星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

摘要

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内 通过将转化细胞原位注射到同系、免疫功能健全的同窝幼鼠脑内。

摘要

目前的星形细胞瘤模型在界定致瘤性突变在疾病发生过程中对特定脑细胞类型的作用，以及在临床前药物开发中的应用方面存在局限性。为了针对这些应用设计更优的模型系统，研究人员从携带不同组合的floxed致瘤等位基因的条件性基因工程小鼠（GEM）中分离出表型为野生型的皮层星形胶质细胞和神经干细胞（NSC），并在体外进行培养。通过诱导基因重组 体外 通过腺病毒介导的Cre重组，实现突变癌基因的表达和肿瘤抑制基因的缺失。通过检测细胞增殖、转化能力及药物反应，确定这些突变的表型效应。 体外. 通过将转化细胞立体定向注射到免疫健全、遗传背景相同的同窝幼鼠脑内，建立同位异体移植模型，以明确致癌突变和细胞类型在肿瘤发生中的作用 体内与大多数已建立的人胶质母细胞瘤细胞系异种移植模型不同，将经转化的GEM来源的皮层星形胶质细胞注射到免疫健全同窝幼鼠脑内，可产生星形细胞瘤，包括最具侵袭性的亚型——胶质母细胞瘤，其组织病理学特征与人类星形细胞瘤高度相似，表现为向正常脑实质的弥漫性浸润。通过生物发光成像技术，对经基因工程改造后表达荧光素酶的转化星形胶质细胞所形成的原位同种移植瘤进行监测 在体 随时间推移的肿瘤生长情况。因此，利用从携带条件性致癌等位基因的基因工程小鼠（GEM）中分离的星形胶质细胞和神经干细胞构建的星形胶质瘤模型，为研究星形胶质瘤发病机制中的遗传学和细胞生物学提供了整合性研究系统 体外 和 体内 在这些严重疾病的临床前药物开发中可能具有应用价值。

引言

星形细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，而胶质母细胞瘤（GBM）是星形细胞瘤的Ⅳ级亚型，为最常见且最具侵袭性的类型，其中位生存期为12至15个月^1,2弥漫性星形细胞瘤（尤其是胶质母细胞瘤，GBM）的侵袭性导致无法完全手术切除，限制了辅助治疗的效果，并不可避免地引起治疗后复发³患者最初表现为初发性（原发性）胶质母细胞瘤，或表现为不可避免地进展为继发性胶质母细胞瘤的低级别星形细胞瘤⁴胶质母细胞瘤（GBM）在基因组上具有异质性，其特征是调控三条核心信号通路的基因存在互斥性及共现性突变：G₁/S（Rb）细胞周期检查点、受体酪氨酸激酶（RTK）和 TP53 通路^5-7胶质母细胞瘤（GBM）包含四种具有不同基因表达谱的基因组亚型，其表达特征类似于不同类型脑细胞，提示GBM亚型受其起源细胞的影响。^6,8,9需要更好的星形细胞瘤模型来明确特定突变组合在星形细胞瘤发病过程中对特定细胞类型的作用。利用这些模型进行更高效的临床前药物开发，最终将有助于改善患者的预后。目前的星形细胞瘤模型包括已建立的人源细胞系、患者来源的异种移植模型（PDX）、基因修饰的正常人星形胶质细胞以及神经干细胞。 （NSC）和基因工程小鼠（GEM）^10-14我们开发了一种替代性的非生殖系基因工程小鼠（nGEM）模型¹⁵ 利用携带不同组合的floxed致癌等位基因的GEM中分离出的原代脑细胞——皮层星形胶质细胞和NSC。目标是构建具有明确遗传背景的星形胶质细胞瘤模型，这些模型可通过表型特征进行表征 体外 和 体内 并可能用于免疫健全小鼠的临床前药物开发。

建立的人类细胞系是研究星形细胞瘤发病机制和药物反应最常用的模型 体外 和 在体内 它们在技术上操作简便，广泛可得，且在免疫缺陷小鼠中原位异种移植后具有明确的动力学特征和致瘤性。^10,11,16-18其缺点包括无法从低级别星形细胞瘤中建立稳定的细胞系，从而限制了研究仅能针对高级别星形细胞瘤；缺乏明确的细胞起源；存在复杂的基因组异常，其基因组特征常与原始患者样本显著不同；以及在含血清的连续传代培养过程中易发生表型和基因型漂移^11,17,19-22在已建立的人类胶质母细胞瘤（GBM）细胞系中，单个致癌突变的表型效应可能被实际存在的多种异常所掩盖，这通常阻碍了基因型-表型直接关联的阐明。

PDX 是通过将患者来源的星形细胞瘤细胞皮下接种至免疫缺陷小鼠体内，或先在特定的无血清培养基中以非贴壁球状体形式进行培养，再将其正位注射到免疫缺陷小鼠脑内而建立的^12,23PDX 能更准确地维持人类星形细胞瘤的基因组特征，但与已建立的人类细胞系类似，由于其基因组复杂性，单个致癌突变的表型效应可能被掩盖^19,24为了明确特定致癌突变的表型后果，尤其是在应对新型治疗时，通常利用已建立的人源细胞系或患者来源的异种移植模型（PDX）进行研究，以建立基因型-表型之间的关联，验证结果的普适性，并最大限度地减少细胞系特异性效应的影响。尽管PDX模型能够准确再现人类星形细胞瘤的组织病理学特征，包括侵袭性，但已建立的人源细胞系在原位异种移植时通常无法再现这些特征。^21,23,25此外，已通过基因工程对正常人星形胶质细胞和神经干细胞引入特定的致癌突变，以模拟星形细胞瘤的肿瘤发生过程 体外 和 体内^13,14,26这些细胞缺乏已建立的人类细胞系和PDX模型所具有的基因组复杂性，但能准确再现人类星形细胞瘤的组织病理学特征，需在免疫缺陷啮齿类动物中进行异种移植。 体内由于所有人源细胞模型都需要免疫缺陷型啮齿类宿主以防止免疫介导的异种移植物排斥反应，这些模型无法重现同基因系统中天然的肿瘤-间质相互作用，且缺乏完整的免疫系统，从而限制了针对间质和免疫调节疗法的临床前研究^10,11.

GEM 可用于研究预设的致癌突变组合所产生的表型后果 体内 在……期间 原位 肿瘤发生。非条件性基因工程小鼠（GEM）在发育过程中所有组织均携带突变，而条件性GEM具有两侧带有loxP位点的致癌等位基因，可通过使用细胞类型特异性启动子将Cre介导的重组限制在特定细胞类型中，从而实现对突变的靶向控制。^10,11,15,18条件性星形细胞瘤基因工程小鼠模型已被用于阐明致癌突变在完整大脑不同细胞类型中的功能作用¹¹. 临床前研究中的实用性 原位 使用条件性GEM研究胶质瘤发生受到多种因素的限制，包括1）缺乏一种 体外 相关性，2）难以生成具有复杂基因型的大型小鼠群体，3）潜伏期长 原位 肿瘤发展，4）以及随机性肿瘤进展。由于 原位 肿瘤发生缺乏相应的 体外 模型，药物测试 体外 无法通过传统的条件性GEM模型实现。与其他癌症不同，星形细胞瘤的条件性GEM模型极少由单一致癌突变诱导产生¹¹因此，需要复杂的育种方案来构建具有多个致癌突变的条件性GEM。此外，在这些模型中，星形细胞瘤的启动通常在较长的潜伏期后以可变的外显率发生，而向高级别星形细胞瘤的进展通常以非均一的、随机的方式进行，最终产生具有复杂基因组特征和快速生长动力学的肿瘤。^27,28条件性基因工程小鼠（GEM）模型中恶性进展的可变外显率和随机性，要求在将其纳入临床前药物试验前，必须通过放射影像学成像对每只小鼠进行个体化筛查，以检测高级别星形细胞瘤的存在及其位置。综上所述，这些局限性阻碍了临床前药物测试所需的大规模条件性GEM群体的生成与验证。

RCAS-tva 基因工程小鼠（GEM）系统利用禽类逆转录病毒（RCAS）载体感染经基因改造后在特定神经细胞类型中表达病毒受体（tva）的小鼠，已被广泛用于建立星形细胞瘤发生模型¹¹。与条件性基因工程小鼠模型相比，该系统能够在特定细胞类型中引入多个致癌突变，而无需复杂的育种方案。然而，该系统存在局限性，包括突变表型外显率不稳定、需要细胞处于活跃分裂状态才能实现病毒整合，以及外源基因随机插入宿主基因组等问题²⁹。

非生殖系GEM（nGEM）模型利用从GEM中获取的细胞构建，正变得日益重要，因其克服了其他模型系统的诸多局限性¹⁵起始细胞类型及共现突变在星形细胞瘤发病机制中的作用，难以通过已建立的人类胶质母细胞瘤（GBM）细胞系或患者来源的异种移植模型（PDX）加以确定，因为这些模型来源于终末期肿瘤，其在恶性进展过程中已在未明确定义的细胞类型中积累了大量遗传突变。相比之下，通过在特定纯化的脑细胞类型中诱导明确的遗传突变，可利用nGEM对所有级别的星形细胞瘤进行建模。^11,30因此，可以确定特定基因突变和细胞类型对细胞和分子表型的影响。 体外 和 体内与已建立的人源GBM细胞系相似，初始 体外 使用nGEM进行药物测试可用于优先筛选候选药物 体内 使用相同细胞进行测试。肿瘤发生 体内 然后可通过将nGEM细胞原位异体移植到免疫功能健全的同系同窝动物的脑内来确定³⁰因此，这些原位同种异体移植模型允许 体内 不仅可测试传统的细胞毒性药物和靶向治疗，还可评估免疫调节疗法和靶向肿瘤微环境的疗法。最后，通过比较在相同细胞类型中携带相同突变的nGEM模型与传统GEM模型的实验结果，能够确定微环境在肿瘤发生和进展中的作用。

我们及其他研究者已利用从GEM中分离的原代细胞（如星形胶质细胞、神经干细胞或少突胶质细胞前体细胞）建立了星形胶质瘤的nGEM模型^30-34开发星形细胞瘤nGEM的原理是创建一种模型，用于确定特定细胞类型中致癌突变的表型后果，该模型有望用于临床前药物测试。 体外 和 体内 在免疫功能健全的动物中。我们从不表达Cre、条件性GEM且维持在特定背景下的小鼠中分离获得表型为野生型的皮层星形胶质细胞和神经干细胞。 >94% C57/Bl6 背景，RB 通路条件性敲除 - Rb1^loxP/loxP，或 TgGZT₁₂₁ - 以及条件性敲除 RTK/RAS/PI3K 通路 - Nf1^loxP/loxP, Kras^G12D, Pten^loxP/loxP – 不同组合的基因^35-39我们诱导了基因重组 体外 使用编码Cre重组酶的腺病毒载体。由于皮层星形胶质细胞的分离物中含有多种细胞类型的混合物，我们采用了Ad5GFAPCre载体或显性致癌性转基因，例如 TgGZT₁₂₁ 由人 GFAP 启动子驱动，以富集 GFAP⁺ 这些培养物中的皮层星形胶质细胞。我们定义了G的表型后果₁/S（Rb）、MAPK 和 PI3K 通路突变在皮层星形胶质细胞和 NSC 中 体外 和 体内MAPK 和 PI3K 通路激活的 G1/S 期缺陷型星形胶质细胞在分子特征上模拟了人类前神经型胶质母细胞瘤，经原位注射后，可在预设位置形成肿瘤，具有均一的生长动力学、较短的潜伏期以及人类胶质母细胞瘤的组织病理学特征³⁰肿瘤生长的纵向监测 体内 通过标准化治疗组和定量分析治疗后的肿瘤生长情况，辅助临床前药物测试⁴⁰我们通过纵向生物发光成像检测表达荧光素酶的皮层星形胶质细胞注射小鼠的肿瘤生长动力学。因此，来源于条件性GEM的皮层星形胶质细胞和神经干细胞为定义与星形细胞瘤相关突变的功能后果提供了可操作的模型系统，并为临床前药物开发提供了潜在的模型平台。

方案

所有动物实验均经北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 培养新生小鼠皮层星形胶质细胞

1. 准备
   1. 将2-3张精细擦拭纸揉成团，放入盛有70%乙醇的锥形瓶底部。将解剖剪、弯头镊子和两对直头显微镊放入该锥形瓶中。擦拭纸用于防止显微镊尖端弯曲。
   2. 加入 1 ml 向60 mm组织培养皿中加入HBSS。每只动物准备单独的培养皿，并将培养皿置于冰上保存。
   3. 根据机构规定对动物进行麻醉。
   4. 为每只动物将 7 ml 含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM（完全 DMEM）预热至 37 °C 水浴。注意：对于5只小鼠，步骤1.1.1–1.1.4将耗时约15分钟。
2. 组织采集
   1. 按照机构规定处死新生小鼠（出生1-3天）。
   2. 将解剖剪从乙醇中取出，使其自然沥干，然后从脊髓至鼻部沿颅骨表面的皮肤做矢状切口。
   3. 沿矢状缝从脊髓端开始向嗅球前方延伸，在颅骨上做一切口。操作时应注意使剪刀尖端紧贴颅骨内表面，以尽量减少对脑组织的损伤。
   4. 使用弯头镊子，轻轻地将颅骨的每个半侧从大脑两侧剥离。
   5. 使用直型显微镊子，轻轻夹去每个大脑半球的背侧部分，并将其放入含有HBSS的组织培养皿中。注意避免触及小脑和嗅球，不要取胼胝体以下的任何组织。
   6. 使用解剖显微镜和两对显微镊子，轻轻去除每个大脑半球的脑膜。将组织培养皿放回冰上，直至开始组织匀浆。
   7. 对每只额外的动物重复步骤 1.2.1 至 1.2.6。注意：对于 5 只小鼠，步骤 1.2.1 至 1.2.7 约需 30 分钟。
3. 组织匀浆化
   1. 使用洁净的剃须刀片将大脑半球皮层精细切碎，并将培养皿转移至组织培养超净台。
   2. 将切碎的组织转移至无菌的15 ml锥形管中。用1 ml预冷的HBSS洗涤培养板，并将洗涤液转移至含有组织的管中。
   3. 等待组织沉降至管底，然后使用移液器小心吸除多余的HBSS。
   4. 加入 2 ml 室温的胰蛋白酶/EDTA 溶液，用移液器吹打约 10 次。 使用1 ml移液器进一步解离细胞。
   5. 将细胞悬液在37℃孵育 °在15至20分钟内保持C条件。每5分钟轻轻翻转混匀。
   6. 加入3 ml完全DMEM以抑制胰蛋白酶。用移液器吹打约10次。 使用1 ml移液器混匀溶液。
   7. 在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
   8. 用1 ml移液器吸除上清液。不要抽吸培养基，因为沉淀物可能较为松散。
   9. 将沉淀重悬于 4 ml 37 °C 完全 DMEM。将细胞悬液转移至 75 cm 带螺旋盖的组织培养瓶中。注意：对于 5 只小鼠，步骤 1.3.1–1.3.9 约需 50 分钟。
   10. 星形胶质细胞收获后约16小时，用4 ml 37℃的DPBS洗涤培养瓶 °C HBSS，然后加入 4 ml 的 37 °C 完全 DMEM。将皮质星形胶质细胞在 37 °C，5% CO₂₂注意：洗涤步骤对于去除培养皿中非贴壁细胞和碎片至关重要。
   11. 当细胞培养至约 95% 汇合时，于 37℃ 振荡过夜 °C，5% CO₂₂，移除含有脱落细胞的培养基，然后用 4 ml 37 ℃的预热 PBS 洗涤培养瓶 °C HBSS。加入4 ml 37 °C 完全 DMEM 培养基，于 37 ℃ 培养细胞 °C，5% CO₂₂注意：此步骤对于富集皮层星形胶质细胞培养物至关重要，因为通过该操作可使污染的微胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞脱落并从培养物中去除。⁴¹.
   12. 对每只动物重复步骤 1.3.1–1.3.11。
4. 诱导遗传重组
   1. 24 小时 完成步骤 1.3.11 后，将培养基更换为 2 ml 的 37 °C完全DMEM。 添加 37℃下1 ml °含1的C SCM µ升 >10¹⁰ 每毫升含 pfu 的 Ad5CMVCre 或 Ad5GFAPCre。在 32 ℃ 下孵育 6 小时 °C，5% CO₂₂.注意：操作重组腺病毒时需采取BSL2安全防护措施。
   2. 移除含有病毒的培养基，并加入37 °用不含病毒的完全DMEM培养基处理皮质星形胶质细胞。注意：操作重组腺病毒时需采取BSL2级生物安全防护措施，并根据机构规定处理含病毒的培养基。注：对于5个星形胶质细胞培养样本，步骤1.4.1至1.4.3（不含6小时孵育）约需15分钟。
   3. 扩增皮层星形胶质细胞培养物 体外 和 体内 表征。注意：通过使用针对重组基因的特异性引物进行PCR，或通过检测突变蛋白本身或其信号转导效应的免疫印迹法，确定Cre重组后突变的存在。皮层星形胶质细胞培养物在Cre重组后表型稳定所需的时间取决于所使用的突变类型，必须通过实验经验确定（图2）.

2. 从新生小鼠培养神经干细胞

1. 准备
   1. 开始解剖前，按每只脑组织准备4 ml消化液，将3.1 mg木瓜蛋白酶（papain）和1.3 mg半胱氨酸（cysteine）加入4 ml解离培养基中——含98 mM Na₂SO₄，30 mM K₂SO₄，5.8 mM MgCl₂，0.25 mM CaCl₂，1 mM HEPES （来自 1 M HEPES） pH 7.4 储液）20 mM 葡萄糖、0.001% 酚红和 0.125 mM NaOH。向解离液中加入木瓜蛋白酶和半胱氨酸后，溶液将变为黄色。
   2. 37℃孵育 °37°C 水浴中孵育 15 分钟。定期颠倒混匀。
   3. 逐滴加入 0.1 M NaOH，直至消化液恢复为浅红色。
   4. 在组织培养罩内，使用注射器滤器（0.22 μm）对消化液进行无菌过滤。 µm 孔径）。将消化液置于冰上。
   5. 准备50 ml干细胞培养基（SCM），将44.5 ml NSC基础培养基、5 ml NSC添加剂、0.5 ml青霉素-链霉素混合，50 µ0.2% 肝素，10 µ100 l µ微克/毫升 EGF，以及 10 µ100 l µg/ml bFGF。SCM 在 4℃ 保存时可稳定 1 周 °C.
   6. 通过混合50 ml 10x HBSS与1.25 ml 1 M HEPES制备完全HBSS（cHBSS） （pH 7.4）、15 ml 1 M D-葡萄糖、5 ml 100 mM CaCl₂₂，5 ml 100 mM MgSO₄₄，以及 2 ml 1 M NaHCO₃₃用ddH₂O定容至500 ml₂O.
   7. 用0.2 μm滤器对cHBSS进行过滤除菌 µm 孔径滤器过滤，4℃保存 °C.
   8. 将2-3张精细擦拭纸揉成团，放入盛有70%乙醇的锥形瓶底部。将解剖剪、弯头镊子和两对直头显微镊放入该锥形瓶中。擦拭纸用于防止显微镊尖端弯曲。注意：处理5只小鼠时，步骤2.1.1–2.1.8约需45分钟。
2. 组织采集
   1. 根据机构规定处死新生（第1-3天）小鼠。
   2. 将解剖剪从70%乙醇中取出，沥干后沿颅骨中线从脊髓至鼻部做一矢状切口。
   3. 沿矢状缝从脊髓端开始向嗅球前方延伸，在颅骨上做一切口。操作时应注意使剪刀尖端紧贴颅骨内表面，以尽量减少对脑组织的损伤。
   4. 使用弯头镊子，轻轻地将颅骨的每个半侧从大脑两侧剥离。
   5. 轻轻取出整个大脑，并置于冰上预冷的cHBSS中。
   6. 在解剖显微镜下，使用精细的解剖工具小心去除脑组织的脑膜。
   7. 将脑组织置于底面，使用11号手术刀进行垂直（冠状）切割，去除小脑/后脑和嗅球/额叶皮层。
   8. 将剩余的脑组织旋转90° 将其置于尾侧部分，从而获得脑的冠状切面。定位侧脑室。
   9. 切取包含脑室下区（SVZ）的立方体组织块。
   10. 将含有SVZ的组织转移至60 mm的组织培养皿中，加入新鲜的冰上预冷的cHBSS，并用11号手术刀将组织切碎。
   11. 将切碎的组织转移至无菌的15 ml离心管中，将离心管置于冰上。
   12. 用 1–2 ml 冰冷的 cHBSS 清洗培养皿，将洗涤液转移至含有组织的离心管中。
   13. 如有需要，对额外的新生小鼠重复步骤 2.2.1–2.2.12。将所有 15 ml 离心管转移至组织培养超净台中，以完成后续实验步骤。注意：对于 5 只小鼠，步骤 2.2.1–2.2.13 约需 45 分钟。
3. 组织匀浆化
   1. 将消化液（步骤 2.1.1 中配制）置于 37 °C水浴中孵育5分钟。同时，将每份脑组织对应的2 ml SCM在37 °C 水浴
   2. 用1 ml移液器小心移除组织匀浆的上清液，切勿抽吸。
   3. 加入 2 ml 37 °每15 ml离心管中加入C消化液，轻轻颠倒混匀。
   4. 37℃孵育 °37°C 水浴中孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻颠倒混匀一次。
   5. 再加入 2 ml 37 °向每根试管中加入 C 消化液，并重复步骤 2.3.4。
   6. 让细胞依靠重力沉降至管底，然后使用1 ml移液器吸除消化组织后的上清液。
   7. 加入 2 ml 的 10 µ将M E-64用cHBSS稀释，并通过倒置轻轻混匀。
   8. 室温孵育3分钟。
   9. 让细胞依靠重力沉降至管底，然后移除消化组织后的上清液。
   10. 加入1 ml 37 °用1 ml移液器吸头在c cHBSS中匀浆（约20次）。组织匀浆过程中避免引入气泡。
   11. 将组织匀浆液通过40 μm细胞滤筛 µm 孔径细胞滤筛，然后用 5 ml 37 °C cHBSS
   12. 将组织匀浆在125 × g条件下离心5分钟。
   13. 用1 ml移液器去除上清液的95%，注意不要扰动细胞沉淀。小心地将细胞沉淀重悬于200 μl中 µ37 l °C SCM，200 µ移液器吸头
   14. 加入 1.8 ml 37 °C SCM，将细胞悬液转移至无菌6孔板的一个孔中。注意：对于5只小鼠，步骤2.3.1–2.3.14约需75分钟。
4. 神经干细胞培养
   1. 3天后通过添加另外2 ml 37 °C SCM。
   2. 7天后，将神经球转移至15 ml离心管中，静置使其自然沉降 >5 分钟
   3. 去除上清液，加入 2 ml 37 °C SCM。
   4. 将神经球转移至6孔板的新孔中。
   5. 加入 2 ml 37 °每3-4天传代一次C SCM，每7天完全更换培养基。
   6. 如果神经球是 > 100 µ直径为 m，用干细胞解离液小心解离，并以所需细胞密度重新接种神经干细胞。
5. 诱导遗传重组
   1. 添加 37℃的1 ml °含1的C SCM µ升 >10¹⁰ 向细胞中现有的2 ml SCM中加入Ad5CMVCre或Ad5GFAPCre，使其终浓度为pfu/ml。注意：操作重组腺病毒时需采取BSL2级生物安全防护措施。
   2. 32℃孵育6小时 °C，5% CO₂₂.
   3. 将含神经球的SCM转移至15 ml离心管中，静置5分钟使神经球自然沉降。
   4. 先用1 ml移液器吸除上清液，再用200 μl移液器吸除残留上清 µl 移液器。注意：操作重组腺病毒时需采取BSL2安全防护措施，并根据机构规定处理含病毒的培养基。
   5. 加入 2 ml 37 °将不含病毒的C SCM转移至NSC，然后转入6孔板。注意：对于5个NSC培养样本，步骤2.5.1–2.5.5约需15分钟（不含6小时孵育时间）。
   6. 第二天，重复步骤 2.5.1–2.5.5，必要时进行神经球传代。神经球现在可传代扩增 2–3 代，之后 体外 小鼠脑内原位注射与表征 体内注意：通过使用针对重组基因的特异性引物进行PCR，或通过检测突变蛋白本身或其信号转导效应的免疫印迹法，确定Cre重组后突变的存在。NSC培养物在Cre重组后表型稳定所需的时间取决于所使用的突变类型，必须通过实验经验确定。图2 和 3).

3. 将重组细胞正位注射到受体免疫功能健全小鼠的脑内

1. 5% 甲基纤维素的制备
   1. 将5 g 15 cPs甲基纤维素粉末缓慢加入去离子水中，同时在100 ml螺口瓶中持续搅拌，定容至50 ml，4 ℃保存 °C以防止结块。在4℃下搅拌可能需要长达24小时。 °C，直至所有甲基纤维素完全溶解。
   2. 称量瓶子并记录重量。
   3. 高压灭菌5%甲基纤维素溶液。灭菌后，甲基纤维素将形成半固体凝胶。
   4. 称量瓶子并计算灭菌过程中损失的重量。
   5. 无菌条件下，每丢失1克体重，补充1毫升无菌水。
   6. 置于冰上，加入50 ml预冷的2倍浓度DMEM。
   7. 使用磁力搅拌器在4℃下搅拌过夜 °C. 采用无菌操作技术将5%甲基纤维素溶液分装为每份20 ml。分装后于4℃保存。 °C，最长可保存六个月或直至2x DMEM 会过期。注意：3.1.1–3.1.7 步骤中 5% 甲基纤维素溶液的制备约需 2.5 天。
2. 皮质星形胶质细胞的制备与注射
   1. 当皮质星形胶质细胞融合度达到约90%时进行收获。
   2. 收获时，吸除完全DMEM，用等体积的37 °C HBSS。
   3. 加入足量胰蛋白酶以覆盖培养皿表面。轻轻倾斜并敲击培养皿，直至细胞开始脱落。
   4. 用等体积的37℃预热的完全培养基终止胰蛋白酶消化 °完全DMEM培养基
   5. 将细胞转移至50 ml锥形管中，并用相同体积的37 °C 完全 DMEM，用于 3.2.4 节
   6. 将洗涤液转移至含有细胞的离心管中。在200 × g下离心3分钟。
   7. 吸弃上清液，将细胞重悬于1 ml 37 °完全DMEM培养基
   8. 使用血细胞计数板或其他合适的细胞计数仪对细胞悬液进行计数，以确定细胞数量/µl.
   9. 将所需数量的细胞转移至新的15 ml锥形管中，在200 × g下离心3分钟。
   10. 将细胞重悬于 800 µ37 分之 1 °C 完全 DMEM。确定细胞沉淀的体积（细胞悬液总体积减去 800） µl). 注意：注射时细胞浓度必须准确。因此，此步骤中必须确定细胞沉淀的体积，以便计算在步骤 3.2.12 中需加入的 5% 甲基纤维素的体积。
   11. 将细胞转移至无菌的1.5 ml微量离心管中，然后以200 × g离心3分钟。
   12. 吸弃细胞沉淀中的上清液，用适量预冷的5%甲基纤维素溶液（总体积减去细胞沉淀体积）重悬皮层星形胶质细胞，以获得所需浓度的细胞数/µl.
   13. 将细胞置于冰上直至注射。
   14. 将250 µ将玻璃注射器接入重复式抗原分配器，然后安装一支钝头18 G针头 将针头连接到注射器上。
   15. 缓慢抽出针筒活塞，使针头仍位于皮层星形胶质细胞悬液中；此时细胞上方会出现气泡，必须将其去除，因为气泡在注射过程中会被压缩，导致实际注入脑内的体积减少。
   16. 将针尖置于皮层星形胶质细胞悬液上方，迅速推动推杆。气泡的移动速度将快于细胞悬液，大部分气泡将被排出。
   17. 重复步骤 3.2.16，直至针头中的所有气泡完全排出。
   18. 将注射器填充至约 ~200 µl，然后将针头朝上，向后拉动活塞直至其停止。通过将针尖朝上并快速推动活塞约50次，可去除微小气泡。 µ然后缓慢回抽至完全容量。
   19. 保持尖端朝上，重复步骤 3.2.18 四到五次。
   20. 弃去18号针头，换上27 G针头 将针头连接到注射器上。
   21. 按下抗原分配器上的按钮，直至针头中有液体排出。注意：针对1种星形胶质细胞系，步骤3.2.1–3.2.21约需60分钟。
3. 注射用神经干细胞的制备
   1. 当神经球处于 > 100 µ直径为 m，转移至 15 ml 离心管中，静置使神经球自然沉降 >5 分钟
   2. 去除上清液，并使用温和的解离试剂（如干细胞解离溶液或accutase，按照制造商说明书操作）或含0.05%胰蛋白酶-EDTA进行神经球解离⁴².
   3. 根据制造商说明书抑制解离试剂的作用，避免神经干细胞接触血清。在100 × g下离心5分钟。
   4. 吸弃上清液，然后将细胞重悬于1 ml 37 °C cHBSS 以制备单细胞悬液。
   5. 使用血细胞计数板或其他适当的细胞计数仪对细胞进行计数，以确定每毫升细胞数量。µl.
   6. 将所需数量的NSC转移至新的15 ml锥形管中，以100 × g离心5分钟。
   7. 将细胞重悬于 800 µ37 分之 1 °C HBSS。确定细胞沉淀的体积（细胞悬液总体积减去800） µl). 注意：注射时细胞浓度必须准确。因此，此步骤中必须确定细胞沉淀的体积，以便计算在步骤 3.3.9 中需添加的 5% 甲基纤维素的体积。
   8. 将细胞转移至无菌的1.5 ml微量离心管中，然后以100 × g离心5分钟。
   9. 吸弃上清液，并按照 3.2.12–3.2.21 步骤完成细胞的原位注射前制备。注意：对于 1 种 NSC 细胞系，步骤 3.3.1–3.3.9 约需 60 分钟。
4. 小鼠注射前准备
   1. 根据机构IACUC指南，通过腹腔注射250 mg/kg Avertin（2,2,2-三溴乙醇）或100 mg/kg氯胺酮联合10 mg/kg赛拉嗪，对受体动物进行麻醉。 注意：本研究中使用3至6月龄小鼠作为异体移植宿主。也可使用不同年龄的小鼠，以研究发育性脑年龄的微环境影响对肿瘤发生的作用。
   2. 使用电推剪或剪刀剃除切口部位头皮上的毛发。
   3. 用70%乙醇和碘伏交替擦拭手术部位3次进行消毒。
   4. 涂抹眼用软膏以保护眼睛，防止因眨眼反射消失而造成损伤。
   5. 通过足底回缩（脚趾夹捏）反射评估麻醉深度。注意：对于5只小鼠，步骤3.4.1–3.4.5约需15分钟。
5. 原位移植
   1. 将动物固定在立体定位仪中。
   2. 在耳与眼之间的矢状缝上做一个长约0.5 cm的切口。
   3. 定位冠状缝与矢状缝的交点（前囟，Bregma），以及人字缝与矢状缝的交点（后囟，Lambda）。确保前囟（Bregma）与后囟（Lambda）处于同一水平面。
   4. 将含有细胞悬液的注射器和重复抗原分配器连接至头部上方的立体定位仪框架上。将27 G针头的尖端 将针尖与前囟点接触。该位置将作为三维坐标操作的原点。
   5. 将针尖略微抬离颅骨表面，从前囟点向外侧移动2 mm，向前移动1 mm。
   6. 小心地将针头穿过颅骨，到达前囟下方4 mm的目标位置。注：我们采用这些立体定位坐标以靶向基底神经节。若需研究不同脑区微环境对肿瘤发生的影响，可采用不同的立体定位坐标。
   7. 注射 5 µ通过启动重复抗原分配器一次，将细胞悬液注入。保持针头位置不动2分钟，以使颅内压力达到平衡。
   8. 在30秒内缓慢拔出针头。如有出血，使用棉签按压止血。
   9. 对合伤口边缘，使用组织粘合剂关闭切口。给予20 µ在切口部位皮下注射 l 剂量的利多卡因。注意：对于5只小鼠，步骤3.5.1–3.5.9约需50分钟。 北卡罗来纳大学动物护理和使用委员会（UNC IACUC）批准仅使用局部麻醉进行术后处理。 建议就该操作后镇痛剂使用的相关要求，咨询当地机构的IACUC。
6. 术后护理
   1. 将动物置于干净且温暖的笼子中恢复。不应将动物直接放置在垫料上，以免发生意外吸入。
   2. 观察动物是否恢复正常的活动行为，例如理毛、进食和排便。注：恢复正常行为可能需要约60分钟。

结果

我们开发了一种nGEM模型系统，该系统采用来自携带floxed条件性致癌等位基因的新生GEM的皮层星形胶质细胞和NSC，可进行表型表征 体外 和 体内 (图1). 为了专门研究癌基因突变在皮层星形胶质细胞中的影响 体外, 首先对星形胶质细胞进行富集至关重要。皮层星形胶质细胞收获物中包含小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞（OPC）和神经元的混合物，但可通过机械和遗传方法实现星形胶质细胞的富集。在常规培养条件下，神经元会死亡，而小胶质细胞和少突胶质细胞可通过过夜震荡去除^41,43此外，针对GFAP的floxed致癌等位基因的遗传重组⁺ 使用 Ad5GFAPCre 可富集星形胶质细胞。我们采用该方法感染 Rb1 的皮层组织收获物^loxP/loxP 带有 Nf1 基因条件性等位基因的小鼠幼崽^loxP/loxP 和/或 Pten^loxP/loxP 等位基因。Ad5GFAPCre 感染在重组的 GFAP 中导致增殖优势^+<...

讨论

确保正确收获和培养皮层星形胶质细胞最关键的步骤包括：1）切除大脑皮层时避免取到胼胝体下方的组织，2）彻底去除脑膜，3）充分解离细胞，以及4）富集GFAP阳性细胞。⁺ 星形胶质细胞。尽管我们采用了机械法（振荡）和遗传学方法（利用Ad5GFAPCre载体限制基因重组或使用显性转化转基因）TgGZT₁₂₁）在下 GFAP 启动子对照）方法富集GFAP⁺ 星形胶质细胞，其他技术已被用于纯化皮层星形胶质细胞。例如，可通过用有丝分裂抑制剂处理汇合培养物，随后加入L-亮氨酸甲酯，以去除污染的微胶质细胞⁴⁷在含血清培养基中通过机械法纯化并培养的星形胶质细胞，其形态和表达谱与急性分离的星形胶质细胞存在差异，前者被认为可能代表较不成熟的星形胶质细胞或反应性星形胶质细胞表型^48,49最近，已开发出一种免疫筛选方法，可前瞻性地纯化皮层啮齿类动物星形胶质细胞，当在添加生长因子且不含血清的培养基中培养时，其表达谱更接近于急性分离纯化的星形胶质细胞⁴⁹传统机械法与近期发展的免疫pan...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM高糖培养基（1X）	Invitrogen	11995065	DMEM也可从其他供应商购买，包括GIBCO Sigma和Cellgro
胎牛血清，常规型	Cellgro	35-010-CV
青霉素-链霉素溶液	Invitrogen	15140122
尖头解剖剪刀	Fisher Scientific	08-395
弯头软骨镊	Fisher Scientific	1631
Miltex 17-301 型珠宝镊，精细，4号	Miltex	17-301
乙醇（200 proof）	Decon Labs	2710
剃须刀片	VWR	55411-050
汉克平衡盐溶液（HBSS）（1x），液体	Invitrogen	14175-095
TrypLE Express（1x），含酚红	Invitrogen	12605-010	其他胰蛋白酶溶液也适用于皮层星形胶质细胞的分离与培养
培养皿，60 × 15 mm	Thomas Scientific	9380H77
15 ml 离心管	BD Biosciences	352096
50 ml 离心管	BD Biosciences	352070
腺病毒原液	Gene Transfer Vector Core, U. Iowa	Ad5CMVCre	分装为5 µl 每管，-80 °C保存。具有危险性。需采用BSL2级安全防护措施
硫酸钠（Na2SO4）	Sigma-Aldrich	238597
硫酸钾（K2SO4）	Sigma-Aldrich	221325
氯化镁（MgCl2）	Sigma-Aldrich	M8266
氯化钙（CaCl2）	Sigma-Aldrich	746495
HEPES钾盐	Sigma-Aldrich	H0527
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
酚红	Sigma-Aldrich	P3532
氢氧化钠（NaOH）	Sigma-Aldrich	S5881
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003127
L-半胱氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	C1276
注射器滤器（0.22 µm 孔径）	Millipore	SLGP033NS
NeuroCult增殖培养基试剂盒（小鼠）	Stemcell Technologies	5702	该试剂盒包含神经干细胞（NSC）培养所需的NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC补充剂
0.2% 肝素溶液	Stemcell Technologies	7980
EGF	Invitrogen	PMG8041
bFGF	Invitrogen	PHG0261
汉克平衡盐溶液（HBSS）（10x）	Invitrogen	14185-052
硫酸镁（MgSO4）	Sigma-Aldrich	M7506
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S5761
E-64	Sigma-Aldrich	E3132	用DMSO配制成10 mM储存液，-20 °C保存
6孔板	Fisher Scientific	07-200-83
细胞筛（40 µm 孔径）	Corning	352340
干细胞解离溶液	Stemcell Technologies	5707	也可使用温和的酶解溶液，如Accutase
甲基纤维素 15 cP	Sigma-Aldrich	M7027
DMEM培养基 2x	Millipore	SLM-202-B	用于配制5%甲基纤维素溶液
1.7 ml 带盖微量离心管	Corning	3620
Hamilton微量注射器，250 µl LT，无针头	Fisher Scientific	14-815-92
PB600-1 抗原分配器	Hamilton	83700
一次性18 G针头	Fisher Scientific	NC9015638
27号，1/2" 鲁尔接头针头	Fisher Scientific	14-826-48
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402
聚维酮碘	Fisher Scientific	NC9386574
普拉露眼用软膏	Fisher Scientific	NC9689910
Model 900 立体定位仪	Kopf Instruments
VETBOND	Fisher Scientific	NC9259532	组织粘合剂
利多卡因	ShopMedVet	RXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）	Promega	G3580
抗Sox2抗体	Millipore	AB5603
兔多克隆抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体	Dako	Z0334
IVIS Kinetic	PerkinElmer		用于in vivo成像
D-荧光素钾盐生物发光底物	PerkinElmer	122796	用于in vivo生物发光成像
EdU成像试剂盒	Invitrogen	C10340
MSCV 荧光素酶 PGK-潮霉素抗性载体	Addgene	18782