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生理流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞间连接的实时成像

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DOI：

10.3791/51766

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2014年8月14日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

白细胞通过细胞旁路或跨细胞途径穿过内皮单层。我们建立了一种简单的方法，用于在生理流动条件下追踪内源性连接蛋白VE-cadherin和PECAM-1在白细胞跨内皮迁移过程中的分布，以区分这两种迁移途径。

摘要

在炎症过程中，白细胞离开血液循环，穿过内皮层，进入下方组织以抵御入侵的病原体。这一过程称为白细胞跨内皮迁移。已有研究描述了白细胞穿越内皮单层的两条途径：细胞旁途径， 即， 通过细胞间连接和跨细胞途径 即， 穿过内皮细胞本体。然而，区分细胞旁路和跨细胞途径在技术上一直存在困难。我们开发了一种简单的方法 体外 一种用于在生理流动条件下研究中性粒细胞跨内皮迁移过程中内源性VE-cadherin和PECAM-1分布的检测方法。在中性粒细胞灌注前，内皮细胞经荧光标记的抗VE-cadherin和抗PECAM-1抗体短暂处理。通过细胞-基底电阻力感应和荧光漂白后恢复（FRAP）实验测定，这些抗体不影响两种蛋白的功能。利用该检测方法，我们能够在流动条件下追踪内源性VE-cadherin和PECAM-1在跨内皮迁移过程中的分布，并区分白细胞穿越内皮层的旁细胞和跨细胞迁移途径。

引言

白细胞跨内皮迁移（TEM）的高效且严密调控在免疫监视和急性炎症等生理过程中具有关键意义。然而，在某些病理生理条件下，会出现不受控制且过度的跨内皮迁移，导致慢性炎症性疾病（例如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘）。此外，在肿瘤细胞转移过程中，跨内皮迁移也是肿瘤细胞离开血液循环并发生转移的关键步骤1-3。为了特异性干预过度的白细胞或肿瘤细胞跨内皮迁移，必须深入理解该过程的调控机制。

人们认为，跨内皮迁移（TEM）过程通过多个不同步骤发生。Butcher 和 Springer 在二十年前综述的开创性研究，提出了描述 TEM 过程的多步骤模型。4,5该模型仍然成立，尽管已加入了一些额外的步骤6. Alon 等 描述了内皮细胞表面需要存在固定的趋化因子7最近，他们发现内皮细胞自身能够产生趋化因子，并将其呈递于内皮细胞的顶膜表面。8此外，该研究团队还提出了流动条件在透射电子显微镜（TEM）过程中的重要性。7最近，一些出版物聚焦于白细胞在跨内皮迁移（TEM）最后穿出阶段可采取的两条不同路径。它们可以穿过细胞间连接， 即， 细胞旁迁移途径，或穿过内皮细胞体的迁移途径，称为跨细胞迁移途径9卡曼及其同事深入研究了这些通路，得出结论：白细胞在穿过脐静脉内皮单层时，优先选择细胞旁迁移途径（占90%），而非跨细胞途径（占10%）。10然而，当使用其他来源的内皮细胞时， 例如， 脑或微血管中，更多的白细胞采用穿细胞途径（30%）11Vestweber 研究组最近研究表明，在使用基因敲入动物模型、以 VE-cadherin-α-catenin 嵌合蛋白替代内源性 VE-cadherin 后，细胞间连接无法彼此解离，白细胞跨内皮迁移（TEM）被完全阻断。12令人意外的是，作者注意到跨内皮迁移在某些但并非所有组织中受到阻断。总体而言，这些精巧的实验表明，白细胞更倾向于选择细胞间途径而非跨细胞途径，尽管触发这一选择的调控信号目前仍不清楚。

尽管大多数白细胞倾向于选择细胞旁迁移途径，但目前仍难以区分这两种迁移路径。此外，尽管已有若干研究聚焦于内皮细胞间连接的作用，但在白细胞穿越过程中，这些连接结构（特别是连接蛋白 VE-cadherin 和 PECAM-1）的动态变化仍存在争议。我们开发了一种相对简单的实验方法，可在生理流动条件下，利用荧光标记抗体实时监测白细胞穿内皮迁移过程中连接分子的动态变化。这些抗体不会干扰或破坏目标蛋白的连接完整性或移动性。该方法使我们能够追踪细胞旁穿内皮迁移过程中连接蛋白的动态行为，同时还能有效区分细胞旁和跨细胞迁移路径。

方案

中性粒细胞来自已签署知情同意书的健康志愿者 。研究实施过程符合机构和国家关于人类福利的指导方针。

1. 人脐静脉内皮细胞的接种与培养

  1. 培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 按照制造商说明书操作。将 HUVECs 细胞培养于纤连蛋白（FN）包被的培养皿中（10 μg/ml，溶于去离子水），培养基为内皮基础培养基（Endothelial Basal Medium，EBM-2）并添加内皮生长培养基（Endothelial Growth Medium，EGM-2）单份添加剂。实验所用细胞培养代数控制在第 4 至第 8 代之间。
  2. 第1天：用100 μl包被流式细胞室 纤连蛋白（10 μg/ml） 在37 °C、5% CO₂条件下，于PBS中孵育至少2小时2.
  3. 第2天：当细胞达到80–90%汇合度时，用室温磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）小心洗涤细胞，胰蛋白酶消化，800 × g 离心，重悬于800,000个细胞/mL的培养基中 使用培养基。在纤维连接蛋白（FN）包被的流动小室的每个通道中接种80,000个细胞，并轻轻吹打细胞悬液数次。过夜培养。 在37 °C、5% CO₂的培养箱中2.
  4. 第3天：将流动室载玻片轻轻倾斜至45°角，更换培养基。（参见 图1A).
    注意：建议仅移除储液池中的培养基，而不要移除微通道内的培养基。移除通道内的培养基可能会因液体拖拽力导致内皮细胞脱落和死亡 由移液操作引起。
  5. 通过相差显微镜检查内皮细胞是否已形成单层即， 100% 汇合度）。如果细胞未达到 100% 汇合度，则每天更换两次培养基，直至细胞达到 100% 汇合。
  6. 待细胞达到汇合状态后，使用含有炎症介质（TNF-α（10 ng/ml））的培养基（见步骤1.1）刺激细胞。将HUVECs刺激过夜（O/N）即， 12 小时）的 TNF-α 处理可诱导内皮细胞呈现炎症表型， 即，例如 ICAM-1 和 VCAM-1 等细胞黏附分子的上调 13.

2. 使用Percoll梯度分离多形核白细胞

  1. 在分离多形核白细胞（PMN）前，配制N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）缓冲液（以下简称：流式缓冲液）。流式缓冲液用于洗涤分离得到的PMN，并作为流式实验中的缓冲体系。配制流式缓冲液的方法如下：称取7.72 g NaCl（132 mM）、4.76 g HEPES（20 mM）、0.45 g KCl（6 mM）、0.25 g MgSO₄·7H₂O（1 mM）、0.27 g CaCl₂·2H₂O（1.3 mM）和2.0 g葡萄糖（11 mM），溶于800 mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.4，补加去离子水定容至1 L，过滤除菌，4 °C保存。4•7H2O (1 mM), K2HPO4•3H2O (1.2 mM) 溶于 1 L 去离子水中，调节 pH 至 7.4（该储备液可在 4 °C 保存数周）。
  2. 加入新鲜的 100 μl 1 M CaCl2 （1 mM），2.5 ml 200 g/L 人血清白蛋白储备液（0.5% v/v）及 0.1 g 葡萄糖加至 100 ml (0.1% w/v) 流动相缓冲液。接着，使用 0.45 μm 滤膜过滤流动相缓冲液。注意：该流动相缓冲液需每次实验前新鲜配制。
  3. 在分离中性粒细胞（PMN）之前，用 PBS 配制 pH 7.4 的 10% 枸橼酸三钠（TNC）溶液。
  4. 收集 20 ml 采用含钠肝素的真空采血管从健康志愿者采集全血。用10% PBS/TNC将全血按1:1体积比稀释至50 ml 试管和移液管 20 ml 稀释后的血液小心地加入12.5 ml Percoll（一种水中胶体溶液，质量分数为23%） 密度为1.130 g/ml）置于新的50 ml 离心管。将离心管小心放入离心机，于室温下以800 × g离心20分钟，加速度设为低速，不启用刹车。
    注意：将稀释后的血液加入Percoll时，将含有Percoll的试管倾斜至45°角，并使用移液器最慢的流速轻轻将稀释血液沿管壁加入。
  5. 移除所有液体，随后向管中加入冰冻的红细胞裂解缓冲液（4.15 g NH₄Cl）。4Cl [0.155 M]，0.5 g KHCO₃3 [0.01 M] 和 18.5 mg EDTA（三重 III）[0.1 mM] 至 500 ml 冰冻的 H2O）裂解红细胞。将离心管置于冰上，期间偶尔颠倒混匀，直至悬液变为深红色，随后在4°C下以500 × g离心5分钟，开启刹车。
    注意：沉淀部分包含中性粒细胞（PMNs，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）以及红细胞。
  6. 移去上清液，用预冷的裂解缓冲液在4 °C、500 × g条件下离心5分钟，洗涤沉淀物两次。
  7. 将沉淀物在室温下用流式缓冲液重悬，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定中性粒细胞（PMNs）浓度。用流式缓冲液将中性粒细胞（PMNs）重悬至浓度为 1 × 10⁶ 个/mL。6 细胞/毫升 并在室温下保存。

3. 内皮细胞连接处VE-钙黏蛋白和PECAM-1的标记

  1. 向 HUVEC 培养基（见步骤 1.1）中加入 PECAM Alexa Fluor 647 抗体（克隆号 WM59），稀释比例为 1:100，同时加入钙离子非依赖性 VE-钙黏蛋白-FITC 抗体（克隆号 55-7H1），稀释比例为 1:50，于开始流动实验前孵育 30 分钟，以在生理流动条件下观察中性粒细胞跨内皮迁移过程中内皮细胞连接动态变化。
    注意：在将直接标记的抗体加入流动腔室之前，确保每个通道内的液体体积不超过 100 μl。这有助于尽可能降低 抗体使用成本。

4. 流动条件下的中性粒细胞跨内皮迁移检测

  1. 将中性粒细胞置于37 °C水浴中孵育15分钟，然后再注入流式系统。
  2. 将管路连接至一个空的流式室，并用温热（例如， 37 °C）的流动缓冲液（见步骤 4.3），以防止在搭建流动系统时产生气泡。
  3. 使用硅胶管将一个空的流动室的一端连接到注射泵流动系统 含有 20 ml 注射器，并将流室置于显微镜载物台上。
  4. 将空流室的另一端连接至装有37 °C流动缓冲液的储液烧瓶图1B）并启动注射泵，以流动缓冲液充满所有管路。泵将从储液器通过流动室抽取流动缓冲液 注射器中。注：该管路还包含一个内置鲁尔注射口，可在不中断流体流动和避免产生气泡的情况下，用注射针将中性粒细胞注入正在进行的实验中。
  5. 将空的流室替换为含有经TNF-α处理的HUVECs的流室，连接装有流动缓冲液的管路，并将其置于显微镜载物台上图1C夹住管路后再断开并重新连接至含有 HUVECs 的腔室，若不夹住管路，可能导致管路和/或流动腔内产生气泡。
  6. 将流速调节至 1 dyn/cm2，符合毛细血管后微静脉中的生理流速（1-5 dyn/cm）2).
  7. 使用共聚焦激光扫描显微镜同时记录微分干涉差（DIC）、FITC（488 nm）和Alexa Fluor 647（647 nm）信号。
  8. 缓慢将中性粒细胞（步骤 4.1）注入流体系统 通过 内联鲁尔注射端口（图1D) 使用 1 ml 注射器
  9. 数分钟后，白细胞出现、黏附并发生跨内皮迁移。通过将管路从流动腔室上断开，并用移液器将固定液（PBS 中含 3.7% 甲醛）加入流动腔室，可在任意所需时间点终止实验。固定 10 分钟后，用 PBS 洗涤。使用成像软件分析数据（参见材料与设备） 表）。
    注意：使用配备气候箱的共聚焦激光扫描显微镜进行本实验 在37 °C恒温、5% CO₂条件下2, 和63倍 油镜

结果

我们首先检测了抗体是否会影响内皮细胞屏障功能。通过使用细胞电阻抗传感技术（ECIS）测量内皮单层的电阻。详细方法见 Van Buul et al.13 。当将荧光标记的抗VE-钙黏蛋白抗体加入细胞后，未观察到电阻发生改变（图2A）。而一种已知可有效阻断VE-钙黏蛋白功能的抗VE-钙黏蛋白抗体则显著降低了电阻（图2A）。此外，用于成像的抗体并不影响VE-钙黏蛋白的动力学行为，这一点通过检测VE-钙黏蛋白-GFP光漂白后的荧光恢复（FRAP）得以验证（图2B）。

1-2 分钟后，中性粒细胞黏附至活化的内皮单层，可在 DIC 通道中观察到这一现象（图 3A）。在爬行 5-30 秒后，绝大多数中性粒细胞通过细胞间连接处穿过内皮单层，这些连接处已被针对 PECAM-1 和 VE-cadherin 的抗体标记。在穿胞过程中，实时追踪了 VE-cadherin 和 PECAM-1 的分布变化（图 3B）。在中性粒细胞穿胞位点，VE-cadherin 局部中断，而 PECAM-1 呈现出更明显的环状结构。穿胞完成后，细胞连接重新闭合，VE-cadherin 和 PECAM-1 明显在穿胞位点处重新定位（图 3C）。需要注意的是，当中性粒细胞到达内皮的基底外侧时，部分抗 PECAM-1 抗体可在中性粒细胞表面被检测到。然而，这并未阻碍中性粒细胞穿越内皮。在中性粒细胞跨内皮迁移过程中对 VE-cadherin 进行的实时动态观察结果与 Shaw 及其同事的研究一致，他们利用共聚焦显微镜和转染了 VE-cadherin-GFP 的内皮细胞表明，当白细胞穿过内皮细胞间连接时，VE-cadherin-GFP 会发生侧向扩散14。Su 及其同事的研究也支持我们对 PECAM-1 的观察结果，他们发现除了白细胞通过时 VE-cadherin 发生侧向扩散外，PECAM-1 还会在局部重新分布，形成围绕迁移中性粒细胞的环状结构15。

多通道移液器操作、显微镜及用于流体分析的管路装置，展示于实验室环境中。
图 1. 体外 流动腔室系统。（A）箭头指示用于补充培养基的储液槽。（B）连接流动腔室与在线鲁尔注射口的硅胶管路，用于在不中断管路连接的情况下注入中性粒细胞（箭头所示）。（C）空的流动腔室与盛有 37 °C 流动缓冲液的储液瓶相连（箭头所示）。（D）含有经 TNF-α 处理的 HUVECs 的流动腔室与含流动缓冲液的管路连接，并置于显微镜载物台上（箭头所示）。

电阻和FRAP分析图；阻抗随时间变化曲线及荧光恢复曲线。
图2. VE-钙黏蛋白抗体不影响细胞连接的动态变化或功能。（A）使用ECIS测量内皮细胞单层的阻抗。Y轴表示以欧姆（Ohms）为单位的阻抗值，X轴表示以小时为单位的时间。标记为ALEXA647的VE-钙黏蛋白抗体克隆55-7H1（蓝线）以及同型IgG-ALEXA647对照（红线）均未改变内皮细胞单层的阻抗，而VE-钙黏蛋白阻断性抗体cl75（黑线）则导致阻抗下降。（B）在HUVEC细胞中表达VE-钙黏蛋白-GFP，通过共聚焦显微镜进行FRAP分析，结果显示，在存在或不存在VE-钙黏蛋白55-7H1抗体的情况下，荧光恢复均未发生改变。

荧光显微镜：PECAM-1 Alexa 647，VE-Cadherin FITC，DIC，合并图像；细胞相互作用研究。
图3. 中性粒细胞跨内皮迁移（TEM）过程中VE-钙黏蛋白和PECAM-1分布的实时观察。（A）中性粒细胞（以白线标记）黏附于内皮细胞上，并穿过细胞间连接，但未影响VE-钙黏蛋白和PECAM-1的分布。（B）中性粒细胞通过细胞间连接穿过内皮单层。当中性粒细胞突出穿过细胞间连接时，可观察到VE-钙黏蛋白和PECAM-1在局部发生弥散。白线表示中性粒细胞仍位于内皮细胞上方的部分；黄线显示中性粒细胞膜已位于内皮细胞下方。（C）中性粒细胞已完全穿过内皮单层。VE-钙黏蛋白和PECAM-1重新定位于穿出部位。黄线标示已迁移中性粒细胞的边界。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在本实验方案中，防止流室中形成气泡至关重要，因为气泡会导致细胞凋亡以及单层细胞层的破坏。为避免此问题，需特别关注步骤 4.2 和 4.5，即连接流室管路的操作。本方案中的另一个关键步骤是，在将中性粒细胞（PMNs）注入流室前（步骤 4.1），将其在室温下保存后于 37 °C 孵育 15–30 分钟以进行预激活。此过程可激活白细胞整合素，使其能够黏附于内皮细胞表面的黏附分子（如 ICAM-1 或 VCAM-1）。

本方案不仅限于研究中性粒细胞的跨内皮迁移，也可用于其他白细胞类型，如单核细胞或淋巴细胞。请注意步骤4.1， 即， 不同类型的白细胞，其活化方式可能有所不同。此外，也可使用其他类型的内皮细胞。在此过程中，关键步骤是使用适当的炎症刺激物（如TNF-α或IL-1β）对内皮细胞进行刺激。若中性粒细胞未表现出迁移反应，可考虑用N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸（fMLP）肽短暂处理中性粒细胞（5分钟）16这将进一步刺激中性粒细胞，尤其是其整合素，使其更易于黏附于内皮细胞。

通常使用 1 dyn/cm2 的流速。该流速是在毛细血管后微静脉中测得的，这些部位是大多数白细胞跨内皮迁移发生的位置17。使用所述的流动腔室，可将流速提高至 10 dyn/cm2。然而，不建议进一步增加剪切力，否则可能导致管路意外泄漏以及细胞从流动腔室脱落。

所述结果 图3 表明这些抗体可用于可视化并研究白细胞穿渗过程中内皮细胞间连接的动态变化。特别是，除了现有的跨内皮迁移检测方法外，本方案还可在生理流动条件下实时区分旁细胞迁移与跨细胞迁移。由于这些抗体可标记细胞间连接，因此可以统计穿过VE-cadherin/PECAM-1阳性连接处的白细胞数量，与穿过VE-cadherin/PECAM-1阴性位点的数量进行比较。通过这种方法，可有效区分跨细胞迁移与旁细胞迁移。

需要强调的是，这些抗体不会干扰其所结合蛋白的功能：本研究中使用的 PECAM-1 抗体靶向的是其第二个胞外结构域。在抗体存在下接种的内皮细胞在铺展或形成单层方面未表现出任何缺陷，表明该抗体至少未干扰内皮细胞之间的同型相互作用。此外，这两种抗体均未影响中性粒细胞穿过内皮单层的能力。重要的是，无论是否存在这些抗体，穿过内皮单层的中性粒细胞数量均未发生改变（数据未显示）。值得注意的是，共聚焦激光扫描显微镜使我们能够同时记录不同的荧光通道和微分干涉差（DIC）图像。

因此, 该实验可同时研究中性粒细胞穿越内皮细胞间连接时VE-cadherin与PECAM-1的动态变化，有助于阐明白细胞为何选择其中一种途径而非另一种。 即， 旁细胞途径与跨细胞途径

披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

作者感谢 P.L. Hordijk 博士对稿件的审阅。AED 由兰德施泰纳输血研究基金会（LSBR）资助（项目编号 #1028）。JK 由荷兰心脏基金会资助（项目编号 2005T3901）。JDvB 是荷兰心脏基金会（NHS）Dekker 奖学金获得者（项目编号 #2005T039）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
μ-第六张幻灯片IBIDI80606流室
0.45 μm 滤膜 Whatman/GE Lifesciences10462100
1 ml 注射器 BD Plastipak300013
20 ml 注射器 BD Discardit II366296
21 G 针头 BD Microlance301155
白蛋白 Sanquin15522644
氯化铵（NH₄Cl）4Cl默克1009245000
氯化钙（CaCl2)Sigma-Aldrich449709
EBM-2 基础培养基 + EGM-2 SingleQuot 试剂盒添加剂 &和生长因子LonzaCC-3156 + CC-4176培养基
EDTA（滴定曲III）默克1370041000
Falcon管 康宁生命科学352096
纤连蛋白Sigma-AldrichF1141-2MGFN
葡萄糖Sigma-AldrichG7528
HEPESSigma-AldrichH3375
直通式鲁尔注射端口 IBIDI10820
七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4•7H2O默克105886
PECAM-1-ALEXA-647 BD Pharmingen561654克隆 WM59
Percoll GE Healthcare Life Sciences17-0891-09
磷酸盐缓冲液Fresenius Kabi  荷兰M090001/01NLPBS
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541
碳酸氢钾（KHCO₃）3)默克1048540500
磷酸氢二钾三水合物（K2HPO4)Sigma-AldrichP5504
硅胶Tygon 3350管VWR228-4331导管
氯化钠（NaCl）Calbiochem（Millipore）567441
注射泵 哈佛仪器型号 55-5920
TNF-α Peprotech300-01A肿瘤坏死因子
柠檬酸三钠 默克1.06447.5000TNC
Vacuettes德国格雷纳980044
VE-钙黏蛋白-FITC BD Pharmingen560411克隆 55-7H1
Zeiss LSM510 META 卡尔·蔡司显微成像公司，耶拿，德国
Zen 软件 2008卡尔·蔡司显微成像公司，耶拿，德国

参考文献

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VE PECAM 1 TNF

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