具有功能。⁴. 在此，我们报告了该检测方法的详细版本，可用于检测变态前阶段动物的视觉功能 非洲爪蟾 蝌蚪

该实验比视觉运动反应实验更为简便，因为它仅需要一台固定的数码摄像机、数码相机软件以及大多数Xenopus实验室中常见的标准设备。此外，记录的反应结果无需特殊培训即可进行统计。我们的代表性结果显示，经历双侧视网膜轴突切断的同一批蝌蚪在水箱中随机游动。我们还提供了代表性蝌蚪的行为检测结果，展示如何对单眼进行视觉反应测试。文中附有工作表，可用于录入实验过程中获得的数据并进行分析。该工作表可用于判断所检测的蝌蚪是否具有视觉反应。

方案

动物护理

本研究中使用的Xenopus laevis蝌蚪，均按照纽约州立大学上州医科大学动物护理与使用委员会（IACUC）以及《实验动物护理与使用指南》批准的程序进行培育、饲养和处理。

1. 行为前准备：蝌蚪

1. 从商业来源获取受精的Xenopus胚胎，或如先前所述进行体外（in vitro）卵母细胞受精⁶。
2. 将处于囊胚至神经板阶段的胚胎置于含有0.1X MMR [10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) 溶液储备液（10 mM MgCl₂；20 mM KCl；20 mM CaCl₂；50 mM HEPES；1 M NaCl；调至pH 7.5，高压灭菌后室温保存）] 并添加50 µg/ml庆大霉素抗生素的60 mm培养皿中，于18 ˚C培养。每天更换0.1X MMR，并移除任何死亡胚胎。
3. 当胚胎发育至Nieuwkoop和Faber阶段约27–30⁷时 ，将胚胎转移至不含抗生素的0.1X MMR中，以促进肠道菌群生长。
4. 继续培养蝌蚪直至其达到摄食阶段（阶段45），然后将其转移至盛有0.1X MMR的100 mm培养皿中。每隔一天喂食一次荨麻粉上清液，中间间隔日更换0.1X MMR。
5. 在100 mm培养皿中培养一周后，将动物转移至装有蛙类养殖水[0.5 g/L Instant Ocean和2 mM 磷酸氢二钠（Na₂HPO₄：分子量141.96），pH 6.8]的半加仑水箱中。喂养方式同步骤2.4，但仅在水质浑浊时每周换水2–3次。维持动物在12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下，光照于早上6点开启。
6. 在测试前至少12小时（过夜），将装有测试对象的半加仑水箱放置在实验台垫等白色表面上。
7. 在步骤3所述条件下，对处于阶段45至50的蝌蚪进行测试。

2. 行为前准备：设备

1. 在实验室中划出一个专门用于行为实验的区域。该区域应安静、人员走动较少，并采用标准的荧光照明。
2. 为动物准备测试用的水箱。
   嵌套式的半加仑测试水箱由两部分组成：内层水箱用于盛水和放置蝌蚪；外层水箱用于放置视觉刺激物。
   1. 对于内层水箱，使用记号笔在外侧角落距底部5 cm处做一标记，作为水位线（图1A，绿色虚线）。
   2. 同样针对内层水箱，将水箱角落及中心处的凹陷部位用惰性材料（如Sylgard弹性体）填平。注意：若不填充这些区域，蝌蚪可能会在其中滞留。
   3. 对于外层水箱，将其中一个水箱的外侧恰好一半用黑色电工胶带覆盖，另一半用白色薄纸覆盖（图1B）。
3. 将水箱放置在接种转盘上。
4. 安装网络摄像头和三脚架，使其位于测试水箱正上方。调整摄像头位置，以便清晰观察测试区域，如 图1C所示。
5. 将网络摄像头连接至已安装QuickTime Player软件的计算机⁵。 打开摄像头。在QuickTime Player中，点击“文件”菜单，选择“新建影片录制”。此时计算机屏幕上将立即显示行为实验装置的画面。
6. 用轻质棉布将整个装置覆盖，以减少可能影响蝌蚪行为的外界干扰，并降低水面反光。
7. 确保棉布下的光照亮度维持在35–50 cd/m²之间。

3. 行为学实验

1. 用蛙水将内层测试罐注水至步骤 1.2.1 中标记的 5 cm 水位线处。
2. 使用小网轻轻将动物转移至内层测试罐中。
3. 在计算机上打开 QuickTime 软件，并以外层罐为参考，确保摄像头能够清晰观察并记录测试区域。
4. 将动物名称、日期和时间写在一张纸上，并用摄像头进行录制。
5. 将测试罐放入外层罐中，使测试罐的黑色面朝右，参见图 2。
6. 在放置好测试罐后立即开始录像，并设置计时器为 2 分钟。
7. 当计时器响起时，取出内层测试罐，将外层罐旋转 180°，再将内层测试罐放回外层罐中，重新启动计时器。注意：此时黑色面应位于另一侧。
8. 重复步骤 3.7，共进行十次试验（含首次），每次试验可参考图 2，并逐一标记已完成的试验。
9. 在两个不同的日期重复该行为检测实验。

4. 视网膜轴突切断术

1. 将动物置于0.02%三卡因溶液中，直至其对#3镊子夹捏尾部无反应。
2. 在0.1X MMR溶液中融化1%琼脂糖，然后倒入60 mm培养皿中。待冷却后，在琼脂糖中制作一个小型矩形凹槽，并将蝌蚪连同少量0.02%三卡因溶液放入凹槽中，使动物部分浸没于液体中。
3. 用25 G针头以45度角在眼睛背侧区域后方刺穿皮肤，同时用镊子在对侧固定动物。
4. 注意避免剪断紧邻视神经的静脉，用#5镊子小心伸入孔中，剪断视神经并将其翻转移开。若因不慎剪断动脉导致严重出血，应立即将动物放入2%三卡因溶液中实施安乐死。注意：2%三卡因溶液可导致人体麻木，操作时应佩戴手套。
5. 手术后恢复动物时，将动物置于含0.7X MMR和50 µg/ml庆大霉素的100 mm培养皿中，孵育20分钟。随后将蝌蚪转移至含有蛙类养殖水的恢复缸中，让动物过夜休息。
6. 次日早晨，按照前述方法（步骤3.1–3.9）检测视觉功能。

5. 分析结果

1. 试验结束后，测量蝌蚪停留在水箱黑色一侧的时间长度。
   1. 手动使用能够显示时间并可频繁暂停的软件观看视频。观察视频显示的时间，记录下两分钟间隔的起始时间点。 试验成功，即内罐完全嵌套入外罐中，且从摄像机视角观察已对齐。
   2. 利用蝌蚪眼睛的位置来确定动物在水箱的哪一侧游动。只有当两只眼睛都越过黑白分界线时，才定义为从水箱的一侧游至另一侧。
2. 记录动物在黑色区域停留的每个时间段的起始和结束时间（单位：秒）。暂停并回放视频以确保准确性。将秒数相加，计算总时长 每次试验中
3. 将这些数据输入附带的行为记录表。该记录表将通过从总时长120秒中减去动物在黑侧所花费的时间，自动计算动物在白侧所停留时间的比例。 试验并除以总时间（秒） [(120 - 在黑色区域停留的总秒数) / 120 秒]。工作表对全部 10 次试验的该比值取平均值。
4. 使用学生 t 检验，配对双尾分布，判断不同日期间的试验结果是否存在显著性差异（P ≤ 0.05）。

结果

先前的报道表明，变态前的Xenopus蝌蚪更喜欢在黑白相间的水箱中游向白色一侧，并将此检测称为背景颜色偏好检测³。我们对此检测方法进行了改进，以便在不到一周的时间内测试蝌蚪单侧眼睛的视觉功能。通过这种方法，蝌蚪的眼睛可被采集用于组织学检查。

我们在此展示该行为反应是由视觉线索引起的。视频1中，左侧面板和右侧面板中的蝌蚪为同一批动物。左侧为手术前的动物，右侧为切断双侧视神经后的动物。我们搅动水体，以证明并未添加任何物质来驱赶动物远离黑色一侧或吸引其趋向白色一侧。在视频中，我们在画面底部角落提供了蝌蚪的示意图，用以显示每组动物视神经的状态。视频1中，正常未手术的蝌蚪在测试水箱中不到30秒 即对背景颜色产生反应，而失明的蝌蚪则在水箱中无目的地游动。视频播放速度已加快，实际记录时间显示在右上角。

为了检测单眼的视觉功能，我们纳入了一只动物的实验结果，该动物的一侧视神经被切断，并在我们的检测中进行了测试。另一侧视神经在两...

讨论

本文报道了一种简单的视觉引导行为检测方法，经过最少培训的实验室人员可在一周内轻松完成。虽然其他检测方法需要专用设备以及动物行为学方面的专业知识，但本方法可快速测定视觉功能。另一种行为检测方法——视觉回避检测，已被开发用于研究视顶盖在Xenopus¹⁰视觉感知中的作用。该检测通过移动背景与静止背景的对比，测量空间调谐性和对比敏感度，因此能够比本文报道的简单检测方法更深入地评估基于视觉的特定行为。已有研究报道了一种自动化行为系统，可测量斑马鱼在水箱一侧停留的时间⁸。此外，目前也有商业软件（例如 ANY-maze 软件）可用于测量斑马鱼在黑暗或明亮环境中停留的时间⁹。而本文所报道的检测方法无需购买此类昂贵的设备或软件，仅依赖常规试剂和设备即可测定视觉功能。

视觉引导实验在单个动物上进行，以检测其视觉功能。当比较多只蝌蚪的行为实验结果时，我们观察到同一处理组内的动物之间无统计学差异。我们对三只蝌蚪连续测试了六天，另对五只蝌蚪连续测试了三天，每天进行十次试验。在这两种情况下，未处理组或单次轴...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1/2 加仑柔性储液罐（带盖）	eNasco	SB19271M	尺寸：5-3/8" × 7" 3-3/4"
黑色电工胶带
白色组织纸
大型接种转盘	VWR	50809-022	尺寸：直径 114.3 ×  H 76.2 mm（4 1/2）  x  3")
Durasorb 防护垫	VWR	82004-836	尺寸：43.2 × 60.1 厘米（17 × 24）")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
标准三脚架		各种
iSight 摄像头或网络摄像头	苹果	M8817LL/A	较大的蝌蚪适用，但较小的蝌蚪难以观察
便携式计算机	苹果/个人电脑	各种	我们使用了13" MacBook，配备 2 GHz Intel Core 2 Duo 处理器，运行 MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV 便携式摄像机	SONY	DCR-HC42	通过6芯和4芯alpha FireWire 400火线连接至计算机
手持摄像站	索尼	DCRA-C121	可用于连接火线接口与相机
QuickTime Player 软件	Quicktime	版本 10.1
26 G 针头（5/8）" 长度	VWR	BD305115
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11295-10
一次性用品
硫酸庆大霉素 [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	室温保存
Sylgard 184 硅酮弹性体	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	福斯特与史密斯医生	CD-116528	储备液 = 100 克/升，室温保存
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S0876	储备液 = 0.4 M，室温保存
体外 受精胚胎	eNasco	LM00490MX	100 个胚胎/单位