目前迫切需要加强对巴雷特食管分子驱动因素的深入了解。免疫荧光染色是一种用于研究细胞信号传导对细胞形态影响的有效技术。本文介绍了一种简单而有效的实验方案，利用免疫荧光染色方法评估针对巴雷特食管细胞的治疗干预效果。
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本文内容
摘要
摘要
食管腺癌（EAC）的总体生存率低于17%，且在过去二十年中，EAC的发病率显著上升。EAC的主要风险因素之一是巴雷特食管（BE），这是一种因长期胃灼热导致正常鳞状上皮发生化生性改变的病变。尽管EAC与BE之间的关联已明确，但对其中的分子事件，特别是涉及BE向EAC进展的信号通路改变，仍知之甚少。这在很大程度上是由于缺乏适用于研究这些疾病的有效体外模型。近年来，永生化BE细胞系已实现商业化，使得对BE进行体外研究成为可能。本文介绍一种对永生化BE细胞系进行免疫荧光染色的方法，可用于在治疗性化合物处理后，对细胞信号传导和细胞结构进行体外表征。这些技术的应用将有助于深入理解BE向EAC进展的机制，并为EAC的治疗和预防提供潜在途径。
引言
Barrett食管（BE）是指食管正常的鳞状上皮发生化生性改变，通常由胃食管反流病（GERD）导致食管长期暴露于胃内容物所引起1。目前认为BE是机体对GERD的一种保护性反应，但BE的存在会显著增加食管腺癌（EAC）的发病风险，而EAC的生存率极低1。目前估计，高达5.6%的美国人口患有BE，但由于BE常无明显症状，多数病例可能尚未被诊断2。鉴于GERD和EAC的发病率持续上升3，深入理解BE向EAC进展过程中所涉及的分子机制显得尤为重要，因为这些信息有望为阻止BE向EAC进展提供潜在的治疗策略。
患者导向的研究确立了目前关于巴雷特食管-食管腺癌（BE-EAC）发病机制的范式1。长期暴露于胃内容物所导致的慢性炎症、损伤和基因毒性损害，对巴雷特食管病变施加了选择性压力，促进其向食管腺癌（EAC）的肿瘤性进展。在巴雷特食管向食管腺癌发展的过程中，已鉴定出多种遗传学改变。然而，尽管如此，人们对细胞信号传导的确切变化及其对细胞结构与功能的后续影响仍缺乏明确理解。
永生化 体外 细胞系是研究细胞信号传导效应的有用工具，尤其适用于研究靶向治疗化合物的作用。近年来，永生化BE细胞系的商业化供应使得此类研究成为可能。尽管高通量检测方法（如广泛使用的细胞活力检测）在评估靶向治疗对细胞增殖和存活的影响方面具有重要价....
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方案
1. 细胞系的维持
- 通过稳定转染人端粒酶逆转录酶（TERT）蛋白，建立永生化的人类巴雷特食管高级别异型增生（CP-B、CP-C、CP-D）和化生（CP-A）细胞系11。
- 将巴雷特食管细胞系培养于添加了牛垂体提取物（BPE）、表皮生长因子（EGF）、5% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）、青霉素-链霉素-新霉素（PSN）的角质形成细胞培养基中，并置于标准组织培养条件下（37 °C、5% CO2、98% 湿度）维持培养。
2. BE 细胞接种
- 12孔板/盖玻片的准备。将18 mm盖玻片放入玻璃培养皿中，进行高压灭菌。使用连接真空管的无菌玻璃移液管，将灭菌后的18 mm玻璃盖玻片转移至12孔组织培养板中。用无菌PBS和培养基清洗盖玻片。
- 消化并计数永生化BE细胞。使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将细胞用培养基稀释至浓度为20,000–40,000 个细胞/mL。
- 向每个含有盖玻片的孔中加入1 mL细胞悬液，使每孔总细胞数为20,000–40,000 个细胞。
- 使用无菌移液枪头轻轻将盖玻片推至孔底，以确保细胞能够贴附于盖玻片表面。
3. BE 细胞的药物处理
- 将选定的药物溶于预热（3....
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结果
应用所述实验步骤所获得结果的一个示例如图1A-D所示。将含有CP-D和CP-C型BE细胞的盖玻片分别用1 μM Src家族抑制剂SKI-606或溶剂（DMSO）处理24小时，并按照上述方法对黏附连接和Wnt信号通路蛋白β-catenin进行染色。通过使用偶联绿色荧光染料的抗兔IgG抗体标记实现β-catenin的可视化，而细胞核则通过DAPI（蓝色）染色进行标记。盖玻片使用硬封固剂封片后，采用配备63X/1.4N平场复消色差物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。所选绿色荧光染料在488 nm激发，并通过505–525 nm发射滤光片进行检测；同样，DAPI在405 nm激发，发射光通过410–460 nm滤光片收集。酪氨酸激酶Src的活性在BE细胞中升高，尤其在高级别异型增生中更为显著12。与结直肠癌和前列腺癌细胞中的观察结果一致13-15，抑制Src活性可导致β-catenin从细胞质/细胞核（箭头，图1A、1C和1E）重新定位至细胞膜（箭头头，图1B、1D和.......
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讨论
我们已概述了一种将BE细胞免疫荧光（IF）技术应用于阐明靶向治疗对这些细胞生理效应的方法。尽管本文描述的是该方法在BE细胞中的应用，但我们发现这些技术同样适用于多种不同类型的细胞13,17,18。此外，这些实验步骤可通过多种方式进行调整，以优化针对特定靶标的染色效果。
我们发现一个直接影响免疫荧光（IF）效果的关键参数是固定剂的选择。上述实验步骤中我们描述了使用4% PFA/PBS进行固定，但其他固定剂也可适用。用PBS洗涤后，采用冷甲醇（-20 °C）固定20分钟，适用于某些蛋白/抗体13。使用冷甲醇固定可避免后续细胞通透步骤。然而，固定剂（4% PFA/PBS或冷甲醇）的选择必须通过实验经验确定。
上述步骤描述了单一蛋白质的可视化方法；然而，该方法可轻松扩展用于另一靶标的鉴定13为实现两种蛋白质的最佳免疫荧光染色，应使用来自两种不同物种的初级抗体（例如， 一种在兔体内制备，另一种在小鼠体内制备），并使用可特异性识别各物种且偶联不同荧光染料的二抗。偶.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本工作获得了圣约瑟夫基金会（AJF，LJI）和美国肺脏协会（RG-224607-N，LJI）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CP-A（化生细胞系） | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B（高级别异型增生细胞系） | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C（高级别异型增生细胞系） | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D（高级别异型增生细胞系） | ATCC | CRL-4030 | |
| 角质形成细胞-SFM（1倍，液体） | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1倍），含酚红 | Life Technologies | 25200056 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN 抗生素混合液 | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - 磷酸盐缓冲盐水 | Life Technologies | 10010049 | |
| 含 DAPI 的 Pro-long Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Life Technologies | P36931 | |
| 圆形玻璃盖玻片 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-连环蛋白一抗（兔源） | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488（山羊抗兔） | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm 细胞培养处理的聚苯乙烯培养皿，无菌 | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12 孔细胞培养处理的聚苯乙烯培养板，无菌 | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| 牛血清白蛋白 - 第五组分 | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606（博舒替尼） | Selleck Chemicals | S1014 | |
| 方形生物测定培养皿 | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| 一次性巴斯德吸管，燧石玻璃 | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini 细胞计数仪 | Nexcelom | ||
| Cellometer 细胞计数板 | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome 显微镜 | Zeiss |
参考文献
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.
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重印与许可
