方法文章

乳胶凝集法对Streptococcus pneumoniae进行荚膜血清型鉴定

24K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/51747

⸱

2014年9月25日

 ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

本文内容

摘要

乳胶凝集试验是一种简单、快速且经济的血清学分型方法 肺炎链球菌，并已广泛应用于诊断微生物学。本文描述了乳胶凝集试剂的自制方法、质量控制程序以及该技术在肺炎链球菌血清型鉴定中的应用。

摘要

乳胶凝集试剂广泛应用于微生物的诊断、鉴定和血清分型。Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）是全球范围内导致发病和死亡的重要病原体。目前的疫苗主要针对肺炎链球菌的荚膜，已知荚膜血清型超过90种。因此，对肺炎链球菌分离株进行血清分型对于评估疫苗接种计划的效果以及流行病学研究具有重要意义。世界卫生组织推荐乳胶凝集法作为“金标准”奎ellung试验之外的替代方法用于肺炎链球菌的血清分型。乳胶凝集法是一种相对简单、快速且成本较低的方法，因此既适用于资源有限的地区，也适用于高通量检测的实验室。乳胶凝集试剂可通过购买商业来源的抗体并将其被动吸附至乳胶颗粒上，在实验室内部自行制备。本文描述了乳胶凝集试剂的制备及质量控制方法，并详细介绍了高效、节省时间和成本的逐级检测流程。

该生产与质量控制方法也可能适用于其他检测目的。

引言

Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）是全球五岁以下儿童发病和死亡的主要原因，尤其在资源匮乏地区更为严重1,2。肺炎链球菌感染的临床表现从局部感染到危及生命的疾病不等，例如肺炎、败血症和脑膜炎1,2。

根据肺炎链球菌荚膜多糖的差异，已鉴定出超过90种血清型3。目前的疫苗以荚膜多糖为靶点，可预防由主要致病血清型引起的侵袭性疾病4。对分离的肺炎链球菌进行血清分型，对于评估疫苗接种对定植和疾病的影响以及获取更广泛的流行病学信息具有重要意义5,6。目前肺炎链球菌血清分型的“金标准”方法是荚膜肿胀试验（Quellung试验），但该方法耗时较长，且操作需要一定技术经验7。乳胶凝集试验是世界卫生组织推荐的另一种血清分型方法7。乳胶凝集试验操作快速简便，已被全球许多实验室采用8-11。重要的是，乳胶凝集试验在肺炎链球菌血清分型中的准确性与荚膜肿胀试验相当10,12-14。总体而言，该方法既适用于资源有限的地区，也适用于高通量检测实验室。

乳胶凝集试剂（“乳胶试剂”）是通过将抗体连接到乳胶颗粒上而制备的15。在阳性反应中，这些标记的颗粒在特异性抗原存在时发生凝集。商业化的乳胶试剂仅适用于有限范围的血清型。乳胶试剂也可使用市售抗血清在实验室内部自行制备10。可用于进一步界定组内血清型的试剂包括抗血清混合物（“混合抗血清”）、针对肺炎链球菌血清群（例如，19群）、单个血清型（例如，5型）以及针对特定抗原（“因子”，例如，识别19A型的19c因子）的特异性抗血清16。

本文概述了利用市售抗血清被动吸附到乳胶颗粒上制备乳胶试剂的主要步骤。文中描述了该方法的质量控制（QC）要点，并包含了用于肺炎链球菌血清型鉴定的乳胶试剂使用方案。

方案

1. 自制乳胶试剂的制备

  1. 甘氨酸缓冲盐水（GBS）的制备
    1. 将1.5 g甘氨酸、11.7 g氯化钠和100 ml蒸馏水加入200 ml玻璃烧杯中。
    2. 使用磁力搅拌器混合至溶解。
    3. 将混合物转移至500 ml量筒中，并加入蒸馏水定容至200 ml。
    4. 将溶液转移回200 ml烧杯中，检测pH值，并用5 M氢氧化钠调节至8.2。注意：氢氧化钠具有腐蚀性，需佩戴个人防护装备。
    5. 使用0.22 µm滤器和多个60 ml注射器将溶液过滤除菌，收集至一个预先灭菌的250 ml螺口玻璃瓶中。
    6. 室温保存。
  2. 含0.2%牛血清白蛋白的GBS制备
    1. 将0.2 g牛血清白蛋白（BSA）粉末和100 ml GBS加入200 ml玻璃烧杯中，使用磁力搅拌器搅拌至溶解。
    2. 使用数个60 ml注射器，将溶液经0.22 µM滤器过滤除菌，收集至一个预先灭菌的250 ml螺口玻璃瓶中。
    3. 4 °C 下保存。
  3. 乳胶试剂制备
    1. 标记一个 2 ml 圆底微量离心管。
      注意：使用圆底管以尽量减少颗粒沉降，因为沉降可能影响抗体结合。
    2. 使用带无菌吸头的P1000移液器，向微量离心管中加入975 µl GBS，然后加入25 µl用于制备待用乳胶试剂的相应肺炎链球菌抗血清（即， 倒置混匀五次。
    3. 将120 µl的聚苯乙烯乳胶颗粒加入1,080 µl无菌生理盐水中，按1:10比例稀释乳胶颗粒。
      注意：可以制备更大体积，但每次制备乳胶试剂时均应新鲜配制。
    4. 将1,000 µl 1:10的乳胶悬液（步骤1.3.3中配制）加入1,000 µl 1:40的抗血清悬液（步骤1.3.2中配制）中，颠倒混匀5次。
    5. 在37 °C下于缓慢旋转的转轮上孵育（例如， 4 rpm（直径38.5 cm的转轮）持续2小时。
    6. 离心15分钟，1,100 × g。弃去上清液，将沉淀物在2 ml无菌生理盐水中轻轻重悬。
    7. 离心15分钟，1,100 × g。弃去上清液，加入1 ml GBS，轻轻重悬沉淀。
    8. 将乳胶悬浮液移液至已标记的5 ml螺口管中。再加入1 ml GBS。
    9. 加入2 ml含0.2% BSA（w/v）（pH 8.2）的GBS（于步骤1.2中配制）。加入40 µl 10%（w/v）叠氮化钠溶液作为防腐剂。
      注意：叠氮化钠若被吸入具有危害性，且对皮肤和眼睛有刺激性。建议购买预先配制的10%溶液，而非粉末形式，以最大限度降低吸入暴露的风险。操作该试剂时应佩戴个人防护装备（包括手套和防溅护目镜）。具体信息请参阅材料安全数据表。
    10. 将乳胶试剂在 4 °C 下储存。
  4. 阴性对照乳胶试剂的制备
    1. 标记一个 2 ml 的圆底微量离心管。
      注意：使用圆底管以尽量减少颗粒沉降，因为沉降可能影响抗体结合。
    2. 使用带无菌吸头的P1000移液器，向微量离心管中加入975 µl GBS，然后加入25 µl正常兔抗血清。颠倒混匀5次。
    3. 按照上述步骤 1.3.3 至 1.3.10 进行操作

2. 乳胶试剂的质量控制（QC）

  1. 将乳胶试剂置于室温。使用前立即轻轻混匀，通过反复倒置试管数次。
  2. 取15 µl试剂用移液器滴加至载玻片上，按照下文步骤4.7和4.8操作，检查试剂是否存在自凝集。乳胶颗粒不应出现凝集现象，试剂应呈现均匀光滑的白色悬液。
  3. 使用一组低传代肺炎链球菌分离株检测试剂。采用按步骤3制备的新鲜培养物进行测试。该组分离株应包括“目标”血清型（待测试剂对应的特定血清型）和“非目标”血清型（其他不应与该试剂发生交叉反应的血清型）。每种待质检的乳胶试剂均应至少包含每种目标和非目标血清型的一个分离株；若仅有一种目标或非目标血清型，则应测试该血清型的两个不同分离株。
    注意：测试菌株组合应包含每种血清型的多个分离株，其中部分应为侵袭性疾病中较少见和/或菌种保藏中心的类型菌株。建议纳入部分携带菌株，因其通常更难分型（数据未显示），这有助于进一步验证试剂的分型能力，确保试剂对侵袭性和携带性分离株均具备可靠的血清分型性能。
  4. 按照下文步骤3和4所述方法，使用目标和非目标肺炎链球菌分离株对乳胶试剂进行测试。
  5. 在试剂生产时进行质量控制，并在此后至少每年重复一次质量检测。
    注意：若试剂未通过质量控制，则该批次必须废弃，并重新制备。若反复出现质量控制失败，建议采用Ortika et al., 20138及下文讨论中描述的替代方法制备试剂。

3. 肺炎链球菌培养物的血清型鉴定前准备

  1. 使用无菌接种环挑取一株肺炎链球菌的单个菌落 在固体非选择性血琼脂平板上划线接种，使初始接种物覆盖平板表面约三分之一，分区划线以获得单个菌落。
    注意：使用去纤维蛋白的马或羊血制备的平板适用；但使用人血或枸橼酸抗凝的动物血制备的血平板不适用。
  2. 过夜孵育平板 在37 °C、5% CO₂气氛中2.
  3. 观察平板上的菌落生长情况以确认纯度，并评估菌落生长量是否足以进行血清型鉴定。
    注意：肺炎链球菌分离株的血清分型需要纯培养物。根据我们的经验，菌落融合或接近融合、覆盖平板表面约三分之一的生长量通常足以完成血清分型。由于肺炎链球菌培养物可能发生自溶，用于血清分型的培养物应在传代后24小时内进行检测。在开始血清分型前，培养平板从培养箱中取出的时间不应超过15至20分钟。

4. 进行乳胶凝集血清分型

  1. 从冰箱中取出所有乳胶试剂，室温放置约30分钟使其升至室温。使用前立即轻轻翻转试管以混匀试剂。
  2. 标记一张显微镜载玻片。
  3. 在显微镜载玻片上加入15 µl阴性对照乳胶试剂。
  4. 使用无菌一次性1 µl接种环，取一环肺炎链球菌培养物，使接种环约半满。
  5. 将接种物轻轻涂抹在载玻片表面，靠近阴性对照乳胶试剂液滴处。接种物应在玻片上可见。
  6. 用接种环迅速而充分地将接种物与阴性对照乳胶试剂混合，确保液滴不超出其初始大小。
  7. 拿起载玻片，双手握住两端，前后轻轻摇动1分钟。注意保持液体缓慢移动，并确保液滴大小不增加。
    注：也可使用平板摇床。
  8. 在黑色背景下肉眼观察是否有宏观凝集（i.e., 肉眼可见）以及悬液是否变澄清。
  9. 若阴性对照乳胶试剂未出现凝集或澄清，则继续进行培养物检测，将上述步骤4.1至4.8中的测试乳胶试剂替换为阴性对照乳胶试剂。每次必须使用新的接种环。随后开始依次测试乳胶试剂，首先测试各“组”（pool）试剂。
  10. 依次测试每种“组”乳胶试剂，直至获得阳性结果。
    注：可根据当地特定血清型的流行情况，分“轮次”进行组试剂的测试（e.g., 在第一张载玻片上测试最可能的三个组；若无阳性反应，则在第二张载玻片上测试剩余组中最可能的三个组，依此类推，直至获得阳性反应）。此方法可优先检测最常见血清型，从而减少所需时间和试剂用量。
  11. 根据抗血清生产商提供的对照表，确定阳性组中包含的各个单独抗血清。
  12. 如上述步骤4.1至4.8所述，分别测试阳性组中包含的每个组别或类型，以确定具体的“组”或“型”。
  13. 参照抗血清生产商提供的对照表判定结果。若已确定具体“型”（e.g., 5型），则无需进一步检测，记录该结果。
  14. 若仅确定“组”（e.g., 19组），则查阅生产商对照表以确定需检测的因素。继续使用单独的“因子”乳胶试剂进行测试，最终确定血清型（e.g., 19B型）。

结果

当连接在乳胶颗粒上的型特异性抗体与肺炎链球菌的荚膜结合后，会发生阳性乳胶凝集反应，并随之出现标记抗体颗粒的凝集现象15。图1A显示了一种阳性反应，其特征是可见明显的凝集现象，同时背景悬液变得澄清。阴性反应的特征是乳胶凝集试剂悬液保持均匀细腻且呈白色（图1B）。试剂已优化至应在1分钟时间间隔结束前观察到阳性反应（通常约20秒内即可检测到）。我们不建议在1分钟时间间隔之后读取结果。极少数情况下，反应可能在液滴边缘出现微弱凝集，但未伴随背景悬液的澄清，或呈现“丝状”外观而无背景澄清（数据未显示）。此类反应极可能为阴性。在此类情况下，我们建议重新检测和/或采用其他血清分型方法进一步验证（例如Quellung反应17）。

荧光显微镜图像：细胞核内DNA分布比较，1 mm比例尺。
图1. 乳胶凝集反应的阳性与阴性结果。 肺炎链球菌分离株与乳胶凝集试剂混合后的反应示例：显示阳性反应 (A) 或阴性反应 (B)。在阳性反应中可见凝集现象，并伴随背景澄清 (A)。使用阴性对照乳胶试剂或在阴性检测反应中均无可见凝集现象 (B)。图片8 经许可使用。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

乳胶凝集是一种简单、快速且经济的肺炎球菌血清型分型方法。市面上有商业化的肺炎球菌乳胶凝集试剂，但目前这些试剂尚不能区分所有已知的肺炎球菌血清型10,12。然而，可通过购买针对特定肺炎球菌荚膜抗原制备的抗血清，在实验室自行制备乳胶凝集试剂。本文所述方法是将抗体被动吸附到乳胶颗粒上，从而制备一系列乳胶凝集试剂。

当结合在乳胶颗粒上的特异性抗体与肺炎链球菌分离株多糖荚膜上的抗原结合时，会发生阳性乳胶反应18,19。抗体结合的乳胶颗粒使得特异性抗原-抗体反应无需放大即可被观察到。

乳胶凝集法适用于高通量实验室，也适用于资源匮乏的环境。该方法的主要优点包括：无需特殊设备即可完成检测，试剂在4 °C下储存时保质期至少为2年8，且成本低廉、操作简便、快速。通过乳胶凝集法对肺炎链球菌分离株进行血清型鉴定约需10分钟，且可在同一玻片上同时平行检测最多四种乳胶试剂。此外，若已知相关流行病学背景下各血清型的流行情况，可参考魁ellung试验17的方法，优先使用包含最常见血清型的试剂池分轮次进行检测。该策略可最大限度减少确定血清型所需的检测次数。该方法在不同操作者之间也具有高度可重复性（数据未显示）。乳胶凝集血清分型的一个缺点是试剂制备耗时，约需4小时；尽管可同时平行制备多种试剂。此外，某些抗原在不同肺炎链球菌血清型间具有共性，可能导致与某些抗血清发生交叉反应（例如，血清型29、42和35群）。然而，使用商业抗血清时（通常已预先吸附以去除较具干扰性的交叉反应抗体），这些交叉反应已有充分表征，制造商也会提供额外的反应表以帮助区分存在的具体血清型。若抗体在乳胶颗粒表面排列不当，乳胶试剂也可能发生交叉反应；此类情况将被识别为质控失败。根据我们的经验，严格的质控对该方法的成功至关重要，即使使用市售抗血清进行试剂制备时亦然。每种试剂的质控过程约需15分钟，并依赖于一组如上所述的适当质控菌株。

本文所述方法制备的试剂在检测周期内可产生明显的阳性反应。根据我们的经验，实际操作中假阳性结果极为罕见（数据未显示）。偶尔可观察到假阴性反应，通常与特定抗血清已知的问题有关例如， 血清6型分离株可能不与B群抗血清发生反应，或因分离株的荚膜表达下调所致。遵循生产商提供的血清分型流程也至关重要，因为在大多数情况下，假阳性或假阴性反应将导致出现“无法定型”的结果。对于此类情况，以及反应结果难以判读时，建议重复检测和/或采用其他方法（如奎ellung反应）进行检测。

制备满意的乳胶试剂偶尔需要进行一些故障排查。在本文所述的方法中，抗体通过被动吸附的方式连接到乳胶颗粒上15,19，因此一个关键变量是所用抗体的浓度，该浓度决定了乳胶颗粒表面被覆盖的程度以及抗体活性位点的后续排列方式15,20。因此，如果连接到乳胶颗粒上的抗体过少或过多，抗体-抗原反应将无法达到最佳状态，可能导致试剂性能不理想15,20,21。由于不同批次抗血清的抗体效价存在差异，采用固定的稀释比例可能无法获得性能良好的试剂8。一个有效的起始点是使用1:40稀释的抗血清；如果效果不佳，可进一步稀释抗血清。根据我们的经验，这通常能够解决问题8。在少数情况下，试剂在与目标菌株反应时可能表现出微弱的凝集现象，但未伴随悬浮液的澄清。在这种情况下，进一步稀释抗血清并不能改善试剂质量，但通常可以通过省略离心和洗涤步骤来获得满意的试剂8,22。

抗体包被的乳胶颗粒常用于诊断微生物学中，以检测、鉴定或血清分型多种不同的微生物15,20。因此，只要具备合适的抗血清并采用适当的质控程序，本文所述方法也可适用于制备用于其他目的的乳胶试剂。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作是PneuCarriage项目的一部分，由比尔和梅琳达·盖茨基金会资助，并得到维多利亚州政府运营基础设施支持计划的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
基于聚苯乙烯的微粒，800 nmSigma65984-10 ml-F或根据需要选用其他规格
正常兔血清Antibodies Australia NRS-1ml或根据需要选用其他规格，使用前恢复至室温
肺炎球菌（Neufeld）抗血清SSI Diagnostica多种使用前恢复至室温
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
无菌牛血清白蛋白 SigmaA-4503使用前恢复至室温
叠氮化钠 10% (v/v) 溶液 VWR InternationalROAC3902/100ml注意：吸入有害；对皮肤和眼睛有刺激性
Eppendorf Safe-Lock 管，2 mlEppendorf0030 120.094圆底
氯化钠Merck10241.AP
校准的一次性接种环，1 µlCopanCD175SO1
玻璃显微镜载玻片，76 mm × 26 mmThermo Fisher ScientificLBS 2950RC
5 M NaOHBDH10252注意：强腐蚀性
甘氨酸Merck10119.05
马血琼脂（HBA）平板Thermo Fisher ScientificPP2001使用前恢复至室温
http://www.thermofisher.com.au
旋转滚轴混合器Wyble Engineering Development Corporation
聚苯乙烯平底螺口管，5 mlTechnoplasS5016SU
60 ml 无针注射器TerumoSS-60L
Millex-GP 注射器滤器，0.22 µmMerck MilliporeSLGP033RS
Neufeld 抗血清使用手册Statens Serum Institut用于确定血清型
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
肺炎球菌因子血清鉴定指南Statens Serum Institut18058用于确定各群内的血清型
http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*大多数材料均有其他可选来源

参考文献

  1. Rudan, I., et al. Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries. J Glob Health. 3 (10401), (2013).
  2. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).
  5. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  6. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  7. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. , (2013).
  8. Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping. BMC Res Notes. 6 (49), (2013).
  9. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).
  10. Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).
  11. Turner, P., et al. Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray. J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).
  12. Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae. J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).
  13. Lalitha, M. K., et al. Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries. Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).
  14. Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).
  15. Gella, F., Serra, J., Gener, J. Latex agglutination procedures in immunodiagnosis. Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).
  16. Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  17. Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  18. Arai, S., et al. Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae. Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).
  19. Lafong, A. C., Crothers, E. Simple latex agglutination method for typing pneumococci. J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).
  20. Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests. J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).
  21. Yap, K. L. Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection. Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).
  22. Severin, W. P. Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis. J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).

重印与许可

探索更多文章

抗血清制备质量控制检测混合试剂检测因子乳胶试剂生产商鉴定钥匙血清型鉴定肺炎链球菌分离株
乳胶凝集法对Streptococcus pneumoniae进行荚膜血清型鉴定
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。