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方法文章

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

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DOI：

10.3791/51756

⸱

2014年7月7日

 ,  , 
1National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。

摘要

干细胞通过不对称分裂产生两个具有不同命运潜能的子代细胞：一个自我更新的干细胞和一个分化中的细胞。由于其在发育和疾病中的重要性，解析调控干细胞不对称分裂的机制一直是研究的热点领域。果蝇（Drosophila）中枢神经系统中的神经干细胞（即神经母细胞）具有良好的遗传可操作性，并且大约每小时连续进行一轮细胞分裂，因此成为研究干细胞分裂不可或缺的模型。每个幼虫脑叶表面附近约有100个神经干细胞，这使得该模型体系特别适用于活体成像显微镜研究。在本研究中，我们综述了多种广泛用于观察干细胞分裂的方法，并探讨了使用解离组织与完整脑组织技术各自的优缺点。此外，我们详细描述了一种简化的实验方案，用于从三龄幼虫中完整剥离大脑，以应用于活细胞成像和固定后分析。

引言

干细胞通过维持分化与自我更新之间的平衡，在早期发育过程中产生细胞多样性，并在成体组织中替换受损细胞。这种稳态的调控可防止干细胞群体的减少或过度扩增，否则可能导致有害的组织退化或肿瘤发生。

神经母细胞（NBs）是果蝇（Drosophila）中枢神经系统中被广泛研究的神经干细胞（图1A），其最初在胚胎发育阶段形成1,2。NBs通过多轮不对称细胞分裂（ACD）产生两个命运不同的子细胞：一个具有自我更新能力的干细胞和一个走向分化的细胞。ACD过程由中心体引导，中心体是一种无膜细胞器，在大多数细胞中充当微管组织中心3。在有丝分裂过程中，NB的中心体负责组织并定向双极有丝分裂纺锤体，使其沿顶端-基底极性轴排列。当NB完成分裂时，决定干细胞命运的顶端命运决定因子和决定分化命运的基底命运决定因子被分别分配到两个大小不等的子细胞中。

在幼虫的中央脑中，可根据数量、位置、转录因子表达及细胞谱系区分出两种类型的神经母细胞（NBs）（图1A）4-6。I型NBs数量最多，每侧脑的视叶前部和后部各有约90个7。这些NBs表达转录因子Asense（Ase），其典型特征是通过分裂产生一个自我更新的NB和一个较小的神经节母细胞（GMC；图1B）。每个GMC经历一次终末分裂，生成两个神经元或胶质细胞（图1B）。相比之下，位于每侧视叶后部的8个II型NBs不表达Ase5。它们通过不对称细胞分裂（ACD）产生一个自我更新的NB和一个中间神经前体细胞（INP）。

随后，神经母细胞（INP）不对称分裂三到五次。每一次分裂都会再生一个INP，并产生一个单一的成神经细胞（GMC4）。总体而言，特定的神经母细胞（NB）身份以及成神经细胞（GMC）出生的时间顺序共同导致了成体中枢神经系统惊人的神经元多样性。

通过活细胞成像技术，人们对神经母细胞不对称细胞分裂（NB ACD）所涉及的细胞生物学机制的理解已得到显著提升。研究人员用于成像活体神经母细胞的已发表实验方案差异较大。然而总体而言，这些方法可分为两大类，其区别在于幼虫脑组织是保持完整还是经机械解离。这两种技术各有优缺点，具体选择取决于研究人员的实际应用需求。

早期揭示活体神经母细胞（NB）分裂的研究在一定程度上涉及对幼虫大脑的手动解离。这些方案详细描述了通过涂抹8或轻柔分离9大脑组织，以在玻璃盖玻片上建立短期原代NB培养。为了改善成像效果，通常使用玻璃载片8或琼脂糖垫9将原本呈圆形的NB压平于盖玻片上。尽管压平后的细胞光学特性更佳，但这些技术常导致NB出现有丝分裂缺陷，包括分裂沟回缩以及无法进行多次分裂。因此，涉及手动解离和对幼虫脑组织施加物理形变的方案通常仅适用于极短期（即，一个细胞周期或更短时间）的实验应用。同样地，将完整大脑在玻璃载片与盖玻片之间进行半压片或完全压平的方法，也限制了对特定样本的成像时间，通常约为30分钟10。尽管存在这一局限性，该方法已被成功应用11-14。

近期用于成像活体解离神经母细胞（NBs）的技术旨在限制对分离细胞造成的物理形变。这些技术在需要维持细胞培养以完成多个细胞分裂周期的应用中尤为有用。例如，从手工解离的脑组织中获得的分散细胞可部分包埋于由纤维蛋白原和凝血酶混合物形成的凝块中。15 用于长期成像16或者，可将取出的脑组织先用胶原酶进行化学解离，再通过反复吹打移液枪头进行手动破碎，随后接种于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中17,18用纤维蛋白原或聚-L-赖氨酸包被玻璃培养皿可促进圆形细胞的贴附并使其轻微铺展，从而在不引起显著物理形变的情况下使其尽可能贴近盖玻片。此外，这些方法涉及将神经球（NBs）培养在培养基中，便于后续更换培养基以进行药理学干扰实验。18总体而言，直接将分散的神经球接种培养可改善成像光学效果，同时不牺牲长期成像能力。近期已有研究详细描述了一种用于解离后神经球长期培养的实验方案。19.

然而，这种方法也存在一定的局限性。对分离的神经母细胞（NB）进行活体成像时需注意多个问题。例如，在分散的细胞群体中，很难识别出在完整大脑中具有特定空间组织模式的NB谱系1。同样，在缺乏谱系示踪标记或亚型特异性转基因（如worniu-GAL4、asense-GAL8020）的情况下，也难以区分I型与II型NB。尽管这些转基因在某些应用中非常有用，但它们限制了研究人员只能使用受UAS增强子元件调控表达的转基因系统21，并需要更复杂的遗传操作方案。因此，针对NB空间或时间发育过程的研究，仍需在完整组织背景下进行体内（in vivo）成像。

此外，对分离的胚胎神经母细胞（NBs）的研究表明，相邻细胞之间的物理接触对于关键极性决定因子在间期的定位至关重要22,23。这些研究显示，完全孤立的神经母细胞不再维持不变的有丝分裂纺锤体轴，而是表现出更加随机化的纺锤体轴以及连续的成神经细胞（GMC）出芽之间较大的分离角度，这可能是由于顶端中心体定位的丧失所致22。尽管幼虫期神经母细胞与其邻近细胞之间的关系尚未被深入研究，但值得考虑的是，幼虫干细胞微环境可能会影响细胞极性或其他细胞行为。为了保持幼虫神经母细胞的生理环境，我们对完整脑组织中的不对称细胞分裂（ACD）进行成像。

鉴于对解离的神经母细胞（NBs）进行成像存在固有的局限性，本实验室及其他研究团队已建立了从完整幼虫脑组织中连续成像神经母细胞不对称细胞分裂（ACD）的实验方案。用于成像完整脑组织的技术通常在培养腔的一侧用柔性膜替代刚性玻璃表面，以防止组织变形或损伤，并促进气体交换。某些方法涉及将离体脑组织与来自十只幼虫的脂肪体共同置于含有昆虫培养基、血清和抗坏血酸的混合液中进行封片培养。24加入分离的脂肪体，因为它们会分泌一种已知可刺激神经母细胞分裂的有丝分裂原25该方案可使组织完整性保持超过3 小时 因此适用于长期成像24,26-28最近，已有研究详细描述了一种在抗坏血酸、血清和脂肪体存在的条件下对完整幼虫大脑进行长期成像的实验方案。29重要的是，由于组织既未暴露也未固定，因此该方法在需要更换培养基的应用中作用有限例如药物研究，免疫耗竭 等等.).

本实验室简化了用于长期成像的活体幼虫脑整体装片制备方法30,31。与其它方案相比，本方案的主要优势在于其简便性：我们的观察结果表明，血清、抗坏血酸、胰岛素或脂肪体均非成像神经干细胞不对称细胞分裂（NB ACD）连续过程所必需的添加成分。尽管某些添加剂（如胰岛素）在延长干细胞分裂32以及果蝇（Drosophila）卵巢中集体细胞迁移的成像中具有作用33，但在NB ACD成像中似乎并非必需，因为我们的成像培养基仅由标准昆虫细胞培养基添加抗生素-抗真菌剂以防止污染组成。通过使用可重复利用的透气膜培养皿或玻璃底培养皿，我们已成功维持了多轮连续的NB ACD过程。同一离体样本还可直接用于免疫荧光及其他固定组织相关实验。在本方案中，我们详细描述了完整幼虫脑的解剖步骤，以及适用于活体和固定组织分析的脑组织制备方法。

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方案

1. 准备用于外植三龄幼虫脑所需的材料

  1. 准备显微解剖所需的工具。
    1. 通过将一根解剖针插入每个针座中，制作两种解剖工具（手术刀和钩子）。用手或镊子将针固定牢固（图1C）。
    2. 使用一对旧镊子将一根解剖针弯成约120°角。此操作应在解剖显微镜下进行，以确保当手持针座时，针的上半部分能够保持水平。该工具将用作手术刀，用于压住或切割组织。
    3. 使用一对旧镊子将第二根针弯成钩状，用于夹持和刮除组织。
    4. 用移液器吸头覆盖每种解剖工具，以防止工具受损。若小心使用，制作良好的工具可长期用于解剖。必要时更换损坏或变形的针。
  2. 准备解剖培养基。
    1. 在组织培养罩内，将抗生素-抗真菌添加剂稀释到Schneider培养基中。轻轻旋转液体以混匀添加剂。
    2. 将添加了添加剂的培养基分装成若干5 ml等份。所有培养基在使用前均储存于4 °C。
    3. 将一份5 ml含添加剂的培养基恢复至室温。用无菌5 ml注射器吸取培养基，并旋紧无菌0.2 µm注射式滤器。
  3. 选择用于解剖的幼虫。使用解剖探针挑选正在爬行的三龄幼虫，因其脑组织最易于解剖。可选：将幼虫置于葡萄汁琼脂平板上。
    注意：不要使用过于拥挤的试管或瓶，以及含有“湿性食物”的容器，因为这些条件容易导致二龄或一龄幼虫过早爬出。
    注意：某些遗传背景可能需要使用较年轻的幼虫。这不会影响实验方案，但会使解剖操作更加困难。

2. 中枢神经系统的解剖

  1. 在单张载玻片上，制备两池约50 ml的温热解剖液，两池相距约3 cm。一池用于粗略解剖，另一池用于精细解剖。图1C).
  2. 将数条幼虫转移至其中一个培养基液滴中。
  3. 将带有幼虫的盖玻片转移至解剖显微镜下。调整放大倍数，使幼虫所在的池中幼虫的前端和后端清晰可辨。
  4. 使用一对镊子夹住单条幼虫的中段区域。另一只手用第二对镊子夹住幼虫靠近同一区域的部位，将两对镊子反向轻拉，使幼虫轻轻撕裂成两半。在盖玻片上的所有幼虫重复上述两个步骤。
  5. 将幼虫身体的后半部分转移至组织中处理掉。
  6. 将幼虫放大，使前端口钩清晰可见。用两对镊子在幼虫口钩两侧、第三胸节与第一前齿带之间相对的位置上，各制造一个小切口或凹口。
  7. 用非惯用手的镊子夹住口钩。用另一只手的镊子轻轻从前向后剥离角质层。持续缓慢剥离角质层，直至中枢神经系统暴露。
  8. 用镊子撕开组织，将中枢神经系统从幼虫其余部分分离。注意不要扰动中枢神经系统。
    关键步骤： 不要牵拉中枢神经系统！丢弃腹神经索撕裂的受损样本图2A）或变形的视叶（图2B 和 2B’).
  9. 对盖玻片上的所有幼虫重复上述两个步骤。将健康的外植组织转移至盖玻片上第二个（洁净的）培养基液滴中，进行精细解剖步骤。
  10. 使用解剖针工具清除周围组织（例如，眼、翅和腿盘）与脑部分离。将解剖刀在目标组织（脑）与非目标组织之间滑动，将结缔组织固定在盖玻片上。用解剖钩轻轻拨离不需要的组织，同时以锯切样动作将解剖刀压向盖玻片。
  11. 关键步骤：从每个脑组织中缓慢而仔细地移除所有圆盘状组织，注意不要破坏脑的形态结构。健康的脑组织应具有完整的腹神经索和对称、圆形的视叶。图2C).

3. 活体成像用离体脑组织的制备

  1. 将一个50 mm的透气培养皿倒置，使透明膜朝上（图2D）。按压注射器，将一小滴培养基（约30 µl）滴加到培养皿中央。
  2. 逐个将分离的脑组织转移至培养皿中的液滴上。使用钩状工具从视叶下方钩起脑组织。或者，使用镊子夹住腹神经索延伸出的轴突进行操作。
  3. 将5–10个脑组织收集于同一滴培养基中。由于多数脑组织会滞留在液面弯月面处，需使用解剖针工具将各个脑组织推至液滴底部，使其完全浸没（图2E）。
  4. 使用解剖针工具调整脑组织的方向，根据需要成像的神经母细胞（NBs）进行排列（图3A）。若需成像背侧神经母细胞，应使腹神经索朝下（贴近膜面）；若需成像腹前侧神经母细胞，则使腹神经索朝上（远离膜面）。调整脑组织方向，使所有腹神经索在x-y平面上指向相同方向。
  5. 使用注射器或塑料移液管，在透气膜上滴加4滴卤代烷油（HC油），每滴约30 µl。每滴油的体积应彼此相等，并与培养基液滴体积相当。将油滴分布于培养基液滴四周，对应于盖玻片四个角的位置，盖玻片中心对准培养基液滴。完成后，五个液滴（四周四滴油，中央一滴培养基）应呈现类似西方骰子五点图案的布局（图3B）。
  6. 将一片#1.5规格、22 mm的盖玻片轻轻盖下，使其同时接触五个液滴。保持样品受力均匀，以减少扰动风险。静置约3分钟，待油和培养基在盖玻片重力作用下扩散展开，形成十字形的培养基区域（图3C和图3D）。
  7. 关键步骤：在解剖显微镜下观察样本，用纸巾芯条吸除多余培养基，使盖玻片缓慢下降至脑组织表面（图3C）。随着培养基被吸除，盖玻片将逐渐降低。当盖玻片刚好接触脑组织时即停止吸液。切勿过度吸除，以免导致组织变形或脑组织破裂。
  8. 若成像背侧神经母细胞（图3E），则进入步骤3.9。若成像腹前侧神经母细胞，需用镊子轻轻推动盖玻片，使其沿腹神经索末端方向略微移动。此举可促使脑组织旋转，使脑叶直接接触盖玻片，便于成像（图3F）。
  9. 用少量卤代烷油围绕盖玻片边缘进行封固，以密封成像腔室（图3D）。应尽量减少油从盖玻片边缘溢出，并用纸巾吸除多余油滴。

4. 中枢脑神经母细胞的活体成像

注意：本研究使用尼康Eclipse Ti转盘共聚焦显微镜（倒置显微镜）进行活体成像；我们实验装置的详细信息此前已有发表31。 alternatively，也可使用正置显微系统对样品进行成像。

  1. 在固定好的脑组织上方的盖玻片上滴加一滴浸油。这有助于将物镜准确对准样品正上方。
  2. 关键步骤：使用载物台培养箱将脑组织维持在恒定的 25 °C 温度下。轻柔地将固定好的样品放入载物台培养箱中，并用盖子盖好培养室。
  3. 使用透射光在视叶的中央和内侧区域寻找较大的圆形细胞，以定位中央脑神经干细胞（NBs）；切勿使用落射荧光。此操作随着练习会变得更加容易。非常重要的是，应尽可能减少样品暴露在光照下的时间。不要浪费时间对受损的脑组织进行成像。
  4. 样品就位后，使用共聚焦显微镜进行快速曝光，以确定合适的位置和成像深度。成像深度限制在前 10–15 µm 范围内。根据需要进行调整，并拍摄另一张测试图像。
    1. 可选步骤：采集腹神经索的测试录像，以确认是否存在 x-y 方向的漂移。如果检测到漂移，请等待 15–30 分钟让样品稳定。若 30 分钟后漂移仍未消除，则需制备新的样品。明显的漂移通常可归因于浸油过量，或在样品固定过程中油滴大小不均所致。
  5. 为消除轴向漂移（z-漂移），使用基于红外 LED 的连续自动对焦装置。或者，手动校正焦平面。
  6. 一旦确定了目标神经干细胞（NB），即可开始成像方案。与所有活细胞成像实验一样，激光强度、曝光时间、相机像素合并（binning）、物镜放大倍数、时间间隔和/或 z 轴步进间隔等参数必须根据具体实验问题通过经验优化。目标是在获取有效数据的同时，尽量减少光毒性损伤。详见讨论部分以获得进一步指导。
    1. 通过在 z 轴方向以 1 µm 间隔采集 12–14 张图像，完成对整个神经干细胞（NB）体积的成像。调整时间分辨率，以捕获单个或多个细胞周期的同一神经干细胞（NB）动态。一般建议：单细胞周期成像采用 10–30 秒的时间间隔，多细胞周期成像采用 1–3 分钟的时间间隔。
  7. 关键步骤：通过监测有丝分裂持续时间来确认样品处于健康状态。如果一次有丝分裂持续超过 15 分钟，则应更换其他脑组织。健康的脑组织在同一视野内应可见多个神经干细胞（NBs）正在进行多轮有丝分裂。注意，由于光损伤的影响，每个后续细胞周期通常会比前一个略长。
  8. 成像完成后，拆卸培养室，并丢弃所有部件，仅保留透气性培养皿。用 95% 乙醇冲洗培养皿表面，并用纸巾充分擦拭。重复清洗过程两次。

5. 免疫荧光染色用脑组织的制备

  1. 将20个或更多的离体脑组织收集到一个含有约0.2 ml补充培养基的1.5 ml离心管中。
  2. 从管中移除培养基，并用0.5 ml含0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBSTx）清洗脑组织一次。每次更换液体时，让脑组织沉降到管底。Triton X-100作为一种去垢剂用于通透组织。清洗通常耗时少于30秒；待脑组织沉底后，直接吸除PBSTx即可。
  3. 将溶液替换为0.5 ml用PBSTx稀释的9%电子显微镜级多聚甲醛。室温下在摇床上孵育15分钟。
  4. 根据危险废物处理规定丢弃固定液。
  5. 用0.5 ml PBSTx洗涤样品15分钟。再用新鲜PBSTx重复洗涤两次。
  6. 将溶液替换为0.5 ml PBT（PBS、1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Tween-20）。室温下在摇床上孵育1小时。此步骤用于阻断抗体与组织的非特异性结合。
  7. 将溶液替换为0.5 ml用PBT（含4%正常山羊血清，NGS）稀释的一抗溶液。4 °C下在摇床上孵育过夜。
  8. 弃去或保存稀释后的一抗溶液。
  9. 用0.5 ml PBT洗涤样品15分钟。再用新鲜PBT重复洗涤两次。
  10. 将溶液替换为0.5 ml改良PBT（PBS、2% BSA、0.1% Tween-20和4% NGS）。室温下在摇床上孵育1小时。
  11. 将溶液替换为0.5 ml用改良PBT稀释的二抗溶液。室温下在摇床上孵育2小时。
  12. 将溶液替换为0.5 ml PBST（含0.1% Tween-20的PBS）。室温下在摇床上孵育15分钟。再用新鲜PBST重复洗涤两次。

6. 免疫荧光样品的封片

  1. 将样品小心地以液滴形式转移至载玻片上，使液滴位于载玻片中心偏左的位置。
  2. 在载玻片中央加入一大滴封片介质（例如 Aqua-Poly/Mount），直径约 2 cm。注意避开位于左侧的 PBST 液滴。
  3. 使用镊子将脑组织从 PBST 液滴转移至封片介质液滴中。避免直接将封片介质滴加在脑组织上方，以免破坏其方向性。
  4. 在光学显微镜下，将样品在封片介质中调整至成像面朝上。
  5. 在光学显微镜下，缓慢将一块 #1.5 玻璃盖玻片覆盖在样品上。可选步骤：可轻压盖玻片以排除微小气泡。
  6. 将载玻片平放于避光环境中，在室温下静置数小时或过夜，使封片介质充分聚合。
  7. 载玻片可在次日进行成像，或在成像前储存保存。

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结果

活体成像已阐明了多种调控神经母细胞不对称细胞分裂（NB ACD）的机制。在开始图像采集之前，必须确定最佳的成像条件。需要在帧采集速率与活细胞成像持续时间之间取得平衡。例如，在进行精细的细胞分析时，可能需要更高的时间分辨率和光学分辨率。在观察单个神经母细胞周期时（图4A），可以在不引起光损伤的情况下提高图像采集速率。通常，单个细胞分裂事件可每约10-30秒进行一次监测。一种在不损伤组织的情况下提高时间分辨率的方法是调节图像采集速率。例如，可先以较低的帧率开始延时成像，随后在观察到感兴趣的特征或时间点时提高采集速率（视频1）。

另一方面，对连续多轮细胞分裂进行成像（视频 2）通常以较低的帧率进行（图 4B）。我们通常以 1–3 分钟的时间间隔，在 2–3 小时内对整个神经母细胞体积中的多轮（两轮或更多轮）不对称细胞分裂（ACD）进行成像。通过减少照射到样品上的光量，可以提高时间分辨率和成像采集时长。例如，如果仅对单个光学层面进行成像，则连续神经母细胞分...

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讨论

活细胞成像是一种用于研究干细胞不对称细胞分裂（ACD）的调控机制、细胞谱系分化以及复杂组织形态发生过程的宝贵方法。尽管研究团队历史上采用过多种技术来观察神经母细胞（NB）的不对称细胞分裂（ACD），但这些方法大致可分为两类，主要区别在于脑组织是保持完整还是被解离。

成像解离的神经母细胞（NBs）具有其优势。首先，解离的神经母细胞更容易成像，因为它们是培养皿中体积最大（直径约12 µm）的细胞，易于识别。此外，几乎所有在玻璃表面培养的干细胞在整个图像采集过程中与显微镜物镜的距离均基本一致。使用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）或纤维蛋白原（fibrinogen）包被的玻璃，可促使圆形的神经母细胞发生半摊平，从而进一步提高延时成像的光学质量。16,17培养的离解神经母细胞成像的另一个优势在于更换培养基的便捷性。一旦细胞贴附于包被的玻璃表面，即可更换含有各种药理学激动剂、拮抗剂或免疫阻断抗体的培养基， 等等可添加或移除。最后，近期用于可视化离解神经球（NBs）的方法已证明，该技术确实适用于长时...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）院内研究部门（项目编号：1ZIAHL006126）以及授予 DAL 的伦芬特生物医学博士后奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 x 12 mm 的 Lumox 组织培养皿Sarstedt94.6077.410一种可重复使用的培养皿，其底部为透气且光学透明的薄膜。
Schneider's S2 培养基Invitrogen21720-024
Gibco 抗生素-抗真菌素（100 倍浓度）Invitrogen15240-062一种添加剂，含有青霉素（10,000 U/ml）、链霉素（10,000 μg/ml）和两性霉素 B（25 μg/ml），加入 Schneider's S2 培养基中以防止细菌和真菌污染。 
玻璃盖玻片，#1.5，22 x 22 mmFisher Scientific12-541-B
卤碳油 700Sigma-AldrichH8898一种高黏度惰性油，透明无色。
镍镀层针夹，一对，17 cm 长Fine Science Tools26018-17
Dumont #5 镊子，一对Fine Science Tools11252-20
带塑料手柄的解剖针/探针Fisher Scientific08-965-A
注射器滤器，0.22 μm 孔径Fisher Scientific09-719A
5 ml 注射器BD Biosciences309646
塑料移液管Fisher ScientificS30467-1
32% 电子显微镜级甲醛Electron Microscopy Sciences15714注意：甲醛有毒，应在通风橱中操作。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的安全操作指南。
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）InvitrogenD1306一种可标记 DNA 并被紫外光激发的荧光染料。

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