一种用于表征巴雷特食管细胞的免疫荧光方法

摘要

目前迫切需要加强对巴雷特食管分子驱动因素的深入了解。免疫荧光染色是一种用于研究细胞信号传导对细胞形态影响的有效技术。本文介绍了一种简单而有效的实验方案，利用免疫荧光染色方法评估针对巴雷特食管细胞的治疗干预效果。

摘要

食管腺癌（EAC）的总体生存率低于17%，且在过去二十年中，EAC的发病率显著上升。EAC的主要风险因素之一是巴雷特食管（BE），这是一种因长期胃灼热导致正常鳞状上皮发生化生性改变的病变。尽管EAC与BE之间的关联已明确，但对其中的分子事件，特别是涉及BE向EAC进展的信号通路改变，仍知之甚少。这在很大程度上是由于缺乏适用于研究这些疾病的有效体外模型。近年来，永生化BE细胞系已实现商业化，使得对BE进行体外研究成为可能。本文介绍一种对永生化BE细胞系进行免疫荧光染色的方法，可用于在治疗性化合物处理后，对细胞信号传导和细胞结构进行体外表征。这些技术的应用将有助于深入理解BE向EAC进展的机制，并为EAC的治疗和预防提供潜在途径。

引言

Barrett食管（BE）是指食管正常的鳞状上皮发生化生性改变，通常由胃食管反流病（GERD）导致食管长期暴露于胃内容物所引起¹。目前认为BE是机体对GERD的一种保护性反应，但BE的存在会显著增加食管腺癌（EAC）的发病风险，而EAC的生存率极低¹。目前估计，高达5.6%的美国人口患有BE，但由于BE常无明显症状，多数病例可能尚未被诊断²。鉴于GERD和EAC的发病率持续上升³，深入理解BE向EAC进展过程中所涉及的分子机制显得尤为重要，因为这些信息有望为阻止BE向EAC进展提供潜在的治疗策略。

患者导向的研究确立了目前关于巴雷特食管-食管腺癌（BE-EAC）发病机制的范式¹。长期暴露于胃内容物所导致的慢性炎症、损伤和基因毒性损害，对巴雷特食管病变施加了选择性压力，促进其向食管腺癌（EAC）的肿瘤性进展。在巴雷特食管向食管腺癌发展的过程中，已鉴定出多种遗传学改变。然而，尽管如此，人们对细胞信号传导的确切变化及其对细胞结构与功能的后续影响仍缺乏明确理解。

永生化 体外 细胞系是研究细胞信号传导效应的有用工具，尤其适用于研究靶向治疗化合物的作用。近年来，永生化BE细胞系的商业化供应使得此类研究成为可能。尽管高通量检测方法（如广泛使用的细胞活力检测）在评估靶向治疗对细胞增殖和存活的影响方面具有重要价值^4-6然而，这些检测方法无法用于研究细胞信号传导对细胞形态的影响。免疫荧光染色（IF）是一种有效的技术，可用于研究靶向治疗对细胞形态学、生长特性、存活特征及相关蛋白的影响。本实验室已将这些方法应用于永生化BE细胞系，通过免疫荧光染色评估一种临床可用药物对BE细胞系的作用，旨在阐明潜在的化学预防治疗方案及药物治疗的生物标志物。⁷类似地，这些技术在食管腺癌（EAC）、巴雷特食管（BE）及永生化食管细胞系中的应用，已阐明了巴雷特食管向食管腺癌进展过程中的关键发现^8-10我们发现，对经靶向治疗处理的BE细胞进行免疫荧光（IF）分析具有重要价值，可实现对细胞结构及蛋白质定位变化的表征。本文中，我们介绍了针对永生化BE细胞进行免疫荧光分析的方法，用于表征药物处理效应。

方案

1. 细胞系的维持

1. 通过稳定转染人端粒酶逆转录酶（TERT）蛋白，建立永生化的人类巴雷特食管高级别异型增生（CP-B、CP-C、CP-D）和化生（CP-A）细胞系¹¹。
2. 将巴雷特食管细胞系培养于添加了牛垂体提取物（BPE）、表皮生长因子（EGF）、5% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）、青霉素-链霉素-新霉素（PSN）的角质形成细胞培养基中，并置于标准组织培养条件下（37 °C、5% CO₂、98% 湿度）维持培养。

2. BE 细胞接种

1. 12孔板/盖玻片的准备。将18 mm盖玻片放入玻璃培养皿中，进行高压灭菌。使用连接真空管的无菌玻璃移液管，将灭菌后的18 mm玻璃盖玻片转移至12孔组织培养板中。用无菌PBS和培养基清洗盖玻片。
2. 消化并计数永生化BE细胞。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将细胞用培养基稀释至浓度为20,000–40,000 个细胞/mL。
3. 向每个含有盖玻片的孔中加入1 mL细胞悬液，使每孔总细胞数为20,000–40,000 个细胞。
4. 使用无菌移液枪头轻轻将盖玻片推至孔底，以确保细胞能够贴附于盖玻片表面。

3. BE 细胞的药物处理

1. 将选定的药物溶于预热（37 °C）的培养基中，配制成所需浓度，并通过反复倒置试管或使用涡旋混合器充分混匀。药物浓度需通过实验经验确定。在支气管上皮（BE）细胞接种后24小时开始处理，以确保细胞已贴附于盖玻片上。
2. 作为对照和比较，另取一组BE细胞盖玻片，用含0.1%溶剂（如二甲基亚砜[DMSO]或其他用于溶解化合物的试剂）的培养基处理。使用实验室记号笔标记培养板，以区分药物处理组和溶剂对照组。将细胞置于设定为37 °C、5% CO₂、98%湿度的细胞培养箱中，孵育至预定时间点。

4. 免疫荧光染色

1. 固定
   1. 在药物处理达到预期孵育时间后，吸除培养基，并在室温（RT，25 °C）下用1×磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤盖玻片。
   2. 吸除 PBS，每孔加入 1 ml 含 4% PFA 的 PBS [4% PFA/PBS]，室温孵育 30 分钟。
   3. 吸去4% PFA/PBS，用PBS在室温下洗涤盖玻片3次，每次5分钟。如需保存，可将盖玻片置于含0.1% PFA的PBS中，4 °C保存一周。
2. 透化/封闭
   透化经PFA固定的细胞，以使抗体能够进入细胞内靶标。对于细胞表面外在蛋白，执行后续所有步骤 无 将皂苷加入1x PBS/0.5% BSA溶液中。
   1. 通过用 50 mM NH₄Cl 孵育以减少背景₄用 PBS 稀释的 Cl 在室温下孵育 10 分钟，然后用室温 PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。
   2. 将BE细胞在含有0.1%皂苷和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的100–300 μl PBS中孵育30分钟。皂苷用去离子水配制成10%储备液，经滤膜除菌后于4 °C保存，使用时按需稀释。
   注意：通过添加0.5% BSA封闭盖玻片，可防止抗体与细胞蛋白发生非特异性结合。也可用5%稀释的驴血清替代BSA，以减少抗体的非特异性结合。
3. 人眼前房的制备
   1. 用湿润的纸巾铺满方形生物测定皿的底部，并在上方覆盖一层Parafilm。
   2. 使用镊子和注射器针头，将盖玻片（细胞面朝上）轻轻转移至Parafilm上。
   3. 用记号笔在Parafilm上标记以识别盖玻片。
4. 一抗孵育
   1. 用含有0.5% BSA和0.1%皂苷的PBS稀释一抗。
   2. 轻轻用实验室纸巾吸去封闭液，加入100 μl一抗溶液。将一抗在BE细胞上于4 °C孵育过夜。
5. 二抗孵育
   1. 用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液在室温下洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
   2. 用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液稀释与荧光标记物偶联的二抗，该二抗需识别一抗所来源的物种。
   3. 向每个盖玻片中加入100 μl稀释的抗体。室温下孵育二抗2小时。
6. 盖玻片的清洗与封片
   1. 用 PBS/0.5% BSA/0.1% 皂苷溶液洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次。移除洗涤液后，向盖玻片加入 100–300 μl PBS。
      注意：对于双重抗体染色，根据讨论部分所述信息，使用所需的另一种一抗和二抗重复步骤 4.4–4.5。
   2. 用镊子轻轻抬起盖玻片，用实验室纸巾或餐巾纸吸去PBS。
   3. 加入15 μl 含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的合适抗荧光淬灭封片剂至盖玻片上，将盖玻片细胞面朝下倒置贴附于玻璃显微镜载片上。
   4. 将载玻片放入载玻片盒中，置于室温避光处孵育过夜，使硬固型抗荧光淬灭剂充分固化，具体操作按照生产商说明书进行。待抗荧光淬灭剂完全固化后，载玻片可保存于4 °C或-20 °C，直至进行显微镜观察。

5. 盖玻片的显微观察

染色后的细胞可通过共聚焦显微镜或具备免疫荧光成像能力的正置显微镜进行观察。尽管共聚焦显微镜可在特定焦平面上提供高分辨率图像，但正置显微镜能够更快地获得具有实用价值的图像。为简洁起见，本文介绍一种使用常规显微镜观察染色BE细胞的方法。通常情况下，观察异硫氰酸荧光素（FITC）或类似荧光染料（例如绿色荧光蛋白）、Texas Red 和 DAPI，需要配备能够区分这些荧光染料的滤光片的显微镜。在开始实验前应检查显微镜，以确定其兼容的荧光染料类型。

1. 在标准免疫荧光显微镜上成像
   1. 从 -20 °C 或 4 °C 取出保存的载玻片/盖玻片，使其升至室温。打开显微镜和汞弧灯电源。
   2. 将盖玻片朝向物镜的显微镜载玻片放置于显微镜载物台上。若使用油浸物镜，需在盖玻片上滴加一滴浸油。
   3. 选择 DAPI 滤光片并打开快门。
   4. 通过目镜观察并调节物镜焦距，直至图像清晰。由于所有细胞均会被 DAPI 染色，细胞核应易于观察。
   5. 使用相应的图像处理软件采集图像。

结果

应用所述实验步骤所获得结果的一个示例如图1A-D所示。将含有CP-D和CP-C型BE细胞的盖玻片分别用1 μM Src家族抑制剂SKI-606或溶剂（DMSO）处理24小时，并按照上述方法对黏附连接和Wnt信号通路蛋白β-catenin进行染色。通过使用偶联绿色荧光染料的抗兔IgG抗体标记实现β-catenin的可视化，而细胞核则通过DAPI（蓝色）染色进行标记。盖玻片使用硬封固剂封片后，采用63X/1.4N平场复消色差物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。所选绿色荧光染料在488 nm波长激发，并通过505–525 nm发射滤光片进行检测。同样，DAPI在405 nm激发，发射光通过410–460 nm滤光片收集。酪氨酸激酶Src的活性在BE中升高，尤其在高级别异型增生中更为显著¹²。与结直肠癌和前列腺癌细胞中的观察结果一致^13-15，抑制Src可导致β-catenin从细胞质/细胞核（箭头，图1A、1C和1E）重新定位至细胞膜（箭头头，图1B、1D和

讨论

我们已概述了一种将BE细胞免疫荧光（IF）技术应用于阐明靶向治疗对这些细胞生理效应的方法。尽管本文描述的是该方法在BE细胞中的应用，但我们发现这些技术同样适用于多种不同类型的细胞^13,17,18。此外，这些实验步骤可通过多种方式进行调整，以优化针对特定靶标的染色效果。

我们发现一个直接影响免疫荧光（IF）效果的关键参数是固定剂的选择。上述实验步骤中我们描述了使用4% PFA/PBS进行固定，但其他固定剂也可适用。用PBS洗涤后，采用冷甲醇（-20 °C）固定20分钟，适用于某些蛋白/抗体¹³。使用冷甲醇固定可避免后续细胞通透步骤。然而，固定剂（4% PFA/PBS或冷甲醇）的选择必须通过实验经验确定。

上述步骤描述了单一蛋白质的可视化方法；然而，该方法可轻松扩展用于另一靶标的鉴定¹³为实现两种蛋白质的最佳免疫荧光染色，应使用来自两种不同物种的初级抗体（例如， 一种在兔体内制备，另一种在小鼠体内制备），并使用可特异性识别各物种且偶联不同荧光染料的二抗。偶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CP-A（化生细胞系）	ATCC	CRL-4027
CP-B（高级别异型增生细胞系）	ATCC	CRL-4028
CP-C（高级别异型增生细胞系）	ATCC	CRL-4029
CP-D（高级别异型增生细胞系）	ATCC	CRL-4030
角质形成细胞-SFM（1倍，液体）	Life Technologies	17005-042
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1倍），含酚红	Life Technologies	25200056
胎牛血清，经鉴定，热灭活	Life Technologies	10438026
PSN 抗生素混合液	Life Technologies	15640
PBS - 磷酸盐缓冲盐水	Life Technologies	10010049
含 DAPI 的 Pro-long Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36931
圆形玻璃盖玻片 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-连环蛋白一抗（兔源）	Cell Signaling	9562S
Alexa Fluor 488（山羊抗兔）	Life Technologies	A11008
10 cm 细胞培养处理的聚苯乙烯培养皿，无菌	USA Scientific	CC7682-3394
12 孔细胞培养处理的聚苯乙烯培养板，无菌	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
氯化铵	Sigma-Aldrich	A9434
皂苷	Sigma-Aldrich	47036
牛血清白蛋白 - 第五组分	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606（博舒替尼）	Selleck Chemicals	S1014
方形生物测定培养皿	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
一次性巴斯德吸管，燧石玻璃	VWR	14672-380
Nexcelom Mini 细胞计数仪	Nexcelom
Cellometer 细胞计数板	Nexcelom	CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome 显微镜	Zeiss