微型双元件应变计的制备与植入用于测量 体内 啮齿类动物的胃肠道收缩

摘要

在实验动物胃肠道中对平滑肌收缩进行体内测量仍是一种强大但尚未被充分利用的技术。目前市场上无法购得柔性双元件应变规，需自行制备。本方案描述了用于在啮齿类动物中进行急性或慢性植入的可靠且低成本应变规的构建方法。

摘要

胃肠道功能障碍仍然是导致发病率和死亡率的主要原因。事实上，胃肠道（GI）在健康与疾病状态下的运动功能是一个富有成果的研究领域，仅在过去5年中就发表了超过1,400项动物研究。目前已开发出多种技术用于定量评估胃、小肠和结肠的平滑肌活动。 体外 和 离体 技术为胃肠道功能的机制研究提供了强有力的工具，但这些研究往往脱离了完整有机体所具备的整合性系统环境。通常，测量 体内 胃平滑肌收缩的研究通常采用麻醉状态下的动物模型，结合手术植入的压力传感器、轻度充气的气囊等静态压力负荷，或在等压反馈控制下用液体扩张胃部的方法。然而，这些方法在结果解读及其应用性方面均存在某些独特的局限性 体内 用于清醒实验动物模型。将双元件应变片固定于胃肠道浆膜表面的方法具有多种实验优势，其优点可能持续超过局限性。由于此类应变片尚未商业化供应，本视频详细展示了当前设计应变片的逐步制备流程。本方案所述应变片专为记录大鼠胃动力而设计，但该设计已改进用于记录整个胃肠道平滑肌活动，仅需在制备过程中进行细微调整。文中还包含来自整个胃肠道的代表性数据，以及数据分析方法、结果解读与数据呈现的讨论。

引言

记录的实验研究 体内 在多种实验条件下研究胃肠道（GI）运动功能，仍是理解维持营养稳态所必需的正常及病理生理过程的有力工具。传统上，已有多种实验方法被用于此类研究，其中一些方法与临床实践中采用的技术相似。 ¹，已被用于直接量化胃肠道收缩频率的变化 ^2-5管腔内压力 ^{6, 7}，或非吸收性标记物的胃肠道通过情况 ^{8, 9} 或稳定同位素 ^10-12每种技术都有其独特的优缺点，这些已在先前的文献中有所讨论。例如，由于球囊材料本身具有顺应性，气囊测压法在量化压力变化方面的有效性受到质疑；而通过胃肠道回收不可吸收标记物的方法则需处死实验动物才能获得单个数据点。最近，已有研究报道并验证了一种微型动脉压导管的应用，该方法为监测大鼠和小鼠的胃收缩功能提供了一种非手术手段。 ³虽然经口胃置入的压力传感器可通过避免侵入性手术来有效消除对胃肠功能的混杂因素影响，但该方法仅适用于麻醉状态下的实验准备。此外，由于缺乏可视化引导，无法确保传感器在胃内特定区域的一致性定位。因此，该技术的应用仅限于胃或结肠，而在十二指肠或回肠中，由于无法实现可视化，且传感器导丝相对较硬，故不可行。

同样，生物磁交流磁化率测定法（ACB）技术已通过胃肠道收缩分析的验证⁴。尽管ACB技术为测量胃肠道收缩提供了一种非侵入性方法，但其存在类似的局限性，即使用摄入的磁性检测介质无法精确记录胃肠道特定区域的活动。该局限性可通过外科植入磁性标记物加以克服。然而，ACB技术要求动物在数据采集期间处于麻醉状态。

超声微测距技术已用于部分胃肠道研究^{13, 14}，以利用压电晶体发射/接收器体积小、空间分辨率和时间分辨率高的优势。胃平滑肌收缩波并非高频事件，其发生频率约为每分钟3至5个周期。因此，超声微测距的时间分辨率优势可能并不足以证明其成本的合理性。此外，尽管超声微测距能够准确测量线性运动，但已有研究指出，若植入的晶体数量不足，则可能影响胃肠道数据的准确解读¹⁴。

基于 Bass 及其同事的原始设计^{2, 15}，本可视化方案更全面地记录了微型双元件应变规的逐步制作及其在实验中的应用。该应变规具有高灵敏度和良好的柔韧性，可用于记录整个胃肠道平滑肌的收缩活动。由于成品应变规的灵敏度和尺寸主要取决于包裹元件的硅胶片，因此其元件尺寸适用于所有啮齿类动物实验。这些应变规可方便地用于麻醉状态或自由活动的实验动物模型中的急性或慢性实验，从而提供一种定量检测平滑肌收缩的统一技术。

方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院指南，并经宾夕法尼亚州立大学赫尔希医学院机构动物护理和使用委员会批准。大鼠饲养遵循常规动物实验设施操作规范。注意：本方案使用8周龄及以上、初始体重为175–200 g的雄性Wistar大鼠。

1. 应变片制作步骤

1. 大多数工具和组件仍可从原始公司或其后续公司获得，详见表1。
2. 两个单元件应变片的制备与粘接
   1. 使用洁净的Dumont #5镊子小心操作应变片元件（EA-06-031-350）。为限制元件不必要的移动，可使用一小块洁净的自粘纸，粘性面朝上，将元件固定在工作台面上，避免污染或过度粘附。
   2. 将两个单应变片元件背对背粘接，形成双元件结构。用异丙醇清洁每个元件薄膜的背面，并让其自然挥发干燥（用纱布擦拭常会引入难以去除的纤维污染物）。在体视显微镜（1–3倍）引导下，使用洁净的艺术家画笔（10-0号驼毛笔），在其中一个元件背面涂上一层薄薄的环氧-酚醛胶粘剂，立即让第二个元件的背面与之接触，并对齐箔格 （图1A）。
   3. 将粘接好的元件置于50–60 °C烘箱中过夜，以充分固化环氧树脂。
      注：切勿夹紧粘接后的元件，否则多余的环氧树脂可能渗出并污染元件，压力也可能导致网格错位。双组分环氧树脂混合后在冷藏条件下仅可使用6周。建议一次性粘接并固化足够数量的元件，并将其储存在洁净、无尘的环境中以备后续使用。
3. 双元件应变片的修整与布线
   1. 使用#11手术刀或单刃剃须刀片，将粘接好的双元件修整至最终尺寸3 mm × 3 mm。暂时保留双元件最顶端部分不切割，以便后续安全操作元件 （图1A）。
   2. 每个元件需要一根四导线电缆，由三芯可焊接聚四氟乙烯（Teflon）绝缘线（型号336-FTE）制成。将一段30 cm长的三芯编织线拆分为三根独立导线。
   3. 为制作四芯电缆，将其中一根单导线与另一段30 cm三芯线中同色的导线配对。在后续步骤中，这些颜色相同的导线将在终端端连接，形成最终应变片的共用导线（图1B）。
   4. 使用热剥线钳从每根导线两端去除约1 mm的聚四氟乙烯绝缘层。使用活化松香助焊剂和低温焊锡（熔点183 °C），用电烙铁对导线端头进行镀锡处理。
   5. 下一阶段需使用微焊烙铁头，以形成更精细的焊点，防止热量损伤元件的薄膜层（图1C）。为制作更小的微焊头，取一段细铜丝（直径约0.25 mm），在标准烙铁头上缠绕一圈，确保铜丝超出标准烙铁头的长度。
   6. 用洁净的10-0号画笔仅在粘接双元件一侧的焊盘上涂助焊剂，并将一根单导线和一根配对的共用导线焊接到焊盘上（图1D）。焊接后可用蘸有树脂溶剂的洁净画笔清除残留助焊剂。
   7. 在另一侧重复该过程，确保剩余的共用导线焊接到与原始共用导线相对的焊盘上。
4. 双元件应变片的测试与环氧封装
   1. 将金质插座连接器（E363/0）焊接到导线末端。此时将应变片连接至记录放大器（如下所述），以测试双元件组件的完整性。
   2. 使用高质量的电压-欧姆表测量电阻。元件的电阻值约为350 Ω。若连接不良，应在此阶段使用新焊料重新焊接。
   3. 若焊点和双元件组件均符合要求，则剪除剩余的元件薄膜。
   4. 使用双组分硅橡胶环氧树脂（型号E211）在元件焊盘上的焊点处涂覆一层薄薄的绝缘层。为获得最佳效果，建议在涂覆前将树脂部分固化20–30分钟（图1E）。
5. 在硅胶中封装双元件应变片
   1. 将三片0.5 mm厚的硅胶片（型号20-20）裁剪为15 mm²大小，并用蒸馏水清洁硅胶。将其中一片硅胶裁剪成U形，以便最终双元件组件嵌入时不会使封装硅胶发生形变（图1F）。
   2. 在无缺口的硅胶片内表面涂上透明硅胶粘合剂。
   3. 将双元件组件夹在U形缺口与对齐的外层硅胶片之间，然后从中心向外轻轻挤压，排出多余的硅胶和气泡。将封装好的组件小心地夹在两块金属条之间，保持24小时，以确保厚度均匀且无变形。
   4. 允许多余的硅胶保留在组件边缘并固化。在后续将硅胶片修剪至所需最终尺寸（通常为6 mm × 8 mm；图1G）时再将其去除。
6. 导线连接器的完成与校准
   1. 使用3 mm（1/8英寸）热缩管加固金质插座连接器与各终端导线之间的焊点，并将其固定在塑料电极基座（MS363，图1H）内。使用直径为0.125英寸和0.25英寸的热缩管固定电极基座和导线，防止实验过程中连接脱落（图1I）。
   2. 应变片信号通过高增益桥式放大器（型号AMP-01-SG）处理。使用带匹配插头（363-SL/6）的电缆将应变片连接至放大器，以匹配电极基座。螺纹帽可提供额外固定，确保实验期间信号持续稳定。
   3. 根据制造商说明，调节放大器上的桥路、平衡和增益设置，针对特定应变片进行优化。将应变片导线引出端水平固定于刚性夹具上，并按照Pascaud及其同事最初描述的方法，在另一端施加1 g静态负载进行校准^{2, 16, 17}。

2. 应变计急性植入的手术操作

1. 动物护理与准备：
   1. 实验动物在手术植入前一晚进行食物剥夺（可自由饮水）。
   2. 深度麻醉动物。首选硫喷妥巴比妥（100–150 mg/kg；大鼠腹腔注射）用于终末期（即., 非存活) 应变片植入与实验，因其在大鼠中具有持续的麻醉效果且对胃反射影响极小 ¹⁰测试足爪夹捏反射是否消失以确定麻醉深度。
   3. 根据实验设计和批准的IACUC指南，对大鼠进行无菌手术准备，包括对手术器械进行灭菌、剃除切口部位毛发、涂抹兽用眼膏以及对所有手术区域进行消毒。 注意： 若将应变片用于慢性实验，仅可使用环氧乙烷（气体）灭菌法对其进行灭菌。采用热力或化学灭菌方法可能会损坏应变片。
2. 用于终末实验的气管插管
   1. 对于需要长时间、终末期的实验，需对大鼠进行气管插管以维持气道通畅。从下颌骨下缘至胸骨切迹处，在颈部腹侧做一条1–2 cm的正中切口。
   2. 沿中线钝性分离下方的带状肌以暴露气管。将气管与下方的食管分离，并在气管与食管之间置入一根3-0 Ethilon缝线形成牵引线。
   3. 通过做一个小切口从前侧打开气管 在甲状腺远端的气管软骨环之间的膜部，插入一段5毫米长、一端斜切的小段聚乙烯导管（货号 PE-270）至气管内，并用结扎线固定。
   4. 将带状肌复位，并使用3-0 Ethilon缝线缝合浅层皮肤。
3. 将应变片仪器安装至胃肠道表面：
   1. 手术前，使用#14锥形尖3/8圆弧针，将4-0或更细的无菌丝线（长度为4–5 cm）穿入应变片的四个角。丝线具有较高的柔韧性，不易损伤应变片元件外的硅胶封装层。
      注意：丝线适用于非存活手术以及内部应用，其中不存在细菌通过上皮屏障被毛细作用引渡的风险。在需要进行存活手术的应用中，必须使用聚丙烯缝线（prolene suture），以降低丝线编织纤维固有的感染风险。
   2. 沿腹壁正中线切开皮肤行剖腹手术。沿腹直肌之间的白色线（无血管区）切开腹直肌，以防止出血。然后在壁层腹膜上做一非常表浅的正中切口，以避免损伤下方的腹腔脏器。
   3. 用生理盐水浸湿的棉签辅助将胃部外置。将胃置于腹腔切口尾端的生理盐水浸湿纱布垫上，以保持其位置。
   4. 将封装好的应变计网格与环形平滑肌纤维平行对齐。使用先前穿好线的缝线（步骤2.3.1），采用#14锥形尖端3/8圆弧针，将应变计的四个角固定在胃体部腹侧浆膜表面。为尽量减少组织损伤和潜在出血，切勿使用带切割刃的针头，且避免穿刺胃表面的任何表浅血管。
   5. 从胃底/胃体交界处的大弯侧开始缝合测张器，然后沿胃底/胃体交界向小弯侧方向继续缝合。为获得最佳结果，测张器下方的浆膜既不应松弛，也不应过度拉伸。
   6. 使用浸有生理盐水的棉签小心地将胃恢复至解剖位置。
   7. 在急性模型中，于关闭腹部切口前，将应变仪导线从腹正中切口的尾端引出。将裸露的导线固定在动物体上例如., 后肢）以在操作动物或终末导线连接器时提供应变缓解。分别使用3-0尼龙缝线缝合腹直肌和腹部皮肤。在慢性模型中，将导线沿大鼠背部皮下固定，并将其引出于颅骨上方 ¹⁸.
   8. 手术操作后，将动物置于立体定位仪中以固定头部并抬高上躯干。后者有助于减少记录过程中的呼吸伪影。监测直肠温度，并使用反馈控制的加热垫维持在37±1 °C。
   9. 在使用硫丁巴比妥麻醉进行终末实验结束时，必须依据美国兽医协会（AVMA）《安乐死指南》规定的方法对动物实施安乐死。
4. 胃动力记录：
   1. 使用任何市售的直流电桥放大器放大应变片信号。
   2. 使用任何市售数据采集系统的图表记录功能，在计算机上记录直流输出信号。
      注意：可通过多道生理记录仪生成放大器输出的纸质记录。

3. 脑干刺激后胃收缩的代表性测量

1. 暴露脑干和第四脑室
   1. 手术准备完成后，将硫喷妥钠麻醉的动物固定于立体定位仪中，从枕骨向颈部基底部做一条1.5 - 2 cm的正中皮肤切口。
   2. 沿正中线分离覆盖于下方颈部肌肉双侧肌腹之间的结缔组织（由浅至深的肌肉依次为耳上提肌 头段、耳上提肌 尾段和颈阔肌头段）。
   3. 当正中线清晰暴露后，将耳上提肌 长肌从枕骨上剥离。
   4. 通过钝性分离，将颈阔肌与下方的硬脑膜分离，小心暴露颅骨的尾侧区域。
   5. 使用一支新的25 G 针头，沿枕骨大孔向双侧延伸至枕骨髁处，小心剥离硬脑膜。
   6. 使用#5 Dumont镊子去除覆盖在第四脑室上方的软脑膜和蛛网膜，暴露脑干。
2. 向第四脑室给予促甲状腺激素释放激素或静脉注射硝普钠
   1. 称量促甲状腺激素释放激素（TRH），溶于无菌生理盐水中，配制成终浓度为50 µM的TRH溶液。
   2. 称量硝普钠（SNP），溶于无菌生理盐水中，配制成终浓度为150 µM的SNP溶液。
   3. 使用10 µl注射器，向脑干背侧表面的第四脑室给予2 µl TRH（终剂量为100 pmol），以促进胃收缩的记录。
   4. 使用无菌注射器和27 G 针头，通过尾静脉给予150 µmol/kg的SNP，以促进胃舒张的记录。

结果

图 2 展示了使用硫喷妥钠麻醉的大鼠的代表性数据。图 2 上方的曲线显示了在脑干给予促甲状腺激素释放激素（TRH，100 pmol）后大鼠胃体的收缩情况，TRH 是一种已知可增强胃肠运动的肽类物质^{3, 19}。图中可见给药前的基线收缩以及随后胃平滑肌节律性活动的增强。注意：对胃收缩峰的分析采用 Ormsby 和 Bass 原先建立的公式进行²⁰

运动指数 = (N₁×1) + (N₂×2) + (N₃×4) + (N₄×8)

根据该公式，N 等于特定毫克范围内的峰总数。因此，假设 0 mg 信号表示无胃动力活动，则峰间正弦信号可分别按 N₁ 至 N₄ 计算为 25 - 50 mg、60 - 100 mg、110 - 200 mg 以及大于 210 mg 的信号。该公式对数秒或数分钟内自然发生的基线张力波动较不敏感。为了通过...

讨论

本文所述方法可使各个实验室自行制备用于生物学研究的高灵敏度微型应变片，其应用范围包括但不限于小型实验动物的胃肠道运动功能检测。由于此类应变片已不再商业化生产，研究胃肠道功能的实验室只能依赖其他技术手段，而这些手段可能无法完全满足实验所需的全部应用需求。本报告在先前已有技术¹⁵的基础上，提供了更为详尽和更新的描述。正文及配套视频特别针对我们在应变片制备工艺开发与掌握过程中所发现的常见问题，提出了相应的解决方案。

如所述，每个步骤均介绍了成功制备的关键技术。确保所有连接处焊接清洁且牢固，同时避免因焊接过程中热量过大而损坏元件，是实现成功最常见的挑战。细规格导线若未使用热缩管或硅酮环氧树脂进行适当加固，则容易断裂，导致在轻微弯曲应变片时信号丢失。应变片在塑料接线端子基座内的金质连接点附近，若导线断裂或断开，是此前功能正常的应变片最常见的失效形式。可通过移除热缩管，小心拆卸单个应变片，以暴露断裂的导线。将导线重新焊接至金质连接点后，需使用新的热缩管重新组装整个应变片。

经过一些练习，并仔细注意制作尺寸均匀的应变片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
应变片元件	Micro-Measurements（Vishay 产品集团）	EA-06-031-350	线性图案，金属箔，应力分析应变片（需2个）<胃肠道功能障碍仍然是导致发病率和死亡率的主要原因。事实上，胃肠道（GI）在健康与疾病状态下的运动功能研究领域持续产出成果，仅在过去5年中就发表了超过1400项动物研究。目前已开发出多种技术用于量化胃、小肠和结肠的平滑肌活动。体外（in vitro）和离体（ex vivo）技术为胃肠道功能的机制研究提供了有力工具，但这些方法脱离了完整机体所固有的整合系统环境。通常，在活体（in vivo）条件下测量胃部平滑肌收缩的方法包括使用麻醉动物模型，并结合手术植入的压力传感器、施加静态压力负荷（如轻度充气的气球），或通过在压力恒定反馈控制下向胃内注入液体以扩张胃腔。然而，这些方法中的许多在结果解释以及在清醒实验动物模型中进行活体应用方面均存在独特缺点。使用固定于胃肠道浆膜表面的双元件应变计已展现出多种实验优势，其优点可能持续超过其局限性。由于此类应变计目前并未商业化供应，本视频演示将提供当前设计应变计制备的详细逐步操作指南。本方案中描述的应变计专为在大鼠中记录胃部运动功能而设计。该设计亦已修改用于沿整个胃肠道记录平滑肌活动，仅需在整体制造过程中进行细微调整。本文还包含来自整个胃肠道的代表性数据，以及对分析方法、数据解释与呈现方式的讨论。> www.vishaypg.com/micro-measurements/ 或 http://www.vishaypg.com/docs/11070/031ce.pdf
环氧-酚醛粘合剂	M-bond 610	用于粘接应变片元件的通用粘合剂	http://www.vishaypg.com/docs/11024/wirecable.pdf
3芯绝缘导线	336-FTE	细规格柔性通用导线	http://www.vishaypg.com/docs/11024/wirecable.pdf
助焊剂和松香助焊剂套装	FAR-2 M-Flux AR试剂盒	液体焊剂	http://www.vishaypg.com/docs/11023/soldacce.pdf
焊料	361A-20R-25	专为应变片应用优化并推荐使用	http://www.vishaypg.com/docs/11023/soldacce.pdf
金质插孔连接器	PlasticsOne	E363/0	电极基座插座触点 http://www.plastics1.com/PCR/Catalog/Item.php?item=407
电极基座	MS363	固定导线接触点的平台	http://www.plastics1.com/PCR/Catalog/Item.php?item=499
6线电缆	363 带乙烯基插头/滑动连接/6	预制的乙烯基涂层电缆（定制长度），配备与电极基座匹配的插头适配器，以及带镀锡焊片的终端接线端
硅橡胶浇铸化合物	EIS 电气产品	Elan Tron E211	应变片/导线焊点封装介质 http://www.eis-inc.com
HOTweezers	Meisei Corporation	型号 4B	导线绝缘剥线钳 http://www.impexron.us
焊台	Weller（Apex Tool Group）	WES 51	高质量焊料设备<胃肠道功能障碍仍然是导致发病率和死亡率的主要原因。事实上，胃肠道（GI）运动功能在健康与疾病状态下的研究始终是一个富有成果的领域，仅在过去5年中就发表了超过1,400项动物研究。目前已开发出多种技术用于量化胃、小肠和结肠的平滑肌活动。体外（in vitro）和离体（ex vivo）技术为胃肠道功能的机制研究提供了强有力的工具，但这些方法脱离了完整有机体所固有的整合系统。通常，在活体（in vivo）条件下测量胃平滑肌收缩多采用麻醉动物模型，并结合手术植入的压力传感器、施加静态压力负荷（如轻度充气的球囊）或在恒压反馈控制下以液体扩张胃腔。然而，这些方法在结果解释以及应用于清醒实验动物模型的活体研究方面均存在独特局限。将双元件应变片固定于胃肠道浆膜表面的技术已展现出多种实验优势，其优点可能持续超过其缺点。由于此类应变片尚未商业化，本视频演示提供了当前设计应变片制备的详细逐步操作指南。本方案所述应变片专为大鼠胃动力记录而设计，该设计亦已修改用于记录整个胃肠道的平滑肌活动，整体制作过程仅需细微调整。本文还提供了来自整个胃肠道的代表性数据，并讨论了分析方法、数据解释与呈现方式。> http://www.apexhandtools.com/weller/index.cfm
可通过 http://www.eis-inc.com 或 http://www.amazon.com 获取
硅胶片	特瑞堡密封解决方案北伯勒工业生命科学	Pharmelast 20-20	封装应变片元件 10 B Forbes Road Northborough, MA 01532 (800) 634-2000
放大器	Experimetria Ltd	AMP-01-SG	http://experimetria.com/Biological_amplifiers.php