本方案描述了异烟酸与二氨基烷烃通过酰胺偶联反应生成桥联配体的方法，该配体可用于合成多核铂配合物，此类配合物结合了抗癌药物BBR3464和picoplatin的特性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
酰胺偶联反应可用于合成基于联吡啶的配体，作为多核铂类抗癌药物中的桥联连接剂。在惰性气氛下，使用非质子极性溶剂（如无水DMF或DMSO），以异烟酸或其衍生物与不同长度的二氨基烷烃链进行反应，辅以弱碱三乙胺和偶联试剂1-丙基磷酐。产物在形成后可直接从溶液中析出，或通过加水诱导沉淀。如需进一步纯化，可通过热水重结晶获得高纯度配体。利用所得联吡啶配体合成双核铂配合物时，采用反式铂（transplatin）并在热水中进行反应。在对联吡啶配体及最终铂配合物的化学表征中，最具信息价值的技术是1H NMR，尤其需重点分析谱图中的芳香区（7–9 ppm）。这些铂配合物具有作为抗癌药物的应用潜力，且该合成方法可经修饰用于制备三核及其他多核配合物，桥联配体中可引入不同的氢键功能基团。
引言
铂类抗癌药物仍然是治疗人类癌症应用最广泛的药物之一1。尽管这类药物具有显著疗效，但其临床应用受到严重剂量限制性毒副作用的制约2-4。由于可给予患者的剂量有限，也导致肿瘤容易产生耐药性5。因此，研究人员持续开发新型药物以改善不良反应特征并克服获得性耐药，例如菲蒽铂（phenanthriplatin）6 和磷铂（phosphaplatin）7。
20世纪90年代末，一种三核铂类药物被研发出来，即BBR3464（方案 1)8，高达1,000倍 更具细胞毒性 体外 优于一线铂类药物顺铂。BBR3464 还能够在一组人源癌细胞系中克服获得性耐药性9不幸的是，BBR3464 活性的增加伴随着50至100倍的更高毒性，这限制了其应用10-12它在体内也容易降解，意味着很少有药物能完整地到达癌细胞核9.
培可铂（picoplatin）是一种单核铂类药物，含有2-甲基吡啶配体（方案1）13。该药物的甲基可保护其免受生物亲核试剂的攻击，特别是含半胱氨酸和甲硫氨酸的肽或蛋白质14-16。因此，该药物具有较高的稳定性，到达癌细胞核的浓度显著高于BBR3464和顺铂17。由于反应活性降低，培可铂的最大耐受剂量也高于BBR3464和顺铂10,18,19。
因此，本项目旨在结合BBR3464和picoplatin的特性，开发出能够克服获得性耐药性、具有更优生物稳定性且副作用更轻微的新型药物（例如，见 图1）。为此，研究人员合成了以双吡啶桥联配体连接的一系列双核铂配合物20。这些配体通过异烟酸或其衍生物（如2-甲基异烟酸）与不同链长的二氨基烷烃经酰胺偶联反应制备而成。将一摩尔当量的配体与两摩尔当量的反式铂（transplatin）反应，即可得到目标铂配合物（方案1）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 合成 N,N’(烷烃-1,n-二基)二异烟酰胺
- 在烘箱中干燥一个单颈或三颈圆底烧瓶（100 ℃） ºC，1 小时）以确保去除所有水分。
- 加入异烟酸或其衍生物固体以及磁力搅拌子至烧瓶中。如果二氨基烷烃配体在室温下为固体，则加入0.5摩尔 （与异烟酸的摩尔数相等）在此阶段加入烧瓶中。
- 用橡胶隔垫封住烧瓶瓶口，并通过持续通入氮气流或使用充满氮气的气球置换烧瓶中的空气。
- 使用皮下注射针头和注射器，加入无水二甲基甲酰胺或二甲基亚砜（每500 mg异烟酸或2-甲基异烟酸加入4 ml）以溶解固体。若固体不易溶解，可轻轻加热溶液。
- 加入7摩尔当量（相对于所用异烟酸的量）的三乙胺（弱碱）和0.5摩尔当量的二氨基烷烃。如果该溶液在室温下为液体，则加入1.5摩尔当量。
- 加入一摩尔当量的1-丙基膦酸酐（偶联剂），持续搅拌，反应5-12小时至反应完成。
2. 配体的纯化
- 对于使用含有10个或更多亚甲基的二氨基烷烃配体制备的双吡啶配体，随着反应的进行，等待产物从溶液中析出。
- 对于使用二氨基辛烷制备的双吡啶配体，通过加入约40 ml水使产物沉淀。
- 对于使用含有2至6个亚甲基的二氨基烷烃制备的双吡啶配体，加入约40 ml水，并让化合物在1至3天内结晶。
- 通过减压过滤收集每种双吡啶配体，并从每200 mg配体使用约400–500 ml沸水中重结晶。注意：由于较长链的双吡啶配体在水中的溶解度显著降低，因此需要更多的水。
- 向溶液中加入NaOH和KOH（pH 9），以确保化合物在重结晶时为游离碱形式。
3. 双核铂配合物的合成与纯化
- 完全溶解 转二氨二氯合铂(II)，反式铂，于热（70-80 ℃）条件下 ºC) 水（每200 mg反式铂使用150 ml），生成澄清的深黄色溶液。
- 加入0.5摩尔当量的联吡啶配体，加热搅拌至配体完全溶解（溶液澄清）。待溶液变为近乎无色后，关闭加热，在室温下继续搅拌数小时。
- 通过旋转蒸发除去溶剂，得到黄色粉末。
- 通过加入少量温水（约50 °C）溶解，纯化铂配合物。 ºC）。如果仍有黄色或白色固体残留，则需过滤除去。
- 向溶液中加入丙酮，直至形成白色沉淀，该沉淀呈金属配合物的聚合物形态，约占反应产物的10%。继续加入丙酮（约额外20–30 ml），直至不再有沉淀生成。注意：此白色沉淀为杂质。
- 通过尼龙滤纸（0.2 μm）过滤内容物以去除该沉淀 µm孔径）并旋转蒸发剩余溶液至干燥，即可得到纯化产物。注意：如有必要，可重复进行丙酮沉淀步骤，直至复合物完全纯化。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
双吡啶配体及其相应的双核铂配合物通过1H、13C和195Pt核磁共振（表1和2）以及电喷雾电离质谱进行表征。准确的熔点可通过差示扫描量热法测定，而纯度最好通过元素分析测定碳、氢、氮的百分含量来确定。其中最有用的是1H核磁共振，因其操作快速简便，可在最终产物分离后数分钟内获得结果，其共振信号可明确证实酰胺偶联和铂配位的成功实现（表1和2）。
异烟酸在核磁共振氢谱中有三个信号：芳香区（7 至 9 ppm）出现两个双峰，羧酸质子在约 13 ppm 处呈现一个非常宽的信号。二氨基烷烃的质子信号均位于 1 至 4 ppm 的脂肪族区域。随着二氨基烷烃链长度的增加，许多亚甲基质子信号变得等价，因此在脂肪族区域观察到的峰数少于预期；尽管如此，这些信号的强度显著增强，可通过积分值大致归属（表 1 和 表 2）。例如，参见 图 1...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本研究中，合成了双核铂配合物作为潜在的抗癌药物。通过异烟酸与不同链长的二氨基烷烃发生酰胺偶联反应，制备了双吡啶桥联配体。此前已有文献报道含2至8个亚甲基的双吡啶配体及其甲基类似物及其相应铂配合物的合成。本文改进了双吡啶配体的合成与纯化方法，使其更加快速且成本更低，并通过合成含8、10和12个亚甲基的双吡啶配体验证了该方法的有效性（其中含八个亚甲基的最短配体biao用于将新纯化方法与旧方法进行比较）。此外，还利用这些配体合成了双核铂配合物。
双吡啶配体的合成在无水溶剂中进行，并在惰性氮气氛围下使用三乙胺作为弱碱，丙基膦酸酐作为偶联剂。可使用DMF或DMSO作为溶剂，但异烟酸在DMSO中的溶解性优于在DMF中的溶解性。对于任一种溶剂，均可通过在流动的热水下温和加热以促进溶解。
这种传统方法需要较长的反应时间（数天）以及多步纯化过程，包括使用乙醚进行液/液萃取和用NaHCO3中和，而这些步骤如今已被消除。配体的合成反应现在只需将所有反应物一次性加入，在室温下数小时内即可完成。双吡啶配体在加入水后从溶液中析出（...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-二氨基辛烷 | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-二氨基癸烷 | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-二氨基十二烷 | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| 异烟酸 | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-丙基膦酸酐溶液 | Aldrich | 431303 | 乙酸乙酯中含量为50 wt% |
| 反式-二氨基二氯合铂(II) | Aldrich | P1525 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%，无水 |
| N,N’-二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%，无水 |
| 三乙胺 | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| 尼龙滤膜 | Whatman | 7402-004 | 孔径，0.2 µm |
| 磁力搅拌加热板 | |||
| 磁力搅拌子 | |||
| 圆底烧瓶或三颈烧瓶 | |||
| 适用于所选圆底烧瓶或三颈烧瓶的足够尺寸的橡胶隔垫 | |||
| 5 ml 注射器 | |||
| 注射针头 | |||
| 橡胶气球 | |||
| 橡皮筋 | |||
| 氮气（N2）气源 | |||
| 旋转蒸发仪 | |||
| 干燥烘箱 | |||
| 核磁管 | |||
| 核磁共振波谱仪 | |||
| 500 ml 烧杯 | |||
| 玻璃或塑料移液管 |
参考文献
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31, 1869-1883 (2012).
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
