二斑叶螨 Tetranychus urticae 在植物-害虫互作研究中的应用

摘要

为开展植物-害虫互作研究，已建立高效制备均一性二斑叶螨样本、实验植物接种及植物受害程度评估的实验方案。

摘要

二斑叶螨， 二斑叶螨，是一种常见的多食性节肢动物植食者，能够取食种类极为广泛的植物，其中包括超过150种具有经济价值的作物。它是温室作物的重要害虫，尤其在 茄科 和 葫芦科 (例如番茄、茄子、辣椒、黄瓜、西葫芦）和温室观赏植物（例如玫瑰、菊花、康乃馨）、一年生大田作物（如玉米、棉花、大豆和甜菜）以及多年生作物（苜蓿、草莓、葡萄、柑橘和李子）^1,2除了其极强的多食性使其成为重要的农业害虫外， T. urticae 容易对用于其防治的多种杀虫剂和杀螨剂产生抗性^3-7.

T. urticae 是一种优秀的实验生物，因其生命周期短（在27°C下为7天），且可在实验室中以高密度轻松培养。检测基因表达的方法（包括 原位 杂交与抗体染色）以及利用RNA干扰技术失活植食螨内源基因表达的方法已被建立^8-10. 近年来，全基因组序列 T. urticae 已有报道，这为将该害虫植食性昆虫发展为模式生物创造了机会，使其具备与其部分寄主植物中已有的基因组资源相当的条件（拟南芥 和 番茄 Solanum lycopersicum)¹¹. 综上所述，这些 模式生物有助于揭示植物与害虫相互作用的分子基础。

本文介绍了一种高效、快速且简便的方法，用于大量采集成年雌性螨虫，将其应用于实验植物寄主，并评估由于叶螨取食造成的植物损伤。本方案可实现对各个发育阶段（卵、幼虫、若虫、成年雄螨和雌螨）数百个个体的快速高效采集，采集的螨虫可用于后续实验处理。

引言

植物与害虫的相互作用是一个具有重要科学和经济意义的研究课题。历史上，该领域研究既使用农作物（如番茄），也使用模式植物A. thaliana。在这两类系统中，植物对植食性害虫的敏感性均可通过直接评估害虫取食后的植物表型，或间接评估害虫自身的表现来测定。

以往已采用多种方法对多种昆虫害虫种类的植物感病性进行直接测定。例如，鳞翅目幼虫的取食危害可通过肉眼借助方格网估算Plutella xylostella（小菜蛾） 或Trichoplusia ni（甘蓝夜蛾） 取食的植物组织比例来进行测量¹²。此外，也有利用叶片损伤的数字成像并结合后续定量图像分析的方法。此类方法已被用于研究A. thaliana与Frankliniella occidentalis（西方花蓟马）¹³、Scaptomyza flava（潜叶蝇）¹⁴以及T. ni¹⁵的相互作用。

植物感病性的间接测定方法在植物与害虫互作研究中被广泛使用。例如，通常通过分析害虫繁殖力以及植物互作后的整体形态变化来评估A. thaliana对桃蚜Myzus persicae取食的感病性^16,17。另一个典型的A. thaliana对害虫感病性的间接指标是测定植食性昆虫的干重或鲜重。该参数常用于表征鳞翅目昆虫（如Pieris rapae（小菜蛾）、P. xylostella或T. ni）在幼虫或蛹期的取食情况^15,17。

蜘蛛螨是细胞内含物取食者。螨害症状表现为一系列黄化斑点，颜色从白色至浅绿色不等。此前对植物宿主对蜘蛛螨取食的敏感性评估，主要通过间接方式，即分析接种螨虫数天后其种群表现来进行^18,19或直接利用植株在被侵染数周后的整体形态学特征¹⁸ 或对暴露于螨虫数天的叶片进行数字成像，随后进行自动图像分析¹⁹这些方法正在被开发并用于研究番茄植株之间的相互作用 T. urticae 和 通常使用少量叶螨（每处理5-15头），从混合螨群中采集，并用软毛刷将其转移至叶片表面。然而，这些方法不适用于需要施用较大量螨的研究。此外，尽管可直接在图像分析软件（如Adobe Photoshop（San Jose, CA）或ImageJ）中处理叶片图像²⁰ 可用于番茄损伤分析，但这些方案需要修改后才能应用于表面反射率更高、颜色较浅且具明显腺毛的叶片例如, A. thaliana）会干扰自动识别标记植物损伤的黄化斑点。此外，先前方法可有效利用的螨虫发育阶段仅限于最常见且易于识别的成年雌螨，无法利用其他发育阶段。

实现植物与叶螨互作高通量分析的首要关键步骤是建立可重复、简单且稳健的实验方案，用于以叶螨侵染植物，并可靠地评估互作结果。

本视频介绍了一种快速高效收集大量成年雌性螨虫的简便方法，以及将其应用于实验植物寄主并评估因叶螨取食造成的植物损伤的实验方案。本方案可快速高效地收集数百个处于任何发育阶段（卵、幼虫、若虫、成年雄虫和雌虫）的个体，用于后续实验操作。此外，这些方法可适用于任何螨虫寄主植物，但本文以拟南芥（A. thaliana）为例进行具体演示。

方案

1. 螨虫种群的维持

注意：蜘蛛螨在加州红芸豆（Phaseolus vulgaris）上进行培养。

1. 在接种前 2-3 周从种子开始培养菜豆植株。
2. 将这些植株与已感染的植株混合；成年螨虫会迅速定殖到新鲜的植物材料上。
3. 每 7-10 天移除一次旧的感染菜豆植株， 并更换为新鲜植株。

2. 收集成年雌性螨虫

1. 采用洗涤法收集螨虫
   1. 为采集螨虫，在实验前1至2天将一株新鲜的豆科植物与已感染的植物接触。
   2. 使用20至30株新鲜的豆类植株收集1,000至2,000只成年雌性螨虫。
   3. 使用室温自来水配制0.001%的Tween 20溶液。
   4. 用吐温20溶液清洗生虫的豆科植物，使用2 至 3 植物在某一阶段 时间。
   5. 每株植物清洗2-3次，以收集叶片上的全部螨虫。
   6. 在10分钟内完成步骤2.1.4 以避免螨虫死亡。
2. 通过特定孔径筛网过滤悬浮液分离成年雌性螨虫
   1. 准备以下孔径的筛网：500 µm（用于去除杂质）和 300 µm（用于收集雌性成年螨虫）图 1A).
   2. 将悬液通过500 µm筛网过滤。
   3. 将悬液再次通过300 µm筛网过滤，成年雌性螨虫将被截留。
   4. 将带有成年雌性螨虫的300 µm筛子浸入干净的自来水中，以去除Tween 20。
   5. 将螨虫在筛子底部平铺成单层。
   6. 用纸巾擦去筛网和筛子侧面多余的水分。注意：这样做的目的是让螨类快速干燥，以便恢复。
   7. 按图示准备组装装置 图 1B；这将允许螨虫自由移动，但能防止其逃逸。
   8. 将装有螨虫的筛子置于用作支撑的筛子上方。
   9. 用清水包围底部筛网，以防止螨虫扩散。注意：螨虫约5分钟后开始恢复活动。约30分钟后，活动螨虫的数量已足够开始收集。图 1D）。应在1小时内收集螨虫，因为它们会分泌丝状物，干扰收集过程。

3. 螨虫侵染植物

注意：一旦成年雌性螨虫恢复活力，即可用于植物接种。共有2种 用于将成年雌性螨虫接种至实验植物的方法：a）使用细毛刷（方案第3.1节）和b）使用泵或真空管线（方案第3.2节）。

1. 使用毛刷进行螨虫接种
   注意：使用毛刷接种螨虫适用于每株植物接种不超过30只螨虫的情况。
   1. 使用00号或更细的软毛圆形画笔。
   2. 用室温自来水润湿毛刷。
   3. 用刷尖轻轻从筛网上拾取螨虫，并将其转移至植物上。
2. 使用抽吸装置进行螨虫接种
   注意：当接种螨虫数量超过30只时，可采用通过抽吸装置收集螨虫进行植物接种的方法。本方法可使用用于拾取微电子元件的真空泵或真空管线。保持气流稳定且强度足够（2–4 psi）至关重要。
   1. 使用底部被切开的1.5 ml 离心管作为连接泵或真空管与吸头之间的适配器，将1 ml 移液器吸头连接到与泵或真空管线相连的管子上。
   2. 在移液器吸头与适配器（1.5 ml 离心管）之间放置一小片纸巾。注意：此步骤的目的是在抽吸过程中将螨虫截留在移液器吸头内，同时降低气流强度（图 1C）。
   3. 直接使用移液器吸头从筛网上收集螨虫。
   4. 或者，在体视显微镜下逐个从已感染的叶片上收集螨虫。
   5. 收集到所需数量的螨虫后，将移液器吸头从管子上取下，注意确保吸头后端的纸巾保持原位不动。
   6. 通过轻敲移液器吸头使螨虫聚集在一起，然后将其放置于叶片上；数秒内，螨虫即开始在叶片上扩散。

4. 记录与评估植物损伤

1. 记录植物损伤
   注意：对于 A. thaliana，4天后评估植物损伤情况 螨虫取食天数。损害记录为 黄化斑点的总面积。为了测量损伤程度，将整株莲座叶切除并进行扫描。所述扫描参数适用于Epson V30扫描仪，但可作为其他类似平板扫描仪的良好起始设置。所有实验应保持扫描参数一致，以便不同实验运行之间进行比较。
   1. 用透明胶片覆盖扫描仪床面，以防止植物材料污染扫描仪表面。
   2. 切割整株莲座叶，将其放置在扫描仪载物台上，使叶片的近轴面（上表面）朝向扫描仪的光源和感光元件。若莲座叶过于密集，导致无法在无重叠的情况下完整获取各叶片图像，可先用精细剪刀将莲座叶分解为单个叶片或互不重叠的叶片组，再置于扫描仪载物台上。可同时扫描多个莲座叶。
   3. 用一张白纸覆盖莲座叶或叶片，以防止其粘附并污染扫描仪盖板。
   4. 关闭扫描仪盖，按以下参数进行扫描：分辨率：1,200 dpi；色彩模式：Adobe RGB；亮度：+25；文件类型：最高质量 JPEG。
   5. 保存图像文件以供后续损伤分析。
2. 植物损伤量化
   注意：损伤面积使用 Photoshop 手动计算。由于植株叶片形状差异较大，且因螨类取食导致的症状颜色强度变化显著，自动计算方法不可靠。因此，采用网格法评估植物损伤程度：
   1. 使用 Photoshop 打开植物图像。
   2. 新建一个图层，然后将扫描图像叠加到一个划分为 0.25 mm × 0.25 mm 网格的网格上（视图或显示 – 显示 – 网格，键盘快捷键 Ctrl + ‘）。
   3. 在叠加图层上，使用点标记受损叶片区域（使用“铅笔工具”，键盘快捷键为 B）。对于下方网格中受损面积超过单个网格单元一半的区域，每个网格仅用一个点表示。点的大小以像素为单位定义。即， 每点 52 像素。
   4. 当网格中所有显示植物损害面积至少覆盖网格单元一半的方格均已被标记点标记后，使用直方图工具（窗口 - 直方图）确定该图层上的总像素数。直方图工具可用于测量像素数量。由于每个标记点均由恒定且已知数量的像素表示，因此直方图工具所测得的总像素数即代表标记点的总数，进而表示已标记方格的总数。
   5. 使用以下公式计算标记的“点”数量：
      点的数量 = 总像素数 / 每点像素数。
   6. 通过将图像上标记的点数乘以单个点的面积来计算损伤总面积 网格的一个方格，因为一个点对应于网格的一个方格。

结果

使用20至30株被侵染的豆科植物，可通过筛分法收集约2,000只成年雌性螨虫。若使用毛刷转移螨虫，将每株植物接种20只螨虫，接种10株植物所需时间约为15分钟。收集与施用方法的组合方式见图2。

本方案可产生可重复的植物损伤结果，表明所收集的螨虫具有相似的生理状态，适用于植物与蜘蛛螨互作研究（图3A）。为评估该方案的可重复性，采用冲洗法收集成年雌性螨虫，将20只螨虫用湿润的刷子转移至4周龄A. thaliana植株（生态型Col-0）的莲座叶上。处理后的植株在接种4天后进行扫描，并利用上述方法量化损伤面积。重复实验结果的比较采用方差分析（ANOVA）进行。

作为实验应用的一个示例，我们通过在每株植物上使用湿毛刷接种20只雌性蜘蛛螨，并在感染后4天记录植株受损情况，评估了3个A. thaliana生态型对蜘蛛螨取食危害的自然抗性变异。扫描图像中典型的损伤表型如图3B所示。随后，可将损伤数据以柱状...

讨论

本视频演示了用于分离并用大量成年雌性螨虫侵染植物的实验方案。尽管我们以拟南芥（A. thaliana）为例展示了该方案，但它适用于任何植物与叶螨的互作系统，目前也已成功应用于番茄和葡萄（Vitis vinifera）植株。该方案可获得可重复的实验结果，表明所收集的螨虫处于相似的生理状态（图 3）。

尽管这些方案操作简单，但有几个关键步骤需要特别注意，因为它们会影响螨虫的回收率。从叶片上冲洗螨虫时，必须同时在最多三株豆科植物上进行，并且必须在10分钟内完成。 使用室温水。此外，需将螨虫铺展在筛子上以实现快速干燥。若螨虫回收率不理想，重要的是检查是否使用了推荐量的Tween 20洗涤剂，并确认在冲洗步骤中是否已将洗涤剂彻底去除。

本方案存在两个主要局限性：a) 使用泵收集螨虫适用于收集30只以上的螨虫，但若需收集较少数量的螨虫，则必须使用毛刷，效率相对较低；然而，通过冲洗法收集并富集成年螨虫可显著提高其应用便利性；b) 通过评分褪绿斑表面损伤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
植物材料：
加州红肾豆	Stokes, Thorold, ON, 加拿大		2周龄，使用前2至3天用叶螨充分侵染。其他品种的 菜豆 可以使用。
化学品：
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	1% 储备液的配制旨在简化分装操作
自来水			在室温下，热休克和冷休克影响螨类的存活率和生理表现
其他材料和设备：
塑料托盘
剪刀组
2 L 烧杯
纸巾
筛网组	自行生产		详细的说明可获取
细刷
移液器
移液器吸头			0.2 和 1 ml
1.5 ml 离心管
空气泵			水族箱型泵，带倒置气流。可使用真空管路。所需压降约为 2-4 psi
体视显微镜
扫描仪	Epson	V30	任何能够对扫描质量进行必要控制的平板扫描仪。我们的实验使用 Epson V30。
计算机			兼容扫描仪硬件和 Adobe Photoshop 软件的 Windows 或 OS X 电脑。
Adobe Photoshop 软件	Adobe Systems Inc.，美国加利福尼亚州圣何塞	各种	包含直方图工具的任意版本。