经颅磁刺激用于探究因果性脑-行为关系及其时间进程

摘要

经颅磁刺激（TMS）是一种无创干扰神经信息处理并测量其对行为影响的技术。当TMS干扰某项任务时，表明所刺激的脑区对正常完成该任务是必需的，从而可系统地将脑区与认知功能关联起来。

摘要

经颅磁刺激（TMS）是一种安全、非侵入性的脑刺激技术，利用强电磁铁暂时干扰大脑某一区域的信息处理过程，从而产生短暂的“虚拟损伤”。若刺激干扰了任务表现，则表明该受影响的脑区对正常完成该任务是必需的。换句话说，与功能性磁共振成像（fMRI）等仅能揭示脑活动与行为之间相关性的神经影像学方法不同，TMS可用于证明脑与行为之间的因果关系。此外，通过改变虚拟损伤的持续时间和起始时间，TMS还能揭示正常神经加工过程的时间进程。因此，TMS已成为认知神经科学领域的重要研究工具。相较于脑损伤-功能缺损研究，该技术的优势包括对干扰效应具有更高的时空精确性、能够以受试者自身作为对照，以及受试者招募的便利性。其局限性包括可能影响任务表现的伴随性听觉和躯体感觉刺激、对距离头皮表面数厘米以上的脑结构难以有效刺激，以及实验成功所需优化的自由参数较多。通过精心设计实验方案并设置适当的对照条件，可在一定程度上缓解上述问题。本文以TMS研究结果为例，探讨左侧缘上回（SMG）在阅读过程中所起的空间与时间作用。

引言

经颅磁刺激（TMS）是一种安全、非侵入性的脑刺激工具。它利用导电线圈中的快速变化的电流产生强大但相对聚焦的磁场。当施加于头皮时，该磁场会在下方的脑组织中诱导出电活动，暂时干扰局部皮层的信息处理过程。这种短暂的干扰有效地制造了一个短暂存在的“虚拟损伤”^1,2。该技术为推断大脑与行为之间的因果关系，以及研究健康成人和神经疾病患者在线神经信息处理的时间动态，提供了一种非侵入性的方法。

通过选择性干扰特定脑区的皮层加工过程，经颅磁刺激（TMS）可用于建立脑区与特定行为之间的因果关系^3,4。也就是说，如果相对于适当的对照条件，刺激某一皮层区域显著影响任务表现，则表明该被刺激区域对于正常完成该任务是必需的。此类因果推断是TMS相较于功能性磁共振成像（fMRI）或正电子发射断层扫描（PET）等神经影像学方法的主要优势之一。与通过测量神经活动并将其与行为相关联的神经影像技术不同，TMS提供了一种干扰神经信息处理并测量其对行为影响的机会。从这一意义上讲，TMS更类似于对脑损伤患者进行的传统病灶-功能缺失分析，但TMS具有非侵入性，且其效应是暂时且可逆的。此外，TMS相较于病灶研究还具有多项优势。例如，刺激效应通常在空间上比自然发生的病灶更为精确，后者往往范围较大且在不同患者间差异显著。此外，受试者可作为自身的对照，从而避免了患者组与对照组在发病前能力可能存在差异的问题。最后，在TMS过程中，功能重组所需的时间不足，因此恢复过程不太可能对结果造成干扰⁵。换句话说，TMS为研究因果性的脑-行为关系提供了一种强有力的工具，可与功能性神经影像等相关性技术相互补充。

通过使用极短的刺激脉冲并改变刺激的起始时间，经颅磁刺激（TMS）还可用于研究神经信息处理的时间进程⁶。通常，这种方法涉及在一次试验的不同时间点，向特定脑区施加单脉冲或双脉冲TMS。由于单个TMS脉冲的作用是即时发生的，持续时间大约在5至40毫秒之间^7-10，因此研究者可借此描绘出区域神经元活动的时间动态，包括其起始、持续和终止时间^11,12。这种干扰作用的持续时间限制了该技术的时间分辨率为数十毫秒，大致比脑电图（EEG）和脑磁图（MEG）粗一个数量级。然而，计时性TMS研究中观察到的时间点通常比EEG和MEG更接近侵入性神经电生理记录的结果^9,13。这可能是因为EEG和MEG测量的是大规模的神经元同步活动，而这种同步活动滞后于神经活动的最初起始时间¹⁴。此外，与fMRI和PET类似，EEG和MEG是全脑活动的相关性测量手段，而计时性TMS不仅能提供有关区域时间动态的重要信息，还能揭示该脑区对特定行为的必要性。

尽管经颅磁刺激（TMS）最初是为研究运动系统的生理学而开发的¹⁵，但它很快被采纳为认知神经科学中一种有价值的工具。TMS最早作为“虚拟损伤”技术的应用之一，是通过刺激左侧额下皮层诱发言语中断^16-18。这些结果证实了布洛卡区在言语产生中的重要性，并提示TMS可能成为瓦达试验的一种替代方法，用于神经外科干预后确定语言优势半球^16,19。如今，TMS已广泛应用于认知神经科学的几乎所有领域，包括注意²⁰、记忆²¹、视觉处理²²、动作规划²³、决策²⁴以及语言处理²⁵。通常，TMS会引发错误率升高或反应时间（RTs）延长，这两者均被视为脑与行为之间因果关系的指标^3,4。一些研究同时将TMS用作虚拟损伤手段和计时工具。例如，Pitcher及其同事¹¹首先发现，对枕部面孔区施加重复性经颅磁刺激（rTMS）会干扰准确的面部辨别能力；随后他们采用计时性TMS确定，该效应仅在TMS刺激施加于60毫秒和100毫秒时出现，表明这一特定脑区在面孔识别的早期阶段即参与面孔局部信息的处理。本文所提及的所有示例中，TMS均以“在线”方式施加，即在任务执行期间进行，因此TMS效应是即时且短暂的（i.e.，效应持续时间与刺激持续时间相当）。这与“离线”TMS形成对比，“离线”TMS涉及在任务开始前进行长时间低频刺激²¹或短暂的模式化刺激脉冲²⁶，其效应可持续至TMS施加结束后很长时间。本文仅聚焦于“在线”TMS方法。

开展任何经颅磁刺激（TMS）实验的初始步骤包括确定刺激方案和选择定位方法。刺激参数包括TMS的强度、频率和持续时间，这些参数受到国际公认的安全标准的限制^27,28。每个TMS实验还需要采用合适的定位方法，以准确地将线圈放置并定向于刺激靶点。定位可基于标准空间坐标²⁹或10-20定位系统³⁰，但通常需针对每位受试者进行个性化定制³¹。对于个性化定位，有多种可选方案，包括根据个体解剖结构进行靶向刺激³²、利用功能磁共振成像（fMRI）进行功能定位³³，或利用TMS本身进行功能定位³⁴。本文所介绍的方案推荐将TMS功能定位作为在线TMS实验通用流程的一部分。随后，本文以一个示例说明如何利用TMS探究左侧缘上回（SMG）在阅读过程中语音加工功能中的作用。

方案

该方案已获得伦敦大学学院伦理审查委员会（#249/001）批准，用于对神经系统正常的健康志愿者进行非侵入性脑刺激。

1. 创建经颅磁刺激（TMS）方案

认知神经科学中几乎所有的经颅磁刺激（TMS）实验均采用双相刺激，并结合使用“8”字形线圈。这种方法能够以尽可能高的精度靶向皮层位点，并递送快速的脉冲序列（> 1 Hz）。虽然也可使用单相刺激³⁵或不同形状的线圈³⁶，但本实验采用了标准配置。

1. 选择刺激的频率和持续时间。
   注意：在认知神经科学中，通常选择在刺激开始后以 10 Hz 的频率进行 500 毫秒的刺激^37-40。
2. 根据大量预实验结果选择刺激强度，并在所有受试者中保持恒定。
   注意：对于本实验所使用的设备，常用的刺激强度范围为最大刺激输出的 50 - 70%^11,41-44。
3. 选择试次间间隔。出于实际操作和安全性的考虑，每次刺激之间的间隔应至少为 3 - 5 秒^27,45。

2. 执行头部配准

1. 在经颅磁刺激（TMS）前的单独会话中，为每位参与者获取高分辨率的T1加权解剖磁共振成像（MRI）扫描。图像中应包含将在步骤2.3中使用的标记点。 
2. 在TMS会话前将扫描图像载入无框架立体定位系统，以便准确靶向每位参与者的刺激位点。在实验开始时在头部标记刺激位点，或在实验过程中持续监测。
3. 在参与者的图像上标记四个标记点。通常包括鼻尖、鼻根以及两侧耳屏前切迹上方的耳前 notch。
4. 向参与者提供有关经颅磁刺激（TMS）的信息，使其能够知情同意参与实验。
5. 要求参与者填写由机构审查委员会（IRB）批准的TMS安全筛查表。 
   注意：TMS的永久性禁忌症包括个人或家族癫痫史、神经系统或精神疾病临床病史，或植入式医疗设备（如心脏起搏器或人工耳蜗）。不遵守TMS安全要求可能诱发晕厥或癫痫发作。
6. 将受试者追踪器放置在参与者头部，作为测量标记点时的参考。使用立体定位系统配套的指针触碰受试者头部的每个标记点，并在计算机上保存相应的坐标。将受试者头部与MRI图像进行校准。检查配准质量，必要时重复该过程。
7. 要求参与者在刺激期间佩戴耳塞，以减弱线圈放电时产生的声音，避免对听力造成损伤⁴⁶。
8. 根据第1节中所作的选择设置TMS设备。 
9. 在正式测试前先向参与者介绍刺激过程，确保其熟悉刺激感觉并能良好耐受。首先在研究人员的手臂上示范刺激，然后在参与者的手臂上进行，以帮助其适应该感觉。
   注意：对于首次接受TMS的参与者，此步骤尤为重要。
10. 在各个测试位点分别演示刺激方案，因为不同部位的感觉可能不同。将线圈置于无框架立体定位系统确定的第一个位点，使线圈与头皮相切，且最大磁通量的连线通过刺激靶点。 
    注意：刺激有时会影响面部神经或肌肉，可能导致不适，因此必须测试参与者是否能够良好耐受。

3. 进行功能定位

1. 根据每位参与者的情况定制刺激位点以优化刺激效果。在参与者的结构像上标记出目标脑区内的多个潜在刺激位点。考虑到经颅磁刺激（TMS）的空间分辨率⁴⁷，使用网格或解剖标记将各目标位点相互间隔至少10 mm（图1）。
2. 选择一个能够反映目标认知功能且具有可量化行为指标的定位任务（例如，反应时、准确率、眼动）。在测试多个可能位点时重复执行该任务，并设计任务的不同版本，以避免刺激材料的重复呈现。
3. 让参与者在无刺激条件下练习该任务，直至其熟练掌握。随后引入第二次练习环节，其中50%的试验随机（或伪随机）施加TMS刺激，使参与者适应在不受刺激干扰的情况下完成任务。
4. 选择一个测试位点并运行一个版本的定位任务。完成后立即检查结果，判断刺激是否影响了任务表现。 
   注意：在许多情况下，刺激“非正确”位点反而可能相对于无刺激条件提升反应表现，这是由于跨感官促进作用²所致，本例中表现为听到刺激点击声及头皮上的刺激感。此外，过大的刺激效应（即超过100毫秒）往往是人为假象，需重新测试。若该效应可重复且仅出现在特定测试位点，则可能是真实效应。务必选择可靠的TMS效应指标，以确保定位的准确性。 
5. 若未观察到效应，应更换新的测试位点并重复测试；否则应对同一站点再次测试，以确认效应是否可重复。在同一实验环节中连续测试多个位点，确保并非所有位点均产生效应，否则提示存在非特异性的TMS效应。不同参与者之间的刺激位点顺序应进行交叉平衡。

4. 主要任务

1. 在完成定位后，于同一实验环节中，使用已通过功能定位确定的目标位点运行主实验。
   注意：这将涉及与定位所用任务不同的任务，但该任务需共享关键的研究过程。例如，可使用押韵判断任务来定位对词语语音处理敏感的脑区，而主要实验则可采用同音异形词判断任务。在此例中，尽管具体任务要求和刺激材料不同，但两个任务均需要对书面词汇进行语音加工。
2. 设置充足的对照条件，以排除经颅磁刺激（TMS）的非特异性效应。
3. 在不包含目标加工过程的对照任务中测试同一脑区，以验证其加工的功能特异性。
4. 在主要任务中测试不同的位点，以证明该效应的解剖学特异性。
5. 增加额外的对照条件，例如假性TMS、对照刺激或多个时间窗口。
6. 使用与定位过程中相同的经颅磁刺激（TMS）参数进行传统的“虚拟病变”实验例如，刺激的强度、频率和持续时间）。对于计时TMS实验，使用相同的强度，但将定位过程中使用的脉冲序列替换为单个脉冲⁴⁸ 或双脉冲⁴⁹ 以不同的潜伏期起始。

结果

图2展示了作为示例提到的两项经颅磁刺激（TMS）实验的结果。其中，第一项实验探究了左侧缘上回（SMG）是否在词语语音加工过程中起因果性作用，而第二项实验则探究了这种作用的时间动态特性。图2A展示了第一项实验的代表性结果，该实验在三个任务期间对SMG施加了重复经颅磁刺激（rTMS，10 Hz，5个脉冲，最大强度的55%）。语音任务要求受试者关注词语的发音（“这两个词听起来一样吗？knows-nose”），而语义任务则要求关注其意义（“这两个词意思相同吗？idea-notion”）。第三个控制任务呈现成对的辅音字母串，并要求判断它们是否完全相同（“wsrft-wsrft”）。每个任务包含100次试验。结果表明，在语音任务中，与无刺激条件相比，TMS使反应时（RT）显著延长，平均增加37毫秒。相比之下，SMG刺激对语义任务或正字法控制任务中的反应时均无显著影响。换句话说，左侧SMG的“虚拟损伤”选择性地干扰了词语语音的加工过程，表明SMG在书面词语语音信息处理中具有必要性⁴⁴。

图2B展示了探索SMG内语音处理时间进程的计时实验的代表性结果。在此实验中，双脉冲TMS在刺激开始后的五个不同时间窗口施加，实验采用相同的语音任务，共100次试验，分为五个相等的区块，每个区块测试一个不同的时间窗口。与基线条件（40/80毫秒）相比，当TMS在刺激开始后80/120、120/160和160/200毫秒施加时，反应时间（RTs）显著增加。这些结果表明，SMG在刺激开始后80至200毫秒期间参与了语音处理，提示其在语音处理中具有早期且持续的参与作用⁴⁴。

图1. 标记潜在刺激位点的两种常用方法。（A） 第一种方法是在手部运动区放置一组标记网格，并逐一测试，直到经颅磁刺激（TMS）产生预期效果。该方法常用于确定运动“热点”，即刺激能引发最强且最可靠肌肉收缩的位置。（B） 第二种方法通过在定义明确的脑区内放置一组标记，引入额外的解剖学限制。在此示例中，三个标记的位置被限定于缘上回（SMG）的前部区域：第一个位于外侧裂后升支末端的上方；第二个位于前部SMG的腹侧末端；第三个则大致位于前两个位置的中间。刺激标记显示在个体MRI扫描的旁矢状面图像上，采用无框架立体定位系统。左下角的黑色标尺表示1 cm的距离。

图 2. 从刺激开始后的反应时间（RTs）。（A） 三种不同语言任务中的无TMS（浅色柱）和TMS（深色柱）条件。（B） 语音任务中的五种刺激时间条件。在此处展示的示例中，双脉冲分别在刺激开始后 40/80 毫秒、80/120 毫秒、120/160 毫秒、160/200 毫秒以及 200/240 毫秒施加。第一个时间窗口（40/80 毫秒）被用作基线对照条件，因为视觉信息预计不会如此迅速地到达缘上回（SMG）。误差线表示经调整以准确反映被试内变异性的平均标准误⁵⁰。第一次实验包含12名被试的数据，第二次实验包含32名被试的数据。*p < 0.05。

讨论

本文介绍了一种利用在线经颅磁刺激（TMS）评估脑区在认知过程中因果性及时间性作用的实验方案。本文首先强调了设计成功TMS方案的关键步骤，随后讨论了在设计TMS实验时需要考虑的局限性。

由于经颅磁刺激（TMS）方案具有大量可调参数，确定最佳刺激参数是准备TMS实验的关键步骤。通常，需要通过广泛的预实验来确定能够产生显著效应所需的刺激频率、持续时间、强度、试次间间隔以及线圈方向。为了产生有效的“虚拟损伤”效应，所选频率必须诱导出足够强且持续时间足够长的效应，以覆盖目标认知过程的时间窗口。因此，不同研究中频率和持续时间各不相同。同样，“合适”的刺激强度应确保磁场能够影响目标脑区的神经活动，其中主要影响因素是线圈与刺激位点之间的距离⁵¹。许多研究通过刺激初级运动皮层的手区，确定引发运动反应所需的刺激强度，并以此作为标准化各被试刺激强度的依据^52,53-55。然而，该指标并不能可靠地反映非运动脑区的最佳刺激强度^42,51,56。另一种选择是对所有被试使用相同的刺激强度，该强度应在尝试多种刺激强度后，在所有预实验被试中均被证实有效。此外，线圈方向也是一个需要考虑的重要参数。特定的线圈方向会影响刺激区域内神经元群体中感应电场的分布，从而可能影响行为表现。通常，已发表的实验方案可作为起点，在预实验过程中逐步调整以适应具体实验需求。然而，最终论文中常常省略有关预实验的信息，这在无意中掩盖了方案设计过程中的一些关键环节。

选择合适的定位方法对于确保将刺激施加到最佳位点也至关重要。尽管许多研究已成功采用基于解剖结构的方法来定位刺激位点，即在不同受试者中均针对同一位置进行刺激^57,58，但为每位受试者 individually 定制刺激位点可减少行为结果中的个体间差异，从而提高方法的效率³¹。本文介绍了一种基于经颅磁刺激（TMS）的功能性定位方法，该方法相较于基于功能磁共振成像（fMRI）的定位具有优势。具体而言，该方法避免了fMRI（即，引流静脉⁵⁹）与TMS（即，轴突在磁场中的取向^6,60）之间存在的不同空间偏差，这些偏差可能导致相同的神经反应被定位到不同的位置。此外，众所周知，fMRI中激活“峰值”位置的具体定位可能存在显著变异，使其作为TMS靶点并不理想^55,61。即便如此，已有多种不同的定位方法被证实有效，因此具体方法的选择不如确保所采用的方法能够产生可靠且可重复的效果重要。

尽管本实验中呈现的数据采用反应时间作为因变量指标，但仍存在许多其他可选方案。例如，部分研究采用准确性作为替代指标^9,12,62。在这些情况下，未施加经颅磁刺激（TMS）时的正常表现已低于上限水平，因此刺激所引起的干扰会反映在准确率得分上。另有研究测量了刺激对眼动的影响^63,64。然而，大多数认知神经科学领域的TMS实验仍以反应时间作为主要因变量指标^13,48,65,66。通常，其效应量级在数十毫秒范围内，或大致相当于反应时间约10%的变化⁶⁷。无论采用何种因变量指标，均应具备足够的稳健性和一致性，以便于清晰观察到相对微小的变化。

与其他实验技术一样，经颅磁刺激（TMS）在选择该方法时也存在一些重要的局限性需要考虑。最常见的局限性包括：i）TMS 的空间分辨率；ii）与刺激相关的非特异性效应；iii）该方法的安全性问题。首先，TMS 的刺激深度有限，因为磁场强度随着与线圈距离的增加而减弱。因此，它最适用于刺激靠近头皮的脑区（约 2 - 3 cm）^68,69，而对深部脑结构的刺激则无效。结果表明，TMS 能直接作用的脑区仅限于大脑皮层，尽管目前已有不同形状的线圈正在研发中，以期能够达到如基底神经节等更深层的脑区⁶⁹。此外，TMS 的空间分辨率约为 0.5 - 1 cm^47,70-72。因此，该方法无法用于研究诸如皮层柱等精细空间结构的功能贡献。

TMS 的第二个局限性在于，由于快速变化的磁场，刺激会同时引入感觉副作用。最显著的是，每次磁脉冲都伴随着听觉上的“咔哒”声和敲击感。因此，在某些听觉或躯体感觉实验中，这些副作用可能会干扰任务表现，TMS 可能并不适用。然而需要注意的是，在线 TMS 已在一些听觉实验中成功应用^73,74，因此至少在部分任务中是可行的。另一个需要考虑的问题是，不同头部位置引起的感官效应强度存在差异。例如，靠近耳朵的刺激部位所产生的声音比远离耳朵的部位更响亮。同样，头部更腹侧的区域比背侧区域引起更强的肌肉收缩^75,76。由于这些部位差异可能引入实验混杂因素，因此重要的是采用与主要刺激部位具有相似副作用的对照部位（例如对侧同源区域）⁷⁷，或设置不涉及目标加工过程的对照条件/任务^{24,62,73,78,79}。

最后，在设计经颅磁刺激（TMS）实验时，必须始终考虑安全性问题，因为TMS可能诱发晕厥和癫痫发作²⁷。为降低此类风险，国际上已制定有关刺激强度、频率和持续时间的公认指南，同时也制定了关于总脉冲数和试次间间隔的指南^27,28。遵循这些指南的实验方案被认为对神经系统正常的受试者是安全的。然而需要指出的是，这些指南目前尚不完善，且经常有新的TMS方案被提出并证明同样安全。总体而言，现有证据表明，只要遵循已发表的指南，TMS是一种安全的程序，不会产生危险的副作用。但这些限制带来的一个结果是，行为学实验范式通常需要进行调整后才能与TMS联合使用。这会对实验设计的多个方面产生影响，包括实验时长、试次数、可测试的条件数量以及刺激位点数量。其中一些限制可通过将实验拆分为多个独立的实验环节来克服，例如在不同日期测试不同的刺激位点。在此类情况下，必须确保同一实验环节内完成某个位点的定位与测试，以最大程度提高靶向准确性，从而最小化实验变异。在决定采用单次还是多次测试环节时，根本限制因素是受试者的安全——特别是单次实验环节中安全的刺激总量。总刺激量包括熟悉过程、练习、定位（如使用TMS）和测试，可能涉及多个位点，且关键取决于每个条件下的试次数。当总刺激量超过单次实验环节的安全指南时，必须将实验拆分为多个环节，且各环节之间至少间隔24小时。目前尚无关于TMS实验所需最小试次数的绝对标准，但与任何实验一样，可根据效应量、方差、α水平（通常为0.05）和期望的检验效能，通过标准的统计功效计算来确定。通常，由于在优化实验方案过程中已进行了大量预实验，因此可以获得对效应量和方差的合理估计。

总之，经颅磁刺激（TMS）已成为认知神经科学领域中具有广泛应用的重要工具。本文提供了一种在线TMS与行为任务相结合的基本实验方案，可用于研究因果性的脑-行为关系，既可在“虚拟损伤”模式下使用，也可作为时间分辨工具，探索特定脑区神经信息处理的时间动态特性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Magstim Rapid2 刺激器	英国卡马森郡，Magstim公司
70 mm 直径的8字形线圈
Brainsight 无框架立体定向系统	RogueResearch，加拿大蒙特利尔
Polaris Vicra 红外相机	加拿大安大略省滑铁卢，Northern Digital公司