小鼠胸腺上皮细胞的分离、鉴定与纯化

摘要

本文介绍了一种高效分离、鉴定和纯化小鼠胸腺上皮细胞（TECs）的方法。该方案可用于研究胸腺在正常T细胞发育、胸腺功能障碍以及T细胞重建中的功能。

摘要

胸腺是T淋巴细胞发育的重要器官。在胸腺基质细胞中，胸腺上皮细胞（TECs）在T细胞发育的多个阶段——包括T细胞命运决定、阳性选择和阴性选择——均发挥关键作用。然而，TECs在胸腺中的功能尚未完全阐明。本文提供一种结合机械破碎和酶消化的方法，用于从小鼠新鲜胸腺中分离TEC亚群。该方法可有效解离细胞间连接以及细胞与细胞外基质之间的连接，使胸腺基质细胞与胸腺细胞充分释放，形成单细胞悬液。利用所获得的单细胞悬液，可通过多参数流式细胞术对TECs和树突状细胞进行鉴定与表征。由于TECs在胸腺中属于稀有细胞群体，本文还描述了一种通过去除胸腺中数量最丰富的细胞类型——胸腺细胞——从而有效富集和纯化TECs的方法。经过富集处理后，可缩短细胞分选时间，从而在TEC纯化过程中最大限度减少细胞活力的损失。所获得的高纯度细胞适用于多种下游分析，如实时定量PCR、Western blot及基因表达谱分析。该实验方案将促进TEC功能的研究以及相关领域的发展。 体外 T细胞重建

引言

在T细胞发育早期，由骨髓造血干细胞衍生的多能祖细胞被招募至胸腺皮质，经历T系定向并成为T细胞前体¹。在胸腺皮质中，T细胞前体CD4和CD8双阴性（DN）胸腺细胞扩增并分化为不成熟的CD4和CD8双阳性（DP）胸腺细胞，形成具有高度可变T细胞受体的大群祖细胞¹。只有部分受MHC限制的DP细胞亚群会进一步发育为CD4或CD8单阳性（SP）胸腺细胞，迁移至胸腺髓质，并分化为功能成熟的T细胞，这一过程被称为阳性选择^2-6。相反，自身反应性胸腺细胞克隆则经历阴性选择，通过凋亡被清除，或转化为调节性T细胞以维持自身耐受，或转而分化为上皮内淋巴细胞，后者的作用目前尚不明确^3,7-10。

在胸腺中，胸腺基质细胞形成独特的微环境，为T细胞发育的各个命运提供信号^5,11,12。胸腺基质细胞由胸腺上皮细胞（TECs）——包括皮质区胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质区胸腺上皮细胞（mTECs）、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经嵴来源的周细胞以及其他间充质细胞组成^13-15。其中，TECs在T细胞发育的各个阶段均发挥关键作用^1,2,16,17。然而，由于缺乏高效可靠的TECs分离方法，目前对其功能的全面理解仍受到限制¹⁶。特别是cTECs，它们在皮质区围绕前体细胞形成三维网络结构，对阳性选择至关重要^13,18,19，但其具体机制尚不明确。早期研究主要依赖形态学和组织学工具，为TECs的异质性及其功能提供了初步线索¹³。近年来，通过小鼠模型中的遗传学方法揭示了不同TEC亚群的独特功能^12,20。建立一种高效且可重复的TECs分离方法，是实现对TEC亚群无偏倚鉴定、对TEC功能进行定性和定量评估，以及阐明cTECs支持阳性选择机制的基础。

由于胸腺上皮细胞（TEC）在胸腺中数量稀少，且在完整器官内形成紧密的相互作用，因此分离TEC一直具有挑战性。本文所述方案基于以往的研究发现、现有试剂、技术以及对胸腺结构和基质组成的认识。近二十年前，已有多种方法被报道用于解离胸腺组织^21-27，其中消化过程中使用了不同的酶，包括胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。Gray et al. 在其研究中比较了这些酶²⁸，并报道了一种改进的方法，即采用多步酶混合消化法²⁹，该方法随后被广泛使用^20,30。然而，该方法准备时间较长，消化步骤复杂，即使在同一小鼠群体中，最终获得的细胞数量和TEC比例也存在较大差异^29,30。数年前，开始使用含有高纯度胶原酶和中性蛋白酶的Liberase研究级酶进行胸腺组织解离³⁰。本文描述了一种基于Liberase消化的方案，并优化了机械分离步骤，可从鼠胸腺组织中获得大量活的TEC。

为了富集解离的基质细胞，以往的研究采用过密度梯度离心法或磁珠分选法^21,29。然而，这两种方法均会导致某些胸腺基质细胞群体严重丢失，尤其是皮质胸腺上皮细胞（cTECs）²⁹。细胞毒性清除和贴壁筛选技术^31,32在免疫学领域已被广泛用于淋巴细胞的去除或分离^12,31。在对这些技术进行比较后，我们建立了目前用于富集胸腺上皮细胞（TECs）的贴壁筛选方案。该富集过程中的温和条件可减少细胞死亡，并实现无偏倚且更高得率的TEC回收。

第3节中所述的分离胸腺细胞悬液可直接用于流式细胞术分析，以鉴定和表征胸腺上皮细胞亚群及树突状细胞。第4节介绍了一种利用多参数流式细胞仪鉴定胸腺上皮细胞亚群的简单且实用的方法。对于需要获得纯化cTEC或mTEC的实验，TEC富集及细胞分选步骤详见第5节和第6节。

方案

本研究使用成年（6 - 8 周龄）雌性 C57Bl/6 小鼠。小鼠购自美国国家癌症研究所，并在特定病原体-free条件下饲养。所有动物实验均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 仪器与缓冲液的准备

1. 制备酶溶液（含0.05% [w/v] Liberase TH和100 U/ml DNase I的RPMI1640培养基）、富含白蛋白的缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白和2 mM乙二胺四乙酸[EDTA]的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）、FACS缓冲液（含1%胎牛血清[FBS]和0.02% NaN₃的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）、FACS分选缓冲液（含2% FBS的1X PBS [无Ca²⁺/Mg²⁺]）以及RP10培养基（添加10% FBS的RPMI-1640培养基）。
2. 准备10个铺板用培养皿。配制40 ml包被液（0.01 mg/ml山羊抗大鼠IgG溶于0.1 M NaHCO₃缓冲液中），每块100 × 15 mm培养皿中加入4 ml包被液，轻轻摇晃混匀后于4 °C过夜孵育。弃去抗体溶液，用5 ml 1x PBS清洗培养皿两次，每次清洗之间需剧烈摇晃。将制备好的培养皿储存于4 °C。

2. 胸腺组织的采集

1. 将小鼠置于 CO₂ 麻醉箱中实施安乐死。将动物仰卧于解剖垫上，用图钉固定四肢，并用 70% 乙醇喷洒湿润毛发。
2. 使用剪刀从尿道口上方开始，沿中线向上至下颌作一纵行皮肤切口，并从该切口向下沿两侧延伸至膝盖处，形成倒“Y”形切口。将两侧松弛的皮肤向旁拉开，并用图钉固定于解剖垫上。
3. 从剑突处穿刺膈肌，沿两侧肋骨剪开至锁骨附近，然后用镊子提起肋骨并固定于解剖垫上。胸腺位于肋骨下方，呈覆盖于心脏表面的两个薄而白色的叶状结构（图 1）。分离胸腺周围的结缔组织，用带齿的弯镊轻轻牵拉，完整取出一对胸腺叶。将胸腺叶放入含有 5 ml RPMI-1640 培养基的 6 孔板中。

3. 胸腺基质细胞的制备

1. 修剪胸腺叶周围的脂肪和结缔组织，并将胸腺叶转移至6孔板的新孔中，每孔含5 ml新鲜配制的酶溶液。  用精细剪刀在胸腺叶上做少量切口，于37 °C孵育20分钟。
2. 使用5 ml移液器将正在消化的胸腺组织轻柔吹打2–3次，以实现组织解离。将上清液收集至含有10 ml冷的富含白蛋白缓冲液的50 ml离心管中，以中和酶活性。  将收集管置于冰上。  向剩余组织中加入2.5 ml酶溶液，于37 °C继续孵育15分钟。
3. 使用3 ml注射器和18 G针头进行轻柔的机械振荡，以打散细胞团块。  将上清液合并至收集管中。  向剩余组织中加入2.5 ml酶溶液，于37 °C孵育15分钟。
4. 使用3 ml注射器和25 G针头重复轻柔的机械振荡操作，并额外孵育5–10分钟。
5. 完成消化后，将全部上清液合并至收集管中。  在4 °C条件下以400 × g离心8分钟，收集细胞。  吸除上清液，将沉淀细胞重悬于10 ml富含白蛋白的缓冲液中，并通过100 mm滤网过滤。使用血细胞计数板进行细胞计数。  随后进行流式细胞术分析（第4节）或胸腺上皮细胞（TECs）富集（第5节）。

4. 通过流式细胞术鉴定胸腺上皮细胞

1. 将细胞用 FACS 缓冲液重悬，调整至最终浓度为每 100 µl 含 4 x 10⁶ 个细胞，置于 96 孔圆底检测板中，并将板置于冰上。向细胞中加入 20 µl Fc 封闭液（含抗 CD16/CD32 抗体，浓度为 10 µg/ml 的 FACS 缓冲液），冰上孵育 10 分钟。以 400 × g、4 °C 离心 3 分钟。将板倒扣于水槽中，弃去孔内液体。
2. 将细胞沉淀用 100 µl 抗体混合液（含抗 CD45、EpCAM、MHC II 类分子、Ly51 抗体以及不同荧光染料标记的 UEA-1 凝集素，各抗体浓度为厂家推荐或经优化验证的最佳浓度，溶于 FACS 缓冲液）重悬，在冰上避光孵育 20 分钟。用于补偿调节时，每种单一荧光染料分别标记 1 x 10⁶ 个细胞。
3. 每孔加入 100 µl FACS 缓冲液，以 400 × g、4 °C 离心 3 分钟。重复洗涤一次，然后将细胞重悬于 100 µl FACS 缓冲液中。将细胞转移至已装有 300 µl FACS 缓冲液的 12 x 15 mm 圆底流式管中。在流式细胞仪上获取样本数据，并使用流式分析软件进行数据分析。TEC 的设门策略见图 2。

5. 通过平皿富集胸腺上皮细胞

1. 将胸腺细胞（按第3节制备）在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。吸弃上清液，并将沉淀细胞重悬于FACS分选缓冲液中，调整细胞浓度为每毫升2 × 10⁸个细胞，置于15 ml或50 ml锥形管中。加入抗CD90.2抗体（克隆30-H12）（或抗CD45抗体），终浓度为每毫升细胞悬液2.5 µg，于4 °C在旋转混合仪上轻柔孵育30分钟。孵育结束后，用5–10倍体积的RP10培养基洗涤，然后在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。
2. 吸弃上清液，将沉淀细胞重悬于RP10培养基中，调整细胞浓度为每毫升1 × 10⁷个细胞。将5 ml细胞悬液加入每个已包被的贴壁培养皿（按步骤1.3制备），轻轻摇晃后于室温孵育30分钟。剧烈摇晃后，将上清液转移至锥形管中。用RP10培养基冲洗培养皿两次，并将冲洗液合并至收集管中。
3. 将收集管在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。吸弃上清液，将沉淀细胞重悬于5 ml RP10培养基中。将细胞悬液加入新的贴壁培养皿中，轻轻摇晃后于室温孵育30分钟。收集上清液，冲洗培养皿，并将所有液体合并至同一锥形管中。待胸腺上皮细胞（TECs）富集后，在400 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃上清，将细胞重悬于5 ml FACS分选缓冲液中。

6. 通过细胞分选纯化胸腺上皮细胞

1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞悬液配制成浓度为 4 x 10⁷ 个细胞的 FACS 分选缓冲液。将第 4.4 节中所述抗体加入细胞悬液中，于 4 °C 在旋转混合仪上轻柔孵育 30 分钟。染色完成后，洗涤细胞并重悬于 FACS 分选缓冲液中，调整细胞浓度至每毫升含 10 x 10⁶ 个细胞。
2. 通过 100 µM 喷嘴使用荧光激活细胞分选技术对胸腺上皮细胞（TEC）亚群进行分选。分选后的细胞收集于含 30% (v/v) 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 培养基中。细胞分选完成后，在 4 °C 以 400 x g 离心 5 分钟，随后进行后续分析的准备工作。

结果

按照本方案，从成年小鼠中取出胸腺器官（第2节），并按照第3节所述制备胸腺细胞悬液。所获得的细胞悬液包含胸腺细胞、造血来源的基质细胞以及非造血来源的基质细胞。CD45是一种造血系广谱标记物，表达于胸腺细胞以及巨噬细胞和树突状细胞等造血来源的基质细胞上。相反，胸腺上皮细胞（TECs）并非来源于造血系统，不表达CD45¹⁵。细胞染色与流式细胞分析操作按照第4节所述进行。

两种胸腺上皮细胞（TEC）亚群，即皮质型胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质型胸腺上皮细胞（mTEC），均起源于一种共同的双潜能TEC前体细胞¹⁵。cTEC和mTEC均在其细胞表面表达EpCAM分子²⁸。因此，可通过流式细胞术根据EpCAM阳性且CD45阴性的特征对TEC进行设门分群（图2A）。cTEC与mTEC可通过两种试剂加以区分：识别cTEC表达的谷氨酰氨基肽酶的Ly51抗体，以及可结合mTEC的荆豆凝集素-1（Ulex Europaeus agglutinin-1, UEA-1）²⁸（

讨论

在该方案中，关键步骤包括胸腺基质细胞的制备（第3节）和胸腺上皮细胞（TEC）的富集（第4节）。强烈建议每次均新鲜配制酶溶液，并尽快处理组织。对于合并的胸腺组织，需根据胸腺数量优化酶溶液的使用体积。若处理后仍有组织残留，可增加酶溶液用量并延长孵育时间，以提高细胞得率。在TEC富集过程中，完成上清液的收集并重复第5.3节所述的培养板清洗步骤，可减少细胞损失。

1980年，Wekerle et al. 首次报道了一类胸腺上皮细胞（TECs）——“胸腺哺育细胞”（thymic nurse cells, TNCs）³³，这类细胞是位于皮质的大上皮细胞，能将多个存活的淋巴样细胞完全包裹在细胞内囊泡中。1982年，Kyewski和Kaplan描述了影响TNCs得率的各种分离条件³⁴。最近，Takahama及其同事重新研究了TNCs的分离方法及其特性。他们基于细胞膜通透化后对CD45的优先染色来鉴定此类细胞³⁵。他们还在制备物中观察到一种“破碎的”TNC，由一个皮质胸腺上皮细胞（cTEC）和多个结合的胸腺细胞组成。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	克隆 G8.8
抗小鼠 MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	克隆 M5/114.15.2
抗小鼠 Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	克隆 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
流式细胞仪	BD Biosciences	LSRFortessa
流式细胞分选仪	BD Biosciences	FACSAria
FACS 管	BD Biosciences	352052
流式细胞术分析软件	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX 根据荧光染料不同而变化，YY 根据瓶装规格不同而变化。