用于评估近红外荧光成像在乳腺癌手术中潜在应用的组织模拟体模

摘要

近红外荧光（NIRF）成像技术可通过实现术中肿瘤定位及手术切缘状态评估，提高乳腺癌手术的治疗效果。利用含有模拟荧光肿瘤包埋物的组织模拟乳腺 phantom，可对乳腺癌患者中NIRF成像的潜在临床应用进行评估，以实现标准化和培训目的。

摘要

术中肿瘤定位及手术切缘状态评估的不准确会导致乳腺保留手术（BCS）的治疗效果不理想。光学成像，特别是近红外荧光（NIRF）成像，可通过为外科医生提供术前和术中实时肿瘤定位工具，减少BCS术后切缘阳性的发生率。本研究出于标准化和培训目的，采用模拟乳腺组织的体模评估NIRF引导下BCS的潜在应用价值。

使用光学特性与正常乳腺组织相似的乳腺仿体来模拟乳腺保乳手术。在仿体中预设位置嵌入含有荧光染料吲哚菁绿（ICG）的模拟肿瘤包埋物，并用于术前和术中肿瘤定位、实时近红外荧光（NIRF）引导下的肿瘤切除、NIRF引导下的手术范围评估，以及术后对手术切缘的评估。成像过程采用定制的NIRF相机作为临床原型设备。

含有模拟肿瘤包埋物的乳腺仿体为术中肿瘤成像的模拟与评估提供了一种简单、经济且多功能的工具。这种凝胶状仿体具有与人体组织相似的弹性特性，可使用常规外科器械进行切割。此外，仿体中含有血红蛋白和脂肪乳，分别用于模拟光子的吸收和散射特性，从而形成与人体乳腺组织相似的均匀光学特性。近红外荧光（NIRF）成像的主要缺点是光子在组织中传播时穿透深度有限，这限制了采用背向照明策略对深部肿瘤进行（无创）成像的能力。

引言

对于患有 T₁-T₂ 期乳腺癌的患者，保乳手术（BCS）联合放疗是标准治疗方案^1,2。术中对切除范围评估不准确，导致接受保乳手术的患者中有 20% 至 40% 出现切缘阳性，从而需要追加外科手术干预或放疗^3,4,5。尽管广泛切除邻近的正常乳腺组织可能降低切缘阳性的发生率，但这会损害术后美观效果并增加并发症风险^6,7。因此，亟需开发可在术中提供原发肿瘤位置及切除范围反馈的新技术。光学成像，尤其是近红外荧光（NIRF）成像，有望通过为外科医生提供实时的术前和术中肿瘤定位工具，降低保乳手术后切缘阳性的发生率。近期，我组报道了针对卵巢癌患者开展的首项人体试验，证实了肿瘤靶向荧光成像技术可高灵敏度地检出原发肿瘤及腹腔内转移灶的可行性⁸。然而，在开展乳腺癌患者的临床研究之前，已可利用模型系统对多种肿瘤靶向 NIRF 成像技术在保乳手术中的应用可行性进行临床前评估。

以下研究方案描述了近红外荧光（NIRF）成像在含有模拟肿瘤荧光包埋物的组织模拟乳腺模型中的应用⁹。这些模型提供了一种经济且多功能的工具，可用于模拟术前及术中肿瘤定位、实时NIRF引导下的肿瘤切除、手术切缘状态评估以及残余病灶的检测。这些凝胶状模型具有与人体组织相似的弹性特性，可使用常规外科器械进行切割。在模拟手术过程中，外科医生依靠触觉信息（针对可触及的包埋物）以及对手术区域的视觉观察进行操作。此外，应用NIRF成像为外科医生提供有关手术范围的实时术中反馈。

需要强调的是，近红外荧光（NIRF）成像必须使用荧光染料。理想情况下，应选用在近红外光谱范围（650 - 900 nm）内发射光子的荧光染料，以最大限度地减少组织中生理丰度较高的分子（例如，血红蛋白、脂质、弹性蛋白、胶原蛋白和水）对光子的吸收和散射^10,11。此外，组织的自发荧光（即，活细胞中由于生化反应产生的内在荧光活性）在近红外光谱范围内显著降低，从而获得最佳的肿瘤与背景比值¹¹。通过将NIRF染料与靶向肿瘤的分子（例如，单克隆抗体）偶联，可实现荧光染料的靶向递送，用于术中成像应用。

由于人眼对近红外光谱范围内的光不敏感，因此近红外荧光（NIRF）成像需要使用高灵敏度的相机设备。迄今为止，已开发出多种用于术中应用的NIRF成像系统¹²。在本研究中，我们使用了一套自行构建的NIRF成像系统，该系统是与慕尼黑工业大学合作开发，专为术中应用而设计。该系统可同时采集彩色图像和荧光图像。为了提高荧光图像的准确性，系统中实施了针对组织内光强变化的校正方案。Themelis et al.¹³对此提供了详细描述。

方案

1. 制备用于模拟肿瘤包埋物的硅胶模具

1. 收集具有理想形状和尺寸的固体物品，用作模拟肿瘤包埋物的模型， 例如， 珠子或弹珠
2. 彻底清洁肿瘤模型。为便于从硅胶模具中顺利取出，可在肿瘤模型表面喷洒防粘喷雾，或涂覆一层薄薄的凡士林或蜂蜡。
3. 将每个模型放入一个单独的薄壁方形（塑料）盒中，盒内表面应光滑。如有必要，将模型固定在盒子底部以保持其位置。所用盒子应略大于肿瘤模型本身，以避免浪费过多的硅胶。
4. 将所需量的硅胶组分A倒入混合容器中，按10:1的质量比加入硅胶组分B，充分混合两种组分。可选地，可使用真空泵去除硅胶混合物中的气泡。
5. 将硅胶混合物轻轻倒入塑料盒中，以防止混入气泡。硅胶混合物应在45分钟内完成处理，以获得最佳效果。
6. 让硅胶混合物固化至少6小时，然后切割模具并取出肿瘤模型。可选地，可将硅胶模具切成锯齿状，以便其整齐地重新贴合。硅胶在3天后达到最大强度。

2. 配制 Tris 缓冲盐溶液

1. 通过将 6.1 g（50 mM）Tris 和 8.8 g（150 mM）NaCl 加入 800 ml 去离子水中，配制 Tris 缓冲盐水（TBS）溶液。
2. 加入 1.0 g（15 mmol）NaN₃ 以阻断血红蛋白的氧化（步骤 3.3 和 4.4），并抑制细菌生长。注意：NaN₃ 为剧毒物质，与皮肤接触或吞食可能致死。该化合物的毒性与可溶性碱金属氰化物相当，成人致死剂量约为 0.7 g。务必始终遵循制造商提供的安全操作说明。
3. 调节 pH 至 7.4，并用去离子水定容至 1,000 ml。

3. 制备荧光包涵体

1. 将 2 g 琼脂糖加入第 2 步制备的 50 ml TBS 中。与第 4.2 步中的明胶相比，琼脂糖具有更高的熔点，可防止包埋物在熔融明胶中溶解并导致荧光染料泄漏。可选地，可将琼脂糖的添加量调整为 1 g 或 3 g，以分别获得更软或更易触知的肿瘤包埋物。
2. 使用微波炉加热琼脂糖悬浮液，直至达到沸点。充分搅拌，直至琼脂糖完全溶解。
3. 在持续搅拌下，将 1.1 g（17 µmol）血红蛋白和 50 ml TBS 中溶解的 5 ml 20% 脂肪乳加入琼脂糖混合物中，以模拟周围乳腺仿组织（第 4 步）的光学特性。
4. 将 20.0 mg（25.8 µmol）荧光染料吲哚菁绿（indocyanine green）加入 83.8 ml 去离子水中。确保染料完全溶解。
5. 用移液器从此溶液中吸取 5.0 ml 并加入琼脂糖混合物中，以获得最终浓度为 14 µM 的染料。可选地，可根据需要使用 ICG 以外的其他荧光染料，并采用其各自的最佳浓度。
6. 使用注射器将第 1 步制备的硅胶模具用热的琼脂糖混合物轻轻填充（图 1A）。重复此过程，直至所有模具均被填满。
7. 让荧光包埋物在室温下静置约 1 小时，使其完全凝固。用铝箔完全覆盖模具，以避免包埋物暴露于光照下。
8. 凝固后，轻轻打开模具并将包埋物推出（图 1B）。可选地，可用注射器尖端在包埋物表面滴加少量熔融的琼脂糖混合物。在同一位置重复此操作数次，可形成微小的肿瘤突起，以模拟浸润性肿瘤。
9. 用铝箔包裹琼脂糖包埋物，以防光照和脱水，并将其储存在 4 °C 的加湿储存容器中。
   注意：使用低于或高于已知最佳浓度的荧光染料浓度均会导致荧光信号强度降低。当染料浓度超过最佳浓度时，信号强度反而下降，这一看似违反直觉的现象是由于一种称为“淬灭”（quenching）的效应所致。在评估荧光染料在仿组织中的最大穿透深度时，必须使用最佳染料浓度。

4. 制作乳腺仿体

1. 获取一个杯状模具，用于制作所需尺寸和体积的乳腺仿体， 例如，一个玻璃或塑料碗。模具应具有光滑的表面，以防止明胶成型后粘附在模具上。使用体积为500 ml的模具可制备出尺寸足够的乳腺仿体。
2. 要制作体积为 500 ml 的乳腺模型，将 50 g 250 bloom 明胶加入 500 ml TBS（步骤 2）中。加热明胶悬液至 50 °C 持续搅拌。
3. 明胶完全溶解后，让明胶混合液逐渐冷却，并维持在恒定温度 35 °C 使用热水浴。
4. 在持续搅拌下，加入 5.5 g（85 mmol）牛血红蛋白和 25 ml 20% Intralipid，分别模拟组织对光子的吸收和散射。
5. 将杯状模具预冷至 4 °C 至少1小时。接着，将明胶混合物倒入模具中，液面高度应与预设的琼脂糖模拟肿瘤包埋物的深度一致图1C）。将明胶混合物在 4 °C 30分钟至1小时
6. 凝固后，在模体表面放置一个模拟肿瘤的荧光琼脂糖包埋物，并用细针暂时固定。单个乳腺模体中最多可植入三个模拟肿瘤的荧光包埋物。各模拟肿瘤包埋物之间应保留足够的间距（至少5 cm）。图1D).
7. 将剩余的温热明胶混合物倒入模具的剩余空间，确保两层之间充分粘连，避免产生折射伪影。在模具上标记荧光肿瘤模拟嵌入物的位置。让模体在室温下静置过夜固化 4 °C.
8. 凝固后，移除用于暂时固定包埋物的针头，并轻轻将乳腺模体从模具中取出（图1E). 用铝箔包裹乳腺模体以避光并防止脱水，并将其置于加湿的储存容器中保存于 4 °C.

图 1. 制备含荧光仿肿瘤包埋物的乳腺体模的逐步流程。 首先制备所需形状和大小的硅胶模具，然后用注射器将熔化的琼脂糖混合物注入模具中 (A)。本研究中制备了不同大小和形状的仿肿瘤包埋物 (B)。接着，将一层薄薄的熔化明胶混合物倒入定制的涂覆木质乳腺模具中 (C)。待其凝固后，将仿肿瘤包埋物放置于适当位置，临时固定，并覆盖另一层熔化的明胶混合物 (D)。再次凝固后，轻柔地将乳腺体模从模具中取出 (E)。随后，该体模可用于模拟各种近红外荧光成像应用 (F)。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 设置近红外荧光成像系统

1. 用于乳腺癌手术中模拟靶向近红外荧光（NIRF）成像，需要一种适用于术中的NIRF相机系统。目前已有多种可用于实时术中NIRF成像的系统，仅供研究用途。尽管这些设备之间存在一些差异，但均包含激发光源（用于激发荧光标记的肿瘤病灶）以及高灵敏度成像装置，以检测发射的光子。 关键词：近红外荧光成像，术中成像，乳腺癌手术，激发光源，光子检测，NIRF相机系统
2. 确保使用波长足够的激发光源。对于含有ICG的模拟肿瘤包埋物，应使用激发光源（例如，激光器）在750至800 nm范围内发射光子。若使用其他荧光染料，应根据制造商说明书调整激发波长。
3. 如果近红外荧光（NIRF）相机系统配有用于滤除不需要的背景信号的发射滤光片，请确保使用正确的滤光片。对于含有吲哚菁绿（ICG）的模拟肿瘤包埋物，应使用波长范围在800至850 nm之间的发射滤光片。其他荧光染料可能需要根据制造商说明选用不同的发射滤光片。
   注意：确保激发波长与发射波长之间无任何重叠，以防止图像过饱和。此外，可能需要调整图像采集时间以获得最佳荧光图像。对于深部荧光包埋物或微弱荧光信号，可将图像采集时间延长至数秒至数分钟；而对于浅表包埋物或强荧光信号，可将采集时间缩短至数毫秒，以实现实时视频速率的荧光成像。

6. 乳腺癌手术中近红外荧光成像应用的模拟

1. 从容器中取出模拟乳腺组织的仿体，并将其放置在平坦的非荧光表面上。然后，将近红外荧光（NIRF）成像设备置于仿体乳腺上方，留出足够的操作距离，以便切除模拟肿瘤的包埋物。
2. 使用NIRF成像和/或通过触诊仿体乳腺来定位模拟肿瘤的荧光包埋物。如果无法检测到荧光信号，则可能是该包埋物在仿体中位置过深而无法被检测到，或者需要延长图像采集时间。
3. 一旦确定包埋物位置，即在实时NIRF引导下，使用常规外科器械切开仿体乳腺并切除模拟肿瘤的包埋物。或者，也可仅通过肉眼观察和触诊仿体乳腺进行切除，以模拟标准临床操作流程。
4. 在切除模拟肿瘤包埋物后，立即对术腔进行成像，检查是否存在残留荧光信号，以判断切除是否充分。
5. 若发现仍有残留荧光信号，则应在直接NIRF引导下继续切除残余组织，直至无荧光信号残留。
6. 对切除的仿体组织碎片进行成像，以模拟NIRF引导下的宏观切缘状态评估。具体操作为：将仿体组织切成3–5 mm厚的薄片，并对各薄片分别进行成像。若荧光信号延伸至手术切缘，提示存在阳性切缘。

结果

本研究的结果此前已在其他地方报道过⁹。

我们的数据显示，近红外荧光（NIRF）成像可用于检测模拟乳腺组织的体模中荧光肿瘤模拟病灶，从而模拟乳腺癌患者中NIRF引导下的保乳手术。利用我们的体模模型，我们发现术中肿瘤定位、NIRF引导的肿瘤切除、术中对手术腔边缘的评估以及残余病变的检测均具有可行性（图2）。简而言之，共制作了四个乳腺体模，每个体模均包含两个具有不同尺寸和/或形态的荧光病灶（表1）。

使用常规外科手术器械，从第一个和第二个乳腺模型中手术切除荧光模拟肿瘤的包埋物。切除过程通过触诊及对术区的肉眼观察进行引导。要求外科医生对模型乳房进行操作，直至完全切除模拟肿瘤的包埋物。随后，应用定制的荧光相机扫描手术腔，以检测是否存在残留的荧光信号。若发现强残留荧光信号，提示切除不完全，则要求外科医生在实时近红外荧光（NIRF）引导下切除残留的包埋物。在模型#1和#2中，两个模拟肿瘤包埋物中的一个切除不完全，表现为手术腔内存在强残留荧光信号。在首次...

讨论

我们通过使用带有模拟肿瘤包埋物的乳房形状仿体，模拟了近红外荧光（NIRF）引导下的保乳手术（BCS）潜在临床应用。使用自行构建的NIRF相机系统，术中肿瘤定位、NIRF引导的肿瘤切除、手术范围评估以及术后手术切缘评估均被证实可行。对于位于仿体组织深度2 cm或更浅位置的荧光模拟肿瘤包埋物，可实现无创检测。然而在术中，由于保乳手术本身的特性，即外科医生会通过切开覆盖组织将目标组织暴露至更接近表面的位置，因此信号穿透深度有限的问题在很大程度上得以解决。

术中近红外荧光（NIRF）成像具有一些重要优势，包括无电离辐射、技术安全性高以及分辨率高^9,14。此外，该技术可为外科医生提供有关手术范围的实时反馈，并允许将荧光图像与手术区域的彩色图像即时融合，从而更准确地定位荧光信号¹³。

如前所述，近红外荧光（NIRF）成像的一个重要缺点是光学信号在组织中的穿透深度有限，这是由于某些组织成分对光子的吸收和散射所致^10,11。为了匹配正常乳腺组织的光学特性，在我们的仿体中分别添加...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血红蛋白	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	H2500	模拟光子在组织中的吸收
20% Intralipid	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	I141	模拟光子在组织中的散射
硅胶 A 透明 40（双组分加成型聚硅氧烷）	NedForm, Geleen, 荷兰		包装包含组分 A 和 B，应按 1:1 混合（A:B=10:1）。  厂家页面链接：http://tinyurl.com/ncjq7jx
明胶 250 Bloom	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	48724	用于构建乳房形状的仿体
琼脂糖	Hispanagar, Burgos, 西班牙		用于构建模拟肿瘤的包埋物
Tris	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	T1503
HCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	258148
NaCl	Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, 荷兰	S9888
NaN3	Merck, Darmstadt, 德国	822335	警告：剧毒。该化合物的毒性与可溶性碱金属氰化物相当，成人致死剂量约为 0.7 克。
术中应用的近红外荧光（NIRF）成像设备示例：
T2 NIRF 成像平台	SurgVision BV, Heerenveen, 荷兰		本研究中使用的定制 NIRF 成像系统。更多详情请访问 www.surgvision.com
Photodynamic Eye	Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH, Herrsching am Ammersee, 德国	PC6100	www.iht-ltd.com
FLARE 成像系统套件	The FLARE Foundation Inc, Wayland, MA, 美国		www.theflarefoundation.org
Fluobeam	Fluoptics, Grenoble, 法国		www.fluoptics.com
Artemis 手持式相机	Quest Medical Imaging BV, Middenmeer, 荷兰		www.quest-mi.com
术中应用的近红外荧光染料示例：
吲哚菁绿	ICG-PULSION,  Feldkirchen, 德国	PICG0025DE	本研究中使用的临床级 NIRF 成像荧光染料。更多详情请访问 www.pulsion.com
IRDye 800CW NHS 酯	LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, 美国	929-70021	www.licor.com