小鼠胸腺上皮细胞的分离、鉴定与纯化

摘要

本文介绍了一种高效分离、鉴定和纯化小鼠胸腺上皮细胞（TECs）的方法。该方案可用于研究胸腺在正常T细胞发育、胸腺功能障碍以及T细胞重建中的功能。

摘要

胸腺是T淋巴细胞发育的重要器官。在胸腺基质细胞中，胸腺上皮细胞（TECs）在T细胞发育的多个阶段——包括T细胞命运决定、阳性选择和阴性选择——均发挥关键作用。然而，TECs在胸腺中的功能尚未完全阐明。本文提供一种结合机械破碎和酶消化的方法，用于从小鼠新鲜胸腺中分离TEC亚群。该方法可有效解离细胞间连接以及细胞与细胞外基质之间的连接，使胸腺基质细胞与胸腺细胞充分释放，形成单细胞悬液。利用所获得的单细胞悬液，可通过多参数流式细胞术对TECs和树突状细胞进行鉴定与表征。由于TECs在胸腺中属于稀有细胞群体，本文还描述了一种通过去除胸腺中数量最丰富的细胞类型——胸腺细胞——从而有效富集和纯化TECs的方法。经过富集处理后，可缩短细胞分选时间，从而在TEC纯化过程中最大限度减少细胞活力的损失。所获得的高纯度细胞适用于多种下游分析，如实时定量PCR、Western blot及基因表达谱分析。该实验方案将促进TEC功能的研究以及相关领域的发展。 体外 T细胞重建

引言

在T细胞发育早期，由骨髓造血干细胞衍生的多能祖细胞被招募至胸腺皮质，经历T系定向并成为T细胞前体¹。在胸腺皮质中，T细胞前体CD4和CD8双阴性（DN）胸腺细胞扩增并分化为不成熟的CD4和CD8双阳性（DP）胸腺细胞，形成具有高度可变T细胞受体的大群祖细胞¹。只有部分受MHC限制的DP细胞亚群会进一步发育为CD4或CD8单阳性（SP）胸腺细胞，迁移至胸腺髓质，并分化为功能成熟的T细胞，这一过程被称为阳性选择^2-6。相反，自身反应性胸腺细胞克隆则经历阴性选择，通过凋亡被清除，或转化为调节性T细胞以维持自身耐受，或转而分化为上皮内淋巴细胞，后者的作用目前尚不明确^3,7-10。

在胸腺中，胸腺基质细胞形成独特的微环境，为T细胞发育的各个命运提供信号^5,11,12。胸腺基质细胞由胸腺上皮细胞（TECs）——包括皮质区胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质区胸腺上皮细胞（mTECs）、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经嵴来源的周细胞以及其他间充质细胞组成^13-15。其中，TECs在T细胞发育的各个阶段均发挥关键作用^1,2,16,17。然而，由于缺乏高效可靠的TECs分离方法，目前对其功能的全面理解仍受到限制¹⁶。特别是cTECs，它们在皮质区围绕前体细胞形成三维网络结构，对阳性选择至关重要^13,....

方案

本研究使用成年（6 - 8 周龄）雌性 C57Bl/6 小鼠。小鼠购自美国国家癌症研究所，并在特定病原体-free条件下饲养。所有动物实验均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 仪器与缓冲液的准备

1. 制备酶溶液（含0.05% [w/v] Liberase TH和100 U/ml DNase I的RPMI1640培养基）、富含白蛋白的缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白和2 mM乙二胺四乙酸[EDTA]的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）、FACS缓冲液（含1%胎牛血清[FBS]和0.02% NaN₃的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）、FACS分选缓冲液（含2% FBS的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）以及RP10培养基（添加10% FBS的RPMI-1640培养基）。
2. 准备10个铺板用培养皿。配制40 ml包被液（0.01 mg/ml山羊抗大鼠IgG溶于0.1 M NaHCO₃缓冲液中），每块100 × 15 mm培养皿中加入4 ml包被液，轻轻摇晃混匀后于4 °C过夜孵育。弃去抗体溶液，用5 ml 1x PBS清洗培养皿两次，每次清洗之间需剧烈摇晃。将制备好的培养皿储存于4 °C。

结果

按照本方案，从成年小鼠中取出胸腺器官（第2节），并按照第3节所述制备胸腺细胞悬液。所获得的细胞悬液包含胸腺细胞、造血来源的基质细胞以及非造血来源的基质细胞。CD45是一种造血系广谱标记物，表达于胸腺细胞以及巨噬细胞和树突状细胞等造血来源的基质细胞上。相反，胸腺上皮细胞（TECs）并非来源于造血系统，不表达CD45¹⁵。细胞染色与流式细胞分析操作按照第4节所述进行。

两种胸腺上皮细胞（TEC）亚群，即皮质型胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质型胸腺上皮细胞（mTEC），均起源于一种共同的双潜能TEC前体细胞¹⁵。cTEC和mTEC均在其细胞表面表达EpCAM分子²⁸。因此，可通过流式细胞术根据EpCAM阳性且CD45阴性的特征对TEC进行设门分群（图2A）。cTEC与mTEC可通过两种试剂加以区分：识别cTEC表达的谷氨酰氨基肽酶的Ly51抗体，以及可结合mTEC的荆豆凝集素-1（Ulex Europaeus agglutinin-1, UEA-1）²⁸（

讨论

在该方案中，关键步骤包括胸腺基质细胞的制备（第3节）和胸腺上皮细胞（TEC）的富集（第4节）。强烈建议每次均新鲜配制酶溶液，并尽快处理组织。对于合并的胸腺组织，需根据胸腺数量优化酶溶液的使用体积。若处理后仍有组织残留，可增加酶溶液用量并延长孵育时间，以提高细胞得率。在TEC富集过程中，完成上清液的收集并重复第5.3节所述的培养板清洗步骤，可减少细胞损失。

1980年，Wekerle et al. 首次报道了一类胸腺上皮细胞（TECs）——“胸腺哺育细胞”（thymic nurse cells, TNCs）³³，这类细胞是位于皮质的大上皮细胞，能将多个存活的淋巴样细胞完全包裹在细胞内囊泡中。1982年，Kyewski和Kaplan描述了影响TNCs得率的各种分离条件³⁴。最近，Takahama及其同事重新研究了TNCs的分离方法及其特性。他们基于细胞膜通透化后对CD45的优先染色来鉴定此类细胞³⁵。他们还在制备物中观察到一种“破碎的”TNC，由一个皮质胸腺上皮细胞（cTEC）和多个结合的胸腺细胞组成。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	克隆 G8.8
抗小鼠 MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	克隆 M5/114.15.2
抗小鼠 Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	克隆 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
流式细胞仪	BD Biosciences	LSRFortessa
流式细胞分选仪	BD Biosciences	FACSAria
FACS 管	BD Biosciences	352052
流式细胞术分析软件	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX 根据荧光染料不同而变化，YY 根据瓶装规格不同而变化。