本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。
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摘要
摘要
干细胞通过不对称分裂产生两个具有不同命运潜能的子代细胞：一个自我更新的干细胞和一个分化中的细胞。由于其在发育和疾病中的重要性，解析调控干细胞不对称分裂的机制一直是研究的热点领域。果蝇（Drosophila）中枢神经系统中的神经干细胞（即神经母细胞）具有良好的遗传可操作性，并且大约每小时连续进行一轮细胞分裂，因此成为研究干细胞分裂不可或缺的模型。每个幼虫脑叶表面附近约有100个神经干细胞，这使得该模型体系特别适用于活体成像显微镜研究。在本研究中，我们综述了多种广泛用于观察干细胞分裂的方法，并探讨了使用解离组织与完整脑组织技术各自的优缺点。此外，我们详细描述了一种简化的实验方案，用于从三龄幼虫中完整剥离大脑，以应用于活细胞成像和固定后分析。
引言
干细胞通过维持分化与自我更新之间的平衡，在早期发育过程中产生细胞多样性，并在成体组织中替换受损细胞。这种稳态的调控可防止干细胞群体的减少或过度扩增，否则可能导致有害的组织退化或肿瘤发生。
神经母细胞（NBs）是果蝇（Drosophila）中枢神经系统中被广泛研究的神经干细胞（图1A），其最初在胚胎发育阶段形成1,2。NBs通过多轮不对称细胞分裂（ACD）产生两个命运不同的子细胞：一个具有自我更新能力的干细胞和一个走向分化的细胞。ACD过程由中心体引导，中心体是一种无膜细胞器，在大多数细胞中充当微管组织中心3。在有丝分裂过程中，NB的中心体负责组织并定向双极有丝分裂纺锤体，使其沿顶端-基底极性轴排列。当NB完成分裂时，决定干细胞命运的顶端命运决定因子和决定分化命运的基底命运决定因子被分别分配到两个大小不等的子细胞中。
在幼虫的中央脑中，可根据数量、位置、转录因子表达及细胞谱系区分出两种类型的神经母细胞（NBs）（图1A）4-6。I型NBs数量最多，每侧脑的视叶前部和后部各有约90个7。这些NBs表达转录因子Asense（Ase），其典型特征是通过分裂产生一个自我更新的NB和一个较小的神经节母细胞（GMC；
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方案
1. 准备用于外植三龄幼虫脑所需的材料
- 准备显微解剖所需的工具。
- 通过将一根解剖针插入每个针座中，制作两种解剖工具（手术刀和钩子）。用手或镊子将针固定牢固（图1C）。
- 使用一对旧镊子将一根解剖针弯成约120°角。此操作应在解剖显微镜下进行，以确保当手持针座时，针的上半部分能够保持水平。该工具将用作手术刀，用于压住或切割组织。
- 使用一对旧镊子将第二根针弯成钩状，用于夹持和刮除组织。
- 用移液器吸头覆盖每种解剖工具，以防止工具受损。若小心使用，制作良好的工具可长期用于解剖。必要时更换损坏或变形的针。
- 准备解剖培养基。
- 在组织培养罩内，将抗生素-抗真菌添加剂稀释到Schneider培养基中。轻轻旋转液体以混匀添加剂。
- 将添加了添加剂的培养基分装成若干5 ml等份。所有培养基在使用前均储存于4 °C。
- 将一份5 ml含添加剂的培养基恢复至室温。用无菌5 ml注射器吸取培养基，并旋紧无菌0.2 µm注射式滤器。
- 选择用于解剖的幼虫。使用解剖探针挑选正在爬行的三龄幼虫，因其脑组织最易于解剖。可选：将幼虫置于葡萄汁琼脂平板上。
注意：不要使用过于拥挤的试管或瓶，以及含有“湿性食物”的容器，因为这些条件容易导致二龄或一龄幼虫过早....
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结果
活体成像已阐明了多种调控神经母细胞不对称细胞分裂（NB ACD）的机制。在开始图像采集之前，必须确定最佳的成像条件。需要在帧采集速率与活细胞成像持续时间之间取得平衡。例如，在进行精细的细胞分析时，可能需要更高的时间分辨率和光学分辨率。在观察单个神经母细胞周期时（图4A），可以在不引起光损伤的情况下提高图像采集速率。通常，单个细胞分裂事件可每约10-30秒进行一次监测。一种在不损伤组织的情况下提高时间分辨率的方法是调节图像采集速率。例如，可先以较低的帧率开始延时成像，随后在观察到感兴趣的特征或时间点时提高采集速率（视频1）。
另一方面，对连续多轮细胞分裂进行成像（视频 2）通常以较低的帧率进行（图 4B）。我们通常以 1–3 分钟的时间间隔，在 2–3 小时内对整个神经母细胞体积中的多轮（两轮或更多轮）不对称细胞分裂（ACD）进行成像。通过减少照射到样品上的光量，可以提高时间分辨率和成像采集时长。例如，如果仅对单个光学层面进行成像，则连续神经母细胞分.......
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讨论
活细胞成像是一种用于研究干细胞不对称细胞分裂（ACD）的调控机制、细胞谱系分化以及复杂组织形态发生过程的宝贵方法。尽管研究团队历史上采用过多种技术来观察神经母细胞（NB）的不对称细胞分裂（ACD），但这些方法大致可分为两类，主要区别在于脑组织是保持完整还是被解离。
成像解离的神经母细胞（NBs）具有其优势。首先，解离的神经母细胞更容易成像，因为它们是培养皿中体积最大（直径约12 µm）的细胞，易于识别。此外，几乎所有在玻璃表面培养的干细胞在整个图像采集过程中与显微镜物镜的距离均基本一致。使用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）或纤维蛋白原（fibrinogen）包被的玻璃，可促使圆形的神经母细胞发生半摊平，从而进一步提高延时成像的光学质量。16,17培养的离解神经母细胞成像的另一个优势在于更换培养基的便捷性。一旦细胞贴附于包被的玻璃表面，即可更换含有各种药理学激动剂、拮抗剂或免疫阻断抗体的培养基， 等等可添加或移除。最后，近期用于可视化离解神经球（NBs）的方法已证明，该技术确实适用于长时.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）院内研究部门（项目编号：1ZIAHL006126）以及授予 DAL 的伦芬特生物医学博士后奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 x 12 mm 的 Lumox 组织培养皿 | Sarstedt | 94.6077.410 | 一种可重复使用的培养皿，其底部为透气且光学透明的薄膜。 |
| Schneider's S2 培养基 | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco 抗生素-抗真菌素（100 倍浓度） | Invitrogen | 15240-062 | 一种添加剂，含有青霉素（10,000 U/ml）、链霉素（10,000 μg/ml）和两性霉素 B（25 μg/ml），加入 Schneider's S2 培养基中以防止细菌和真菌污染。 |
| 玻璃盖玻片，#1.5，22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| 卤碳油 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | 一种高黏度惰性油，透明无色。 |
| 镍镀层针夹，一对，17 cm 长 | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Dumont #5 镊子，一对 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 带塑料手柄的解剖针/探针 | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| 注射器滤器，0.22 μm 孔径 | Fisher Scientific | 09-719A | |
| 5 ml 注射器 | BD Biosciences | 309646 | |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| 32% 电子显微镜级甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 注意：甲醛有毒，应在通风橱中操作。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的安全操作指南。 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐） | Invitrogen | D1306 | 一种可标记 DNA 并被紫外光激发的荧光染料。 |
参考文献
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular mar....
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