单纳米荧光成像（FIONA）

摘要

利用FIONA技术可实现单个荧光分子的纳米级精确定位。本文介绍了FIONA技术的基本原理，并详细描述了如何开展FIONA实验。

摘要

纳米级精度荧光成像（FIONA）是一种简单而实用的技术，可用于在x-y平面内以纳米级精度定位单个荧光分子。本文概述了FIONA技术的基本原理，并简要介绍了利用FIONA开展的一些研究实例。首先，介绍了如何搭建FIONA实验所需的设备， 即，描述了一种全内反射荧光显微镜（TIRFM）技术，并详细介绍了光学系统的对准方法。随后展示了如何采用适当方案对固定化的Cy3标记DNA单分子进行简单的FIONA实验，以实现精确定位；接着说明了如何利用FIONA测量以量子点标记的单个截短型肌球蛋白Va马达的36 nm步长。最后，报道了近期将FIONA技术拓展应用于厚样品的研究进展。结果表明，通过使用水浸物镜，并将量子点浸入溶胶-凝胶以及兔眼角膜深层组织中，可实现对较厚样品中单分子的高精度定位。>200 µm）时，可实现2-3 nm的定位精度。

引言

约在1882年，恩斯特·阿贝发现可见光显微镜的分辨率约为λ/2NA，即约200 nm（其中λ为波长，NA为数值孔径）。^1,2因此，任何小于该尺寸的物体在光学显微镜下均会呈现为一个受衍射极限限制的光斑。然而，可以以高得多的精度确定该光斑的中心位置，即物体的实际位置。³单荧光分子纳米级精确定位技术（FIONA）是一种简单而实用的技术，可在x-y平面内以纳米级精度对单个荧光分子进行定位。⁴定位精度，σ_µ (即，均值的标准误差）取决于收集到的光子总数， ，其中 N 为光子计数，s 为荧光斑点的标准差，a 为成像探测器的像素尺寸，b 为背景的标准差^3,4对于发射约 10,000 个光子的荧光染料，FIONA 可实现约 1 nm 的定位精度⁴.

方案

伦理声明：兔角膜组织的采集遵循伊利诺伊大学动物护理和使用机构指南。

1. TIRFM 装置设置

注意：始终佩戴激光安全护目镜。

1. 确保材料清单中所列的所有必要光学元件均已备齐并准备进行准直。如有需要，可使用其他公司功能相当的替代品。确保反射镜和透镜具有与所用激光器匹配的抗反射（AR）涂层。
2. 将所有光学元件的高度调节至显微镜后端口中心的高度。
3. 安装激光器、激光快门和中性密度（ND）滤光片。使用ND滤光片将激光功率尽可能降低，同时保持光束可见。使用合适的六角扳手拧紧螺丝。
4. 规划光路路径，并在光学平台上用胶带或标记笔标出（图1中的蓝色虚线）。为简化操作，沿光学平台上的孔阵直线布置光路。
5. 将反射镜M1（图1）放置在第一个直角转折处。在计划光路的第二段直线部分放置两个光阑。调整M1的位置和倾斜角度，使激光穿过两个光阑。
6. 将反射镜M2（图1）放置在第二个直角转折处。在光路的第三段直线部分放置10倍扩束镜（L1和L2，图1）。调整其倾斜角度，使扩束镜与光学平台和计划光路均保持平行。
   1. 反复调整M1和M2，使激光笔直穿过扩束镜两片透镜的中心。重复此步骤，直至扩束....

结果

典型的物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）装置如图3所示。首先对表面固定的Cy3-DNA样品进行成像，典型图像如图4a所示。该图像的曝光时间为0.5秒，EM增益为50，相机的CCD灵敏度为12.13。单个Cy3-DNA分子的点扩散函数（PSF）如图4b所示（来自图4a中箭头所指的斑点），其中颜色条表示像素强度的尺度。实际光子数可通过将像素强度乘以转换因子α = CCD灵敏度 / EM增益来计算。该斑点包含约14,000个光子（经背景校正后）。

然后使用二维高斯函数 f(x,y) = z 对点扩散函数（PSF）进行拟合₀ + A·exp(-(x-µ_x)² / (2秒_x²) - (y-µ_y)² / (2秒_y²），如图所示 图 4c

讨论

FIONA 是一种能够以纳米级精度和低至 1 毫秒时间分辨率定位荧光发射源（有机荧光团或量子点）位置的技术^4-8。当收集到足够光子时，该技术可比衍射极限（约 200 nm）更精确地确定荧光发射源的位置，从而为观察传统光学显微镜无法分辨的结构提供了途径^4-8。自发明以来，FIONA 已成功应用于观测多种分子马达的运动行为，如肌球蛋白和驱动蛋白。近年来，该技术结合其他研究^3,19，进一步推动了某些新兴超分辨率成像技术（如 STORM 和 PALM）中的定位过程^13-16。

实现FIONA的关键步骤在于收集光子的数量，该数量受多种因素影响。例如，用于FIONA实验的TIRFM装置应精确对准，以获得良好的PSF（即 未拉伸，未染色 等等。）时，即可获得合理的信噪比。此外，应使用数值孔径（NA）较高的物镜，以尽可能多地收集光子。

为了收集更多光子，从.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双面胶带	3M		~75 µ微米厚
EMCCD相机	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
超声波清洗机	布拉索斯	2510
荧光滤光片组	Chroma	49016
肌动蛋白聚合缓冲液	细胞骨架	BSA02
生物素标记的G-肌动蛋白	细胞骨架	AB07
G-肌动蛋白	细胞骨架	AKL95
通用肌动蛋白缓冲液	细胞骨架	BSA01
激光快门（带驱动器）	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
盖玻片	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16–0.19 mm 厚
显微镜载玻片	金印载玻片	30103X1	0.93–1.05 毫米厚
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-001
玻璃底培养皿	体外科学	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA 寡核苷酸	Integrated DNA Technologies		5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'生物素
荧光微球	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-链霉亲和素	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 抗体偶联试剂盒	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
光学平台	Newport 公司		RS4000 系列
60倍物镜	尼康	Plan Apo VC 60x WI
100倍物镜	Olympus	PlanApo 100X/1.45 油镜 ∞/0.17
60倍物镜	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
倒置显微镜	Olympus	IX71/IX70/IX81
起源	OriginLab
抗FLAG抗体	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-生物素	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	兔肌酸磷酸激酶
CP	Sigma Aldrich	P1937	磷酸肌酸二(三羟甲基氨基甲烷)盐
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-二硫苏糖醇
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′，N′四乙酸
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
主成分分析	Sigma Aldrich	03930590	原儿茶酸
程序性细胞死亡	Sigma Aldrich	P8279	原儿茶酸-3,4-双加氧酶
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	正硅酸四甲酯
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸
1” 带安装架的直径宽带介质镜	Thorlabs	BB1-E02，KM100	数量：2
½” 直径柱	Thorlabs	TR4	数量 ≥ 6
10倍扩束镜	Thorlabs	BE10M-A
2” 直径 f = 300 mm 带镜座透镜	Thorlabs	LA1256-A，LMR2	TIR透镜
荧光对齐靶标	Thorlabs	VRC2SM1
激光安全护目镜	Thorlabs	LG3
中性密度滤光片	Thorlabs	FW1AND
光束分析仪	Thorlabs	BP209-VIS
后置式虹膜光圈	Thorlabs	ID25	数量：2
剪切干涉仪	Thorlabs	SI100
XYZ 平移台， ½” 旅行	Thorlabs	T12XYZ
激光	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm，30 mW