由人类多能干细胞定向分化为多巴胺能神经元

摘要

我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。

摘要

中脑黑质致密部中的多巴胺能（DA）神经元（也称为 A9 DA 神经元）是帕金森病（PD）中特异性丢失的细胞类型。目前，人们高度关注从人多能干细胞（hPSCs）中获得 A9 DA 神经元，以用于 PD 的再生性细胞替代治疗。在神经发育过程中，A9 DA 神经元起源于位于中枢神经系统腹侧中线的底板（FP）前体细胞。在此，我们优化了 hPSCs 分步分化为 A9 DA 神经元的培养条件，该过程模拟了胚胎期 DA 神经元的发育过程。在本方案中，我们首先描述了利用小分子方法从 hPSCs 高效生成 FP 前体细胞，随后将这些 FP 细胞转化为 A9 DA 神经元，并可长期维持 体外 数月。该高效、可重复且可控的方案在来自正常人及帕金森病（PD）患者的正常人源胚胎干细胞（hESCs）和人源诱导多能干细胞（hiPSCs）中均表现良好，可由此获得A9类多巴胺能神经元以开展 体外 疾病建模与药物筛选 体内 帕金森病的细胞移植治疗

引言

多巴胺能（DA）神经元存在于多个脑区，包括中脑、下丘脑、视网膜和嗅球。位于黑质致密部（SNpc）的A9多巴胺能神经元通过向端脑的纹状体投射，形成锥体外系运动系统，从而调控行为和运动。A9多巴胺能神经元的退化会导致帕金森病（PD），帕金森病是人类第二常见的神经退行性疾病，目前尚无法治愈。细胞替代疗法是治疗帕金森病最有前景的策略之一¹，因此，人们高度关注从人类多能干细胞（hPSCs）——包括人类胚胎干细胞（hESCs）和近年来出现的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）——中获得A9多巴胺能神经元。

大量研究尝试利用不同方法从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成A9型多巴胺能神经元。早期所有报道均通过神经玫瑰花结前体阶段来产生多巴胺能神经元。通过与MS5共培养² 或 PA6^3-5 在有或无外源生长因子的条件下培养2-4周后，L. Studer 及其同事与其他三个研究团队成功诱导人胚胎干细胞（hESCs）形成神经玫瑰花结。随后，他们通过机械分离或酶消化方法富集这些玫瑰花结，以进行进一步分化。在其他研究中，研究人员通过拟胚体（embryoid body, EB）悬浮培养分化的方式生成神经玫瑰花结。^6-9随后，研究人员建立了一种基于单层细胞的分化方法^10,11，他们在细胞外基质上接种人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），并在培养过程中添加不同的生长因子，以诱导人多能干细胞（hPSCs）向多巴胺能神经元分化，该过程模拟了 体内 胚胎多巴胺能神经元发育。尽管这些研究均获得了表达酪氨酸羟化酶（TH）且具备某些多巴胺能神经元特征的细胞，但整个分化过程耗时且费力，通常效率低下；更重要的是，除利用LMX1a异位表达的一项研究外，大多数研究均未证实这些神经元具有A9型身份。¹²最近，一种基于新腹侧板（floor plate, FP）的实验方案被开发出来^13-16，其中在分化早期阶段，通过激活音猬因子（sonic hedgehog）和经典Wnt信号通路首先生成具有多巴胺能神经元潜能的底板（FP）前体细胞，随后这些底板细胞进一步特化为多巴胺能神经元。尽管该方案效率较高，但仍存在一些问题；例如，整个分化过程耗时较长（至少35天），且依赖于饲养细胞¹⁵，或依赖EB¹⁶ 或未证实其A9身份¹⁴.

此处，基于已有的知识 体内 胚胎多巴胺能神经元发育及其他研究者已发表的结果，我们优化了培养条件，以高效地从人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）生成多巴胺能神经元。我们首先通过小分子CHIR99021激活经典Wnt信号通路，同时使用小分子SAG和purmorphamine激活音猬因子（sonic hedgehog）信号通路，从而诱导形成前脑前体细胞（FP前体细胞）。这些FP前体细胞表达FOXA2、LMX1a、CORIN、OTX2和NESTIN。随后，我们利用生长因子BDNF、GDNF进一步将这些FP前体细胞定向分化为多巴胺能神经元。 等等生成的多巴胺能神经元为A9型细胞，因其对GIRK2呈阳性而对Calbindin呈阴性¹⁷该方案无需饲养细胞或拟胚体，具有高效且可重复的特点。利用此方案，可在不到4周的时间内从正常人的hESCs或hiPSCs中获得多巴胺能神经元，用于细胞移植研究；或从帕金森病（PD）患者的hiPSCs中获得 体外 帕金森病的建模或帕金森病潜在治疗药物的测试。

方案

1. 培养基的制备

1. 通过混合以下成分制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基：445 ml DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 14 天。
2. 通过混合以下成分制备含血清的人多能干细胞（hPSC）培养基：385 ml DMEM/F12、100 ml KnockOut 血清替代物（KSR）、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液、5 ml 100× β-巯基乙醇储备液以及 10 ng/ml bFGF。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
3. 通过混合以下成分制备无血清 mTeSR1 培养基：400 ml mTeSR1 基础培养基、100 ml 5× 补充剂和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
4. 制备 10× 胶原酶 IV 储备液：称取 0.5 g 胶原酶 IV 粉末，溶于 50 ml DMEM/F12 中，过滤除菌。分装后于 -20 °C 保存数月。
5. 制备 0.1% 明胶溶液：称取 0.5 g 牛皮来源 B 型明胶粉末，溶于去离子水中，经高压灭菌后于室温保存数周。
6. 通过混合以下成分制备 KSR 分化培养基：410 ml DMEM、75 ml KSR、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液和 5 ml 100× β-巯基乙醇储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
   注意：KSR 不同批次间存在差异，可能影响分化效率。因此建议测试多个批次的 KSR，以筛选出最适合分化的批次。
7. 通过混合以下成分制备 N2 分化培养基：98 ml DMEM、1 ml 100× N2 补充剂和 1 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
8. 通过混合以下成分制备 B27 分化培养基：480 ml 神经基础培养基（neurobasal medium）、10 ml 50× B27 补充剂、5 ml 100× GlutaMAX 储备液和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。

2. 在MEF饲养层细胞上培养hESC和hiPSC

H9 人类胚胎干细胞（hESCs）购自 WiCell 研究所，人类诱导多能干细胞（hiPSCs）则由 Reijo Pera 实验室通过逆转录病毒介导的 Yamanaka 因子 OCT3/4、SOX2、KLF4 和 c-MYC 转导建立¹⁸。

1. 在细胞传代至少前一天，向6孔板的每个孔中加入1 ml 0.1%明胶，制备明胶包被板，并在37 °C孵育至少30分钟。
2. 孵育结束后，吸除孔中的明胶，使用血细胞计数板计数细胞，以每孔1.6 × 10⁵个细胞的密度将经辐照失活的MEF细胞接种至孔中，加入MEF培养基。
   注意：MEF饲养层可选择在细胞传代前3天准备。
3. 在接种MEF饲养层后的第二天进行细胞传代：吸除hPSCs的培养基，每孔加入1 ml含1 mg/ml IV型胶原酶的溶液，于37 °C孵育1小时。
4. 在孵育期间，用PBS洗涤MEF饲养层一次，然后每孔加入1.5 ml预热（37 °C）的含血清hPSC培养基。
5. 1小时后，轻轻敲击培养板数次，使大部分未分化的细胞集落从板底脱落，而分化集落仍附着于板上。小心收集漂浮的集落，并转移至15 ml离心管中。
6. 用预热（37 °C）的DMEM/F12培养基轻柔洗涤培养板一次，并将洗涤液转移至同一15 ml离心管中。
7. 将离心管以179 × g离心3分钟。
8. 吸除上清液，注意不要扰动沉淀。加入预热的hPSC培养基，轻轻吹打数次使细胞团块分散为较小的集落，并充分混匀。
9. 按1:3至1:6的比例将细胞接种至新的MEF饲养层上。
10. 每天更换培养基，每5–6天传代一次细胞。

3. 分化细胞的制备

1. 至少在细胞准备前一日，制备一些Matrigel包被板（通常为6孔板中的3个孔）。用冷的（4 °C）DMEM/F12以1:40的比例稀释Matrigel，每孔加入1 ml。将Matrigel板在4 °C孵育过夜。注意：可用Parafilm密封Matrigel板，并在4 °C保存长达一周。
2. 传代后第4天使用细胞（见步骤2）。去除培养板上所有已分化的克隆。吸除培养板中的培养基，每孔加入1 ml accutase，于37 °C孵育5 min。
3. 孵育期间，通过向6孔板的每个孔中加入1 ml明胶来制备若干明胶板。将这些明胶板与前一日制备的Matrigel板一同放入培养箱中。
4. 5分钟孵育后或当细胞变为半悬浮状态时，将细胞上下吹打数次，使其分散为单细胞。
5. 将单细胞收集至15 ml离心管中，在258 × g下离心3分钟。
6. 用适量含血清的hPSC培养基重悬细胞，并加入Thiazovivin至终浓度为2 µM。
7. 以1:1比例将细胞接种至明胶包被的培养板中，在37 °C孵育30分钟以去除MEF饲养层细胞。
8. 将细胞转移至15 ml锥形管中，加入含有适当血清的hPSC培养基，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。
9. 以 258 × g 离心 3 分钟。
10. 离心期间，将 Thiazovivin 加入适量 mTeSR1 培养基中，使其终浓度为 2 µM。
11. 离心后，吸除培养基，并加入含Thiazovivin的适量mTeSR1培养基，使细胞密度为1.8 × 10⁵ 细胞/毫升培养基
12. 从培养箱中取出Matrigel板，吸除Matrigel，将2 ml混合细胞加入6孔板的1个孔中。
    注意：细胞密度应为 3.6 x 10⁴ 细胞/厘米²² 表面积。
13. 将培养板放回培养箱，让细胞贴壁培养24小时。
14. 细胞接种后24小时，吸除旧培养基，每孔加入2 ml新鲜mTeSR1培养基，继续培养24小时后再开始诱导分化。

细胞分化

1. 细胞重铺于Matrigel板后48小时开始诱导分化。
2. 从培养板中吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次，每孔加入 2 ml 下述分化培养基：含 10 µM SB431542 和 100 nM LDN-193189 的 KSR 分化培养基。将此日标记为分化的第 0 天（D0）。
3. 从第0天到第20天，每天更换培养基。
   注意：培养基的制备量应以不超过2天内使用完毕为宜。
4. D1和D2阶段使用以下培养基：KSR分化培养基，添加10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine和50 ng/ml FGF8b。
5. D3和D4阶段使用以下培养基：KSR分化培养基，添加10 µM SB431542、100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine、50 ng/ml FGF8b和3 µM CHIR99021。
6. D5和D6阶段使用以下培养基：75% KSR分化培养基与25% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189、0.25 µM SAG、2 µM purmorphamine、50 ng/ml FGF8b和3 µM CHIR99021。
7. D7和D8使用以下培养基：50% KSR分化培养基与50% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189和3 µM CHIR99021。
8. D9和D10使用以下培养基：25% KSR分化培养基与75% N2分化培养基混合，添加100 nM LDN-193189和3 µM CHIR99021。
9. D11和D12使用以下培养基：B27分化培养基，添加3 µM CHIR99021、10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF、1 ng/ml TGF3、0.2 mM 抗坏血酸和0.1 mM cAMP。
10. 使用以下培养基进行后续分化：B27分化培养基，补充10 ng/ml BDNF、10 ng/ml GDNF、1 ng/ml TGFβ3、0.2 mM 抗坏血酸和0.1 mM cAMP。
11. 在分化第16天左右，准备一些多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板。将多聚-L-鸟氨酸储存液用冷（4 °C）PBS稀释至15 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，于37 °C孵育过夜。
12. 吸出聚-L-鸟氨酸溶液，用无菌水洗涤培养板3次，然后将培养板风干。
13. 将层粘连蛋白储备液用预冷的（4 °C）PBS稀释至1 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，37 °C孵育过夜。
14. 吸去层粘连蛋白溶液，用无菌水洗涤培养板3次，然后将培养板风干。
15. 将纤连蛋白储备液用预冷的（4 °C）PBS稀释至2 µg/ml，每孔加入1 ml至6孔板中，37 °C孵育过夜。
16. 用Parafilm密封培养板，并置于4 °C保存，时间最长可达两周。
17. 经过20天的分化后，将细胞重铺至多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板中。吸除分化培养基，向6孔板的1个孔中加入1 ml预热（37 °C）的Accutase溶液，于37 °C孵育5 min。
18. 孵育期间，将聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白/纤连蛋白包被的培养板放入培养箱中。
19. 5分钟孵育后或当细胞变为半悬浮状态时，轻柔地将细胞上下吹打数次，使其分散为单细胞。
20. 将单细胞收集到15 ml锥形管中，加入适量神经基础培养基用于细胞计数，培养基体积需根据细胞扩增情况调整（分化11天后，细胞可能扩增15–20倍）。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
21. 以 258 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，用 B27 分化培养基重悬细胞，使细胞浓度为 1 × 10⁶ 细胞/毫升培养基
22. 吸弃培养板中的纤连蛋白，用 PBS 洗涤两次，每孔加入 2 ml 细胞至 6 孔板中。
    注意：重铺板时的细胞密度应为 2 x 10⁵ 细胞/平方厘米² 表面积。
23. 24小时后更换培养基，以去除未贴壁的死细胞。
24. 每隔一天更换一次培养基，直至达到特定实验的预定时间点。

结果

分化方案的总体概述见图1。本方案的分化效率取决于起始细胞的状态。因此，必须确保以下三点：首先，在将hPSCs解离为单细胞进行分化之前，应彻底清除所有已分化的克隆；其次，通过将细胞在明胶包被的培养板上孵育30分钟，尽可能耗尽（若非全部）MEF饲养层细胞；第三，将hPSC单细胞以适当的密度接种至Matrigel包被的培养板上。如图2所示，重铺的hPSC单细胞在分化前48小时内以细胞簇形式扩展，培养板中约形成70%的融合度。分化后，这些细胞在短短3-4天内即可达到完全融合，从大约D16-D17开始，融合的细胞层中开始出现空隙，可在这些空隙及细胞层下方观察到轴突/神经突。在D20重铺后，已分化的细胞以小团块形式贴壁并生长。随后5天内，这些团块中会延伸出更为密集且形态完整的轴突/神经突，不同团块之间的轴突/神经突开始形成连接。在长期培养过程中，同一团块内的神经元产生更多的突起，逐渐成熟，并与邻近团块中的神经元建立更多连接。

经过11天的分化后，人多能干细胞（hPSCs）可高效地转化为前脑前体细胞。如图3

讨论

人类多能干细胞（包括hESCs和hiPSCs）可被诱导分化 体外 以生成我们体内大多数（即使不是全部）类型的细胞，包括多巴胺能神经元，这一点已在先前的研究中得到证实¹⁹基于胚胎多巴胺能神经元发育的相关知识²⁰ 以及其他实验室已发表的实验方案^14,15我们优化了从人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化生成多巴胺能神经元的培养条件。该方案高效、可重复，我们已成功将此处所述的方案应用于H1和H9 hESC系，以及来自帕金森病（PD）患者和健康对照个体的hiPSC系。

在我们的实验方案中，获得高效分化率有三个关键步骤：首先，在定向分化前，细胞中不应存在已分化的hPSC集落。由于hPSC培养过程中常出现向三个胚层自发分化的现象，因此在将hPSC解离为单细胞之前，必须清除这些已分化的集落。其次，应从解离后的hPSC中去除MEF饲养层细胞，因为已有研究表明，MEF细胞可分泌促进自我更新并抑制分化的因子²¹。为此，将hPSC与MEF细胞混合物在明胶包被的培养板上孵育3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	10569-010
FBS	Life Technologies	26140
青霉素/氨苄青霉素	Life Technologies	15140-122
DMEM/F12	Life Technologies	10565-018
KSR	Life Technologies	10828-028
非必需氨基酸	Life Technologies	11140-050
β-巯基乙醇	Millipore	ES-007-E
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
IV型胶原酶	Life Technologies	17104-019
明胶	Sigma-Aldrich	G9391
N2添加剂	Life Technologies	17502-048
B27添加剂	Life Technologies	17504-044
Neurobasal	Life Technologies	21103-049
Glutamax	Life Technologies	35050-061
PBS	Life Technologies	10010-023
生长因子减少型Matrigel	BD Biosciences	354230
Accutase	MP Biomedicals	1000449
Thiazovivin	Santa Cruz Biotechnology	sc-361380
SB431542	Tocris Bioscience	1614
LDN-193189	Stemgent	04-0074
SAG	EMD Millipore	566660-1MG
Purmorphamine	Santa Cruz Biotechnology	sc-202785
FGF8b	R&D Systems	423-F8-025
CHIR99021	Cellagen Technology	C2447-2s
BDNF	R&D Systems	248-BD-025
GDNF	R&D Systems	212-GD-010
TGF-β3	R&D Systems	243-B3-002
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4034
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
小鼠抗人NESTIN抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927	1/1,000 稀释
兔抗人OTX2抗体	Millipore	AB9566	1/2,000 稀释
山羊抗人FOXA2抗体	R&D Systems	AF2400	1/200 稀释
兔抗人LMX1a抗体	Millipore	AB10533	1/1,000 稀释
兔抗人TH抗体	Pel Freez	P40101	1/500 稀释
鸡抗人TH抗体	Millipore	AB9702	1/500 稀释
小鼠抗人TUJ1抗体	Covance	MMS-435P	1/2,000 稀释
兔抗人GIRK2抗体	Abcam	ab30738	1/300 稀释
兔抗人Calbindin抗体	Abcam	ab25085	1/400 稀释
离心机	Eppendorf	5804