微流控芯片中微柱结构内生物膜流束形成的实验方案

摘要

本文讨论了在模拟多孔介质的微流控装置中研究生物膜形成的实验方案。该微流控装置包含一组微柱阵列，并在此装置中研究了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的生物膜形成过程。

摘要

多种细菌具有附着于表面并以称为生物膜的薄膜形式定植的能力。在多孔介质中生长的生物膜与多种工业和环境过程相关，例如废水处理和CO₂封存。我们采用革兰氏阴性需氧细菌Pseudomonas fluorescens，在模拟多孔介质的微流控装置中研究生物膜的形成。该微流控装置包含一系列微柱阵列，通过软光刻技术制备而成。随后，在有流动条件下研究了这些装置中的生物膜形成过程，我们在此装置中观察到了丝状生物膜（即流线状生物膜）的形成。本文提供了微流控装置的制备与组装的详细方案，以及细菌培养的实验流程。同时给出了使用该微流控装置进行实验的详细操作步骤及代表性结果。

引言

最近，我们在一种模拟多孔介质的微流控装置中展示了细菌生物膜的形成动态¹细菌生物膜本质上是由胞外聚合物（EPS）包裹的、在表面聚集形成的细菌群落。^2-4这些细菌薄膜几乎可以在所有可想象的生态位中形成，从光滑表面到多孔介质中更为复杂的生境皆可。Valiei 等.¹ 使用带有微柱阵列的微流控装置模拟多孔介质结构，并研究了在该装置中生物膜形成随流体流速的变化情况。他们发现，在特定流动条件下，不同微柱之间开始出现被称为“流苏状生物膜”（streamers）的丝状生物膜结构。这些流苏状结构可一端或两端固定于固体表面，其余部分则悬浮于液体中。流苏状生物膜通常在初始生物膜层形成后开始出现，其形成过程可主导此类复杂生境中生物膜的长期演化。近期，多位研究人员已对流苏状生物膜的形成动力学进行了研究。Yazdi 等.⁵ 表明射流可在源自振荡气泡的涡流中形成。在另一项实验中，Rusconi 等.⁶ 研究了通道曲率和通道几何形状对流线体形成的影响。他们发现，流线体可在微通道的弯曲段形成，且流线体的形态与微生物的运动性相关。近期研究表明，流线体在多种自然和人工场景中可能产生广泛影响，因其可作为多孔界面中成熟结构形成的前体，导致生物医学系统中生物膜的快速且灾难性增殖，并引发显著的流体-结构相互作用。 等等^1,7-9.

生物膜纤丝常在多孔介质等复杂生境中形成。研究生物膜在多孔介质环境中的生长规律，对于诸多环境与工业过程（如生物废水处理）具有重要意义¹⁰，维持井筒完整性在诸如 CO₂ 捕获¹¹ 以及土壤孔隙的堵塞¹²在多孔介质等复杂环境中观察生物膜的形成往往具有挑战性，原因在于多孔介质的不透明性。在这些情况下，基于微流控技术的多孔介质平台可展现出显著优势，因其能够实现对生物膜形成过程的实时观察和 在 原位 监测。微流控技术的另一优势在于，能够在单一的生物微流控平台上构建多个生物反应器，并同时实现在线监测和/或传感器的集成。微流控系统能够在同一装置中灵活地开展多项实验室实验，并具备收集大量相关数据以进行精确统计分析的能力，这是其重要的优势之一。^13,14.

在上述讨论的背景下，理解多孔介质环境中流式放电（streamer）形成的动力学过程将对多个应用领域具有重要意义。在本研究中，我们建立了用于研究模拟多孔介质装置中流式放电形成的实验方案。文中描述了微流控平台的制备过程、细胞培养及实验所必需的步骤。在实验中，我们采用了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的野生型细菌菌株。P. fluorescens 天然存在于土壤中，在维持土壤生态方面起着关键作用¹⁵。所使用的细菌菌株经过基因工程改造，能够持续表达绿色荧光蛋白（GFP）。

方案

请按照下述顺序执行实验方案。第1步介绍了用于构建微流控平台的微加工工艺。第2步描述了细菌培养方案（图2），第3步涉及实验装置的组装（图3）。最后，第4步详细说明了实际的实验操作步骤。

1. 芯片制备流程

注意：必须遵循以下所述操作的适当安全规程。详情请咨询机构安全官员。

1. 使用合适的软件设计掩模（例如，L-Edit）。通道设计包含一条主微通道，宽度为625 μm。通道的中央区域设有直径为50 μm、间距为25 μm的微柱阵列（见补充文件）。
2. 将此设计打印在玻璃（5" × 5" 苏打石灰玻璃），厚度为0.09" 并使用掩膜技术在其表面涂覆一层约70 nm厚的铬（Cr）层，以制备光刻掩模。用AZ400K显影液显影1分钟，随后用铬蚀刻液蚀刻铬层约1分钟。使用丙酮剥离光刻胶，并用冷王水（H₂SO₄ 和 H₂O₂ 3:1 的比例
3. 光刻技术
   1. 清洁标准4" 用 piranha 溶液对硅片进行化学处理 20 分钟。
   2. 用去离子水冲洗晶圆并将其干燥。
   3. 将晶圆置于加热板上加热（200 °C，15 分钟）。
   4. 在硅片上涂覆光刻胶。此处，将正性光刻胶AZ4620以2,000 rpm的转速旋涂于硅片上，持续25秒，得到厚度为12.5 μm的涂层。
   5. 将晶圆置于热板上漂浮加热90秒，通过软烘去除所有溶剂 在氮气流中于100 °C下进行，然后在相同温度下保持真空60秒。
   6. 将晶圆置于暗盒中静置24小时以进行脱水。
   7. 将晶圆暴露于紫外光下，以将设计好的图案转移到光刻胶上。
   8. 将晶圆浸入光刻胶显影液（AZ400K）中显影240秒，然后用异丙醇冲洗晶圆，并置于氮气气流中吹干。
4. ICP-DRIE（电感耦合等离子体-深反应离子刻蚀）工艺
   1. 进行DRIE刻蚀。根据器件所需的最终深度选择合适的刻蚀深度（本研究中为50 μm）。光刻胶在此过程中用作掩模层。
   2. 用丙酮去除残留的光刻胶并清洗晶圆。
5. PDMS（聚二甲基硅氧烷）浇铸
   1. 使用三氯甲基硅烷（TCMS）对硅胶母模进行硅烷化处理。取2至3滴三氯甲基硅烷滴入样品瓶中，置于干燥器内硅胶母模旁。静置2至3小时，完成硅烷化过程。
   2. 在另一个容器中，按10:1的质量比将Sylgard 184硅胶基质与固化剂混合，以制备PDMS。将PDMS置于真空条件下脱气（约2小时）。
   3. 将硅胶母模放入支架中，然后将PDMS倒入硅胶母模上以制备PDMS印章。此过程中需确保PDMS中无气泡产生。
   4. 在 80 °C 下固化 PDMS 2 小时。
   5. 从母模上剥离PDMS印章，然后将PDMS印章切割成独立的微芯片。最后，使用打孔器钻出进样口和出样口的孔洞。
6. PDMS与玻璃的键合
   1. 将盖玻片和PDMS印章置于氧气等离子体中处理30秒。将PDMS印章与盖玻片键合。
   2. 为实现PDMS印章与盖玻片之间的适当密封，将装置置于70 °C烘箱中退火10分钟。

2. 细菌培养

注意：步骤 2-4 必须遵循适当的生物安全规程。具体细节请咨询机构安全负责人。

1. 制备 LB 琼脂平板
   1. 将 20 g Luria-Bertani（LB）琼脂（Miller）粉末和 500 ml 超纯水加入 1 L 三角瓶中。搅拌至粉末完全溶解。
   2. 在 15 psi、121 °C 条件下高压灭菌 15 分钟。
   3. 将三角瓶置于生物安全柜中的台面或水浴中，冷却至 50–55 °C。
   4. 加入四环素抗生素，使其终浓度为 50 μg/ml。轻轻旋转混匀。
   5. 将混合液倒入培养皿中，每皿填充至 1/2 至 2/3 满。
   6. 如有气泡形成，可用火焰短暂灼烧以消除气泡。凝固后的气泡会影响细菌涂布的均匀性。
   7. 将平板在室温下静置过夜，使其冷却凝固。
   8. 冷却后，将平板放回包装袋中，密封袋口，贴上标签（注明抗生素种类和日期），并于 4 °C 保存。
      注意：应使用锡箔纸包裹平板库存，因为光照会使多种抗生素失活。
2. LB 液体培养基的制备
   1. 将 20 g Luria-Bertani（LB）液体培养基（Miller）粉末和 1 L 超纯水加入一个 三角瓶中。搅拌至粉末完全溶解。
   2. 在 15 psi、121 °C 条件下高压灭菌 15 分钟。
   3. 将三角瓶置于生物安全柜中的台面或水浴中，冷却至 50–55 °C。
   4. 加入四环素抗生素，使其终浓度为 50 μg/ml。轻轻旋转混匀。
   5. 冷却后，将已标记的瓶子置于 4 °C 保存。
      注意：应使用锡箔纸包裹瓶子，因为光照会使多种抗生素失活。
3. 在 LB 琼脂平板上培养细菌（本方案使用 Pseudomonas fluorescens）
   1. 从冰箱（-80 °C）中取出细菌保藏株，并置于冰上。
   2. 将 -80 °C 保存的细菌保藏株和一块 LB 琼脂平板放入生物安全柜中。
   3. 用接种环将细菌菌株以“之”字形划线接种于 LB 琼脂平板上。盖好平板后，在 30 °C 下培养过夜。最后将平板于 4 °C 冰箱中保存。
4. 制备细菌溶液（S1）
   1. 向已灭菌的三角瓶中加入 50 ml LB 液体培养基。此操作应在生物安全柜内进行。
   2. 从 LB 琼脂平板上挑取单个细菌菌落，转移至三角瓶中。此操作也应在生物安全柜内进行。
   3. 将三角瓶置于摇床培养箱中，在 30 °C、150 rpm 条件下振荡培养适当时间（4 小时）。
5. 制备稀释细菌溶液（S2）
   1. 向已灭菌的塑料离心管中加入 5 ml LB 液体培养基。
   2. 将 S1 与 LB 液体培养基混合进行稀释，随后涡旋振荡混匀。稀释至所需光密度（在 600 nm 处测得的 OD = 0.1）。
      注意：生物膜实验通常采用此范围内的 OD 值。

3. 准备实验装置

1. 使用镊子将柔性塑料管（内径 0.20"）连接至微流控芯片的进样口和出样口。这些进样口和出样口此前已在微流控芯片的 PDMS 部分钻孔制备（步骤 1.5.5）。本研究中，微流控芯片包含两个进样口和一个出样口。
2. 用细菌溶液（S2 溶液）填充注射器，并彻底排除注射器内的所有气泡。
3. 将注射器针头（30 G 0.5" 平头针）连接至进样管，然后将出样管连接至废液容器。

4. 运行实验

1. 将注射器连接至注射器针头。
2. 将注射器放置并固定在注射泵上。然后将微芯片置于光学显微镜下，使用所需放大倍数的物镜镜头例如，40倍）。用活细胞培养装置覆盖微流控芯片，以维持细菌生长所需的恒定温度环境（30 °C） P. fluorescens).
3. 将泵设置为所需的流速（例如 10 μl/hr），并启动液体泵送。
4. 一旦将细菌引入腔室，生物膜的形成也随之开始。生物膜的形成与成熟通常需要数小时甚至数天的时间。通过显微镜观察并拍摄生物膜生长过程的图像。

结果

采用上述微加工工艺，构建了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置。图1展示了该PDMS装置的扫描电子显微镜（SEM）图像。图1a显示了装置的入口区域，设计为叉状入口，以均衡装置内的压力头。进一步的SEM成像还表明，微柱的侧壁几乎呈垂直状态（图1b）。将培养的细菌溶液（图2）进行稀释，并将其光密度调整至0.1。我们研究了在不同输入流速条件下微流控装置中生物膜的形成情况。当以0.8 μl/hr的低流速将P. fluorescens注入装置时，细菌在装置内壁发生附着并形成生物膜。即使经过较长时间（>20 hr），也仅观察到贴壁生长的生物膜，未发现其他类型的细菌结构。随后，在8 μl/hr的流速下重复相同实验。在此情况下，稀释后的细菌培养液注入数分钟后即开始出现生物膜的形成。然而，数小时后，在装置中部区域观察到有丝状结构在微柱之间延伸（图4）。这些丝状结构可通过其中不动的细菌的存在而被观察到。此类结构被称为“流束”（streamers），是仅在一...

讨论

我们展示了一种简单的微流控装置，可模拟多孔介质，用于研究复杂生境中生物膜的发育过程。实验结果取决于若干关键步骤，其中包括装置的几何结构。虽然柱状结构的几何形状可以变化，但必须提供足够的孔隙空间以支持丝状生物膜（streamers）的形成。此外，Valiei 等.¹ 已证明，丝状生物膜的形成仅发生在特定的流速范围内。当流速低于某一阈值时，生物膜可能不会变形形成丝状结构；而当流速超过另一个较高的阈值时，生物膜可能发生断裂，从而抑制丝状结构的形成。另一个可能影响实验的问题是气体气泡可能被困在微柱阵列中。通常需要先提高流速以清除这些气泡，然后再逐步将流速降低至目标值。

此类微流控平台具有多种优势且局限性较少。该平台使我们能够使用较小的培养体积，并具有整合用户自定义特征的灵活性。例如，通过改变微柱阵列的几何参数，可以模拟不同的多孔结构。甚至可以利用微流控平台制造出模拟真实多孔介质随机结构的装置¹⁸。此外，可在单个装置上集成多个此类通道，从而收集大量相关数据，用于精确的统计分析。然而，微流控系统通常仅能模拟多孔介质的二维结构。能够模...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光显微镜	Nikon
LB 琼脂	Fisher	BP1425-500	将 40 g 溶于 1 L 纯化水中
LB 肉汤	Fisher	BP1427-500	将 20 g 溶于 1 L 纯化水中
生物安全罩	Microzone corporation
培养皿	Fisher	875712	无菌 100 mm × 15 mm 聚苯乙烯培养皿
摇床培养箱	New Brunswick Scientific		Excella E24 摇床培养箱系列
50 ml 无菌离心管	Corning	430828	聚丙烯，无 RNase/DNase
四环素碱基	MP Biomedicals	103012	50 μg/ml
SYLGARD 184 硅胶	Dow Corning Corporation	68037-59-2	弹性体基料和固化剂
正性光刻胶（AZ4620）
塑料管	Cole-Parmer